微生物多样性分析精选(九篇)

第1篇：微生物多样性分析范文

关键词：土壤微生物；PCR-DGGE；聚类分析；香浓威尔指数

中图分类号 S15 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）24-65-04

在土壤养分循环的过程中，土壤微生物发挥着积极的作用，是土壤肥力的重要指标[1]，土壤微生物几乎是全部土壤生物化学过程的参与者，不但能提升土壤中有效养分的含量，还为作物生长和产量提供必要的物质保障[2]。由于人们长期对土壤进行农事操作，改变了土壤物理生物化学属性，因此对农田土壤微生物的主要类群和重要功能群的数量影响也愈见强烈，进而可能影响耕地质量保育与生态环境安全[3-4]。大部分土壤微生物对耕作措施很敏感，会表现出不同的反应[5-6]。其多样性对生态系统的稳定性、生产力和应对压力与扰动的恢复力方面有着重要的影响[7]。Al-Kaisi和Liebig等研究都表明，保护性耕作较传统耕作更有利于增加土壤中微生物多样性和生物量且更集中于地表，进而提高土壤系统稳定性。加之长期高强度的农药化肥大量投入使用也极易降低土壤中微生物群落多样性，导致微生物功能丧失，进一步影响土壤质量，使得土壤障碍频发[8-9]。研究结果表明恰当的管理制度能够增加土壤微生物种群数量，进而有利于作物产量的提高，土壤质量也会随之改善[10-11]。Schutter等利用PLFA法对保护性耕作和传统耕作下土壤微生物多样性进行了研究，发现对比传统耕作，保护性耕作更能增加土壤微生物种群数量。

1993 年，Muy zer 等首次将PCR-DGGE（Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis）技术应用于微生物生态的研究，这一技术的出现克服了传统微生物培养技术的限制，由于PCR-DGGE 具有可靠、方便快捷、重现性好等优点，迅速成为微生物群落多样性和动态分析的强有力工具[12]，它利用PCR扩增产物中G+C含量的rDNA组分在电泳凝胶中移动的位置上的差异，不同G+C含量在胶中移动的速度不同，因此产生不同代表微生物群落组成的条谱带。本试验通过测定不同耕作方式下土壤微生物数量以及在分子水平上利用PCR-DGGE技术研究不同耕作方式下的农田管理措施对土壤微生物群落多样性的影响，从理论上阐明适合的耕作方式和农田管理模式，为土壤质量的改善和生产力的提高，提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验区概况 试验在吉林省农田进行，试验地土壤为典型黑土。全省大部分地区年平均气温为2～6℃，全年日照2 200～3 000h，年活动积温平均在2 700～3 200℃，年降水量一般在400～1 300mm。受季风气候影响，吉林省四季降水量以夏季最多，占全年降水量的60%以上，对作物生长十分有利。

1.2 供试土壤与样品采集 本研究选择4种处理：（1）陶家子（TH）：玉米收割后根茬还田，次年旋耕四位一体机进行播种施肥一次性作业；（2）永发乡（YH）：玉米收获后秸秆全部粉碎回田，两年播种前深翻一次后持续免耕；（3）农安（NH）：玉米收割后1/3秸秆粉碎还田，次年深翻；（4）公主岭（AH）：深翻配施有机肥。各处理设置的同时均有农民现行耕作对照。土壤样品采集于2011年10月中旬，供试土壤为中上层黑土，试验采取3点取样法，去除土样杂质、细根，将鲜土保存在4℃冰箱中待测。

1.3 土壤DNA提取与PCR扩增 采用FastDNA SPIN Kit for Soil土壤DNA提取试剂盒。按试剂盒规定的实验步骤进行土壤DNA的提取，所提取的DNA用试剂盒纯化后保存。每个样品3次重复，以341f，758r（生工合成）为引物，在PTC-200PCR仪（Bio-Rad，美国伯乐公司）上进行扩增。PCR反应体系为50μL，包括10×buffer 5μL，10mmold NTP 4μL，10pm正反引物各1μL，taqDNA聚合酶0.4μL，无菌水37.5μL，模板1μL。（大连宝生物公司）。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，65℃（-0.5℃ per cycle）退火1min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，12个循环；72℃延伸10min。

1.4 样品的DGGE分析 用扩增的PCR产物进行DGGE分析，所用仪器为D-Code Universal Detection Mutation system （Bio-Rad，美国伯乐公司），凝胶成像系统（Bio-Rad，美国伯乐公司）。DGGE的凝胶浓度为6%，变性梯度为30%～60%，在60℃，180V条件下电泳6h.电泳胶片用Genefinder荧光染料染色。

1.5 数据处理 试验数据采用Quantity One4.2.3软件，采用非加权成对算术平均法（UPGMA）对所有土壤样品进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同耕作方式对农田耕层土壤微生物多态性的影响 对耕层土壤微生物的PCR扩增产物进行DGGE电泳，分别得到不同地区土壤细菌的DGGE图谱。从图1中能够清晰的看出菌群的整体分布多样性和优势菌的分布和数量。各样品的细菌DGGE图谱的条带数、条带位置和亮度呈现明显的差异。DGGE凝胶电泳能够分离长度相同而序列不同的DNA条带，条带越多说明生物多样性越丰富，条带信号越亮表示对应该条带的细菌数量越多，从而可反映出微生物的数量和种类[13]。不同处理间有很多共有条带，说明处理间微生物群落结构具有很强的相似性，然而这些共有条带粗细强度的差异，说明同一种微生物在不同处理内丰度不同。不同处理间出现的条带的增加或缺失现象，说明不同处理间微生物多样性存在一定的差异。图1显示，3种处理耕作方式TH/YH/NH都较它们的传统方式TS/YL/NL土样条带数量多，亮度强。其中NH/NL组条带数目差异明显，NH较NL条带数量变化最多；TH较YL条带亮度变化最强；TH较TS在数量及亮度上也有变化，但是变化幅度较小。表明不同耕作处理下的农田土壤微生物多样性较农民常规耕作下土壤微生物多样性丰富。

图1 不同耕作方式下耕层土壤细菌DGGE图谱

进一步利用Quantity One4.2.3对DGGE图谱进行数字化处理，通过UPGMA方法进行聚类分析，得到不同耕作下土壤微生物组成的聚类分析系统树。结果如图2所示，图2中处理分为2个族群，NL点处为一个族群，其余TH/YS、YH/TL和NH为另一个族群。说明深翻结合秸秆还田能够改变土壤中微生物组成。说明细菌群落结构类型因耕作方式不同，表现出明显差异。聚类分析系统树显示TH/TS、NH/NL均首先聚类，表明其土壤中微生物种群结构较为接近；YH/YL未首先聚类，说明深翻配施秸秆还田促进土壤微生物种群结构的多样性。

图2 不同耕作处理与传统耕作耕层土壤微生物组成的聚类分析

2.2 不同耕作方式对农田犁底层土壤微生物多态性的影响 应用PCR扩增产物对土壤犁底层微生物进行DGGE电泳分析，分别得到犁底层细菌DGGE图谱条带，如图3显示。同样，从图3中能明显看出，犁底层中TH/YH/NH的条带数量及亮度方面要较TS/YL/NL等传统耕作土壤中微生物数量大，亮度强。

图3 不同耕作方式下犁底层土壤细菌DGGE图谱

图4聚类分析系统树中显示，TH/NH和TS/NL首先聚类，说明四位一体耕作方式和深翻结合1/3秸秆还田对土壤微生物种类结构没有影响；并且NL/TS以及NH/TH的聚类结果显示不同样地同一深度的犁底层土壤微生物具有较高的相似性。

图4 不同耕作方式下犁底层土壤微生物组成的聚类分析

2.3 不同耕作方式对农科院试验田耕层和犁底层土壤微生物多态性的影响 通过Quantity One软件包对农科院试验站的土样进行DGGE图谱分析发现，如图5所示，C点耕层（0～20cm）条带数较传统耕作的耕层A点（0～20cm）条带数多且条带明亮，D点犁底层（20～40cm）条带数较传统耕作B点犁底层（20～40cm）条带数多且条带较亮，说明施入的有机肥能增加土壤中微生物的种类和数量。

注：A=Al（0～20cm）；B=AL（20～40cm）；C=AH（0～20cm）；D=AH（20～40cm）。

图5 不同耕作方式下耕层与犁底层土壤细菌DGGE图谱

从图6的聚类分析系统树看出A、B、D三点首先聚类，而C点未能与其聚类，由此可以说明深翻配施有机肥同样能够促进耕层土壤微生物种群结构的多样性。

图6 不同耕作方式下耕层与犁底层土壤微生物组成的聚类分析

2.4 不同耕作制度下土壤微生物香浓威尔多样性的影响 根据土壤在DGGE图谱上的条带信息，计算出的Shannon-weiner多样性指数，如表1所示。从表1中看出，4种不同耕作处理下的土壤微生物香浓指数都较农民常规耕作下微生物香浓指数高，说明4种耕作方式都能促进土壤微生物种群结构的多样性。这可能是由于4种耕作处理可以为土壤微生物提供相应的养分和适宜的生存环境，促使各类微生物很好的生长，因而微生物多样性指数较高。四位一体耕作方式下土壤微生物的香浓指数增幅最大，耕层和犁底层分别为23.2%和15.5%，

表1 不同耕作与常规耕作耕层土壤与

犁底层土壤香浓威尔多样性指数

[耕作＼&1＼&2＼&3＼&4＼&4种耕作＼&耕作层＼&2.39＼&2.38＼&2.36＼&2.63＼&＼&犁底层＼&2.00＼&2.04＼&2.25＼&2.38＼&常规耕作＼&耕作层＼&1.94＼&2.30＼&2.25＼&2.48＼&＼&犁底层＼&1.70＼&1.92＼&2.01＼&2.29＼&]

3 结论与讨论

黑土土壤中的微生物具有数量大、种类繁多等特性，因此本实验采用了16S rDNA扩增的DGGE方法研究不同耕作制度下土样微生物群落的多样性。通过分析农民常规耕作下农田土壤与不同耕作处理下农田土壤中微生物组成的DGGE图谱，显示了不同样地或同一样地不同深度土层土壤微生物组成的多态性。微生物是农田土壤中的核心组成部分，不但能为作物提供营养元素和最佳的生长环境，还能保持土壤的基本生产力。有研究表明，腐解的秸秆扮演着养分和载体的角色[14]，能够增加有机碳含量进而改善土壤环境，显著降低土壤pH值，增加土壤微生物数量。因此，对于促进作物生长、改善和提高土壤质量具有重要作用[15]，施肥可以增加根系的分泌物，给土壤微生物提供能源物质，进而提高土壤微生物量[16]。从DGGE图谱中看出（图1、图3、图5），耕层土壤微生物组成中TH/YH以及AH的电泳条带都较TS/YL和AL电泳条带数量多，亮度强；对犁底层来讲，同样是不同耕作措施下土壤微生物要较传统耕作下土壤微生物类群丰富，种类繁多。这说明了增施有机肥或秸秆还田都能明显增加土壤微生物类群和数量。这与施用有机肥可以维持较高的土壤微生物活性，保持微生物多样性与生态稳定性相一致[17]。秸秆还田可以为微生物的生长活动提供必要的能源和营养物质，加快刺激土壤中微生物的活性，从而加快土壤中微生物的自身物质合成，并利用外源养分进行新陈代谢[18]；有结果表明农民常规耕作模式下土壤微生物的DGGE条带数明显少于适宜的耕作模式处理，说明农民常规耕作降低了土壤细菌群落的多样性[19]。利用Quantity One4.2.3软件对土壤DGGE图谱进行的聚类分析显示，无论是传统耕作还是不同耕作制下同一地区不同深度土壤的微生物组成具有多态性。

就Shannon-Weiner指数而言，不同耕作下的土壤耕层香浓指数都较农民常规耕作下耕层香浓指数高，这是由于秸秆还田可以直接为土壤微生物提供充足的有效养分，改善土壤微生物栖息环境[14]，提高了耕层土壤生态环境的缓冲能力。而犁底层可能是由于养分运输的限制，微生物不能得到充足的营养和适宜的生存环境，所以在类群功能和数量上不能像表层微生物那样丰富。通过对比不同耕作措施下的微生物香浓指数，发现陶家子耕作方式下土壤微生物多样性变化最高，耕层和犁底层增幅分别为23.2%和15.5%。推测其可能原因是根茬还田补充输入了有机碳源又改善了土壤物理性状，有利于维持土壤微生物的多样性及活性[20]，另外旋耕增强了土壤的通气能力，同时也使土壤的孔隙度增加，因此微生物的活动能力也相应的增强。

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第2篇：微生物多样性分析范文

关键词：固相微萃取；分配系数

1 固相微萃取

固相微萃取(solid-phase microextraction,spme)是一项新型的无溶剂化样品前处理技术。固相微萃取以特定的固体（一般为纤维状萃取材料）作为固相提取器将其浸入样品溶液或顶空提取，然后直接进行gc、hplc等 分析 。spme由pawliszyn在1989年首次报道，近10年来固相微萃取技术已成功应用于气体，液体及固体样品的前处理。

1.1 固相微萃取技术及原理

固相微萃取法是以固相萃取为基础 发展 起来的 方法 ，固相微萃取利用了固相萃取吸附的几何效应，其装置结构的超微化决定了它能避开经典固相萃取的许多弱点。固相微萃取技术多在一根纤细的熔融石英纤维表面涂布一层聚合物并将其作为萃取介质(萃取头)，再将萃取头直接浸入样品溶液(直接浸没－固相微萃取方法，简称di－spme)或采用顶空－固相微萃取方法(hs－spme)采样。由于聚合物涂层的种类很多，因而可对样品组分进行选择性富集和采集。固相微萃取的原理是一个基于待测物质在样品及萃取涂层中分配平衡的萃取过程。

固相微萃取利用表面未涂渍或涂渍吸附剂的熔融石英纤维或其它纤维材料作为固定相，当涂渍纤维暴露于样品时，根据“相似相溶”原理，水中或溶液中的有机物以及挥发性物质，从试样基质中扩散吸附在萃取纤维上逐渐浓缩富集。萃取时，被测物的分布受其在样品基质和萃取介质中的分配平衡所控制，被萃取量(n)与其他因素的关系可以用下式描述：

n=kvfc0vs/（kvf+ vs）

式中：k为被测物在基质和涂层间的分配系数，vf和vs分别为涂层和样品的体积，c0为被测物在样品中的浓度。如果样品体积很大时(vs>>kvf)上式可以简化成：

n=kvf c0

萃取的被测物量与样品的体积无关，而与其浓度呈线性关系，因而从分析结果中得到的萃取纤维表面的吸附量，就能算出被萃取物在样品中的含量，可方便地进行定量分析。

1.2 固相微萃取操作条件的选择

萃取头的构成应由萃取组分的分配系数、极性、沸点等参数来确定，在同一个样品中，因萃取头的不同可使其中一个组分得到最佳萃取而使其他组分受到抑制。平衡时间往往由众多因素所决定，如分配系数、物质扩散速度、样品基质等。此外，温度、离子浓度、样品的搅拌效率和ph值等因素都可影响萃取效率。

1.3 影响固相微萃取萃取率的因素

1.3.1 萃取头的种类及膜厚

固相微萃取的核心部分－萃取头材料特性或涂层的种类和厚度对灵敏度的影响最为关键，因此，对其选择要十分慎重。

目前，世界上已有七种商品萃取头问世，固定相可分为非键合型、键合型、部分交联型以及交联型四种。非键合型固定相对于某些水溶性有机溶剂是稳定的，但是当使用非极性有机溶剂时会引起轻度溶胀现象。对于键合型固定相，除了某些非极性溶剂以外，对所有的有机溶剂均很稳定。部分交联型固定相在大多数水溶性有机溶剂和某些非极性有机溶剂中很稳定。高度交联固定相类似于部分交联固定相，只不过在同一交联中心产生了多个交联键。

最常用的也是最早使用的高分子涂层材料为聚二甲基硅氧烷(pdms)和聚甲基丙烯酸甲酯(pa)。其中，100μm的pdms适用于分析低沸点、低极性物质，7μm的pdms适用于分析中沸点及高沸点物质，pa适用于分析强极性物质。以后，又陆续出现了聚酰亚胺、聚乙二醇等涂层材料。混合固定相应用也较广泛，如聚乙二醇——膜板树脂，聚乙二醇——二乙烯基苯，聚二甲基硅氧烷——模板树脂以及环糊精等。为了开发聚合物的导电性质，一些 科学 家还尝试用聚砒咯涂层来萃取极性甚至离子型待测物。此外，还开发了纤维双液相涂层，它可以克服单一液相涂层萃取有机化合物范围狭窄的缺点，萃取范围更广，是目前 研究 和发展的趋势和方向。萃取头涂层越厚，对待测物吸附量越大，可降低最低检出限。但涂层越厚，所需平衡萃取时间越长，使分析速度减慢。因此，应综合考虑各种情况。

1.3.2 萃取时间

萃取时间即萃取达到平衡所需的时间由待分析物的分配系数、物质的扩散速率、样品基质、样品体积、萃取头膜厚等因素决定。一般萃取过程均在刚开始时吸附量迅速增加，出现一转折点后上升就很缓慢。因此，可根据实际操作目的对灵敏度的需求不同，适当缩短萃取时间。

1.3.3 搅拌和加热

在萃取过程中对样品进行搅拌和加热有助于样品均一化，缩短平衡时间。对顶空固相微萃取(hs－spme)加热可提高液面上易挥发有机化合物的浓度，而提高萃取效率。

1.3.4 无机盐

向样品中加入(nh4) 2so4，na2so4，nacl和k2co3等无机盐可降低有机化合物与基质的亲和力而提高萃取效率。

1.3.5 ph缓冲溶液

萃取酸性或碱性物质时，通过调节样品的ph值可改善组分的亲脂性，从而大大提高萃取效率。

1.4 固相微萃取操作模式

根据被分析样品的物理性质和状态，进行固相微萃取时可以采取不同的操作方式，常见的操作方式有如下三种。

1.4.1 固相微萃取直接法

将固相微萃取的纤维头直接浸入水相或暴露于气体中进行萃取的方法称为spme直接法，对于气体样品或较干净的水样，能在1min内迅速达到萃取平衡，因而常使用直接固相微萃取模式。

1.4.2 顶空固相微萃取法

把萃取头置于待分析物样品的上部空间进行萃取的方法叫做固相微萃取顶空法。这种方法只适于被分析物容易逸出样品进入上部空间的挥发性分析物，对黏度大的废水、体液、泥浆或固体样品，则只能采用上空取样的顶空固相微萃取模式，萃取从基质中释放到样品上空的化合物。

1.4.3 衍生化固相微萃取法

通过衍生化作用来降低极性化合物的极性后进行固相微萃取的方法叫做衍生化固相微萃取法，极性化合物通过在其水溶液基质中加入衍生剂或将纤维涂层浸入适当的衍生化试剂被衍生后进行萃取，衍生化后极性分析物极性降低，萃取后更适于色谱分析。

1.5 固相微萃取与其它分析方法相结合

固相微萃取萃取待测物可与气相色谱(gc)、液相色谱(lc)等分析分离技术联用进行分离。使用的检测器可以是质谱(ms)、氢火焰离子化检测器(fid)、火焰光度检测器(epd)、 电子 捕获检测器(ecd)、原子发射光谱检测器(aed)、紫外光谱(uv)、红外光谱(ir)以及离子淌度谱仪等。

1.6 固相微萃取的应用

1.6.1 固相微萃取在有机金属形态分析中的应用

样品预处理对于得到准确而又重现性好的分析结果非常重要。在进行形态分析时，为保证样品中各种形态在样品预处理过程中不发生变化，一般需要采用较为温和的消化或浸提的方法将待测有机金属化合物释放到液相中，常用的有酸／碱(常用hc1)浸提、微波或超声波辅助消化、co2超临界流体萃取等技术，浸提法简便但结果的准确性难以考证，后几种方法需要借助于其它仪器，操作不便，费用较高。固相微萃取用于样品中金属及有机金属形态分析是最近几年才开始，其应用具有很大的潜力。

将spme用于有机金属的 分析 最早是由cai y等人于1994年在第十六届国际毛细管色谱大会上提出的，将spme用于鱼体和水样中汞及水体中的有机锡的萃取，降低了测定的检测限，但精密度差，rsd在24.1～68.8之间。1995年报导了汞及甲基汞中加人四乙基硼化钠衍生，而后由spme萃取，gc－ms进行测定的 方法 。从此，spme用于各种有机金属的萃取方法逐渐建立。

tutschku等 研究 了环境样品中有机锡和有机铅的萃取方法，tadeusz gorecki和janusz pawliszyn用spme－gc测定了水中四乙基铅及无机物。dumemann等人将spme用于烷基铅、汞、锡的分离，样品被消化和分解后加入四乙基硼化钠衍生(ph值在4～5)以提高分析物的挥发性，10min后室温下将spme萃取头放在样品的上部空间。mester和pawlisyzn将spme萃取头直接浸入样品溶液，对尿液中的一甲基肿和二甲基肿进行了分析。

1.6.2 在天然产物分析中的 应用 

对于分析中草药及中药材中的挥发性成分来说，spme是一种很有用的方法。在中药分析方面，马长华等人使用固相微萃取技术测定中药石菖蒲中挥发性成分并鉴定出16种化合物。运用hs－spme－gc－ms方法可从新鲜的紫苏中鉴定出20多种挥发性成分。刘百战等使用hs－spme－gc－ms方法分离栀子鲜花头香成分，并鉴定了54种化学成分。miller等测定了肉桂中的香豆素、醋酸桂皮酯、石竹烯、2－甲氧桂皮醛等成分，以此来确定肉桂类植物的植物学起源及鉴别。winkle等人使用技术分析了人工麝香的水溶液。使用spme技术可从冷杉叶中提取挥发性成分，以及蛇麻草中的各种挥发性成分。schafer等人应用hs－spme分析了针叶松叶中的蒎烯、樟烯、月桂烯等单萜类成分。应用hs－spme法可萃取脱氧麻黄碱及其主要代谢产物苯异丙胺，方法快速、灵敏、准确，可避免常用测定方法所遇到的干扰。pdms纤维可从中药丸中顶空萃取出17种萜类化合物。

在天然香料分析方面，刘扬岷等用spme－gc－ms分析白兰花的香气成分，分离了114个色谱峰并鉴定了其中的75个成分。an等人使用hs－spme－gc－ms方法从新鲜的熏衣草中分离测定了香气成分。jan等人从青霉菌和尼日尔黑霉菌的表面测定到了经过生物转化的柠檬醛、香叶醇和橙花醇。

spme技术可以用于从食品中提取分析组分。spme技术可检测曲奇饼上薄荷油的含量，薄荷油中基本的成分是薄荷醇，前处理简单而干扰较少。garcl等人对葡萄酒中的酒香组分进行了分析，建立了固相微萃取(spme)和甲基硅烷化结合新的样品预处理方法，并应用气相色谱——质谱联用技术对葡萄酒中极性有机物进行了分析，对其中的白藜芦醇苷进行了定量分析，方法简单快速，灵敏度高。hmenryk等人用hs－spme技术(用pa作液相)与静态顶空法(shs)对比研究啤酒的香味物质发现，对于低浓度的香味化合物，二种方法都具有较高的可重复性，与啤酒香味的分析结果也高度相关。1996年coleman用spme提取mailard反应产物中的香味成分，检测灵敏度可达ng/l级水平。clark等采用hs－spme技术分析了烤烟、白肋烟、马里兰烟的顶空挥发物。衍生化法是用于分析极性较强的半挥发、不挥发有机物。lin等人进行了衍生化spme－gc联用萃取水样中的脂肪酸，待测物为乙酸、丙酸、辛酸等11种脂肪酸，衍生试剂为芘基重氮甲烷。实验结果为衍生化spme对含较长碳链的(c6～c10)脂肪酸检测限为pg/l级，对含较短链的(c2～c4)的脂肪酸在ng/l级。如果在涂层上完成衍生化反应，则检测限还可以进一步降低。

1.6.3 在医学中的应用

随着spme与其他分析仪器或分析方法联用技术的不断 发展 和成熟，spme正逐步在医药学分析领域得到广泛的应用。

（1）基础医学中的应用。

随着固相微萃取技术的广泛应用，必将会对生理、病理、毒 理学 等基础医学的研究和发展起着较大的推动作用，如应用spme检测人体体液中抗组胺类化合物以及细菌代谢产物等。ralf eiscrt等采用管内自动spme－hplc联用与强极性萃取涂层和手性涂层分别对多种维生素和手性药物进行了分析。lillian等对人体尿液、血液和乳汁中的单环芳香胺(monocycle aromatic amines)及芳香胺(aromaticamine)的代谢产物进行了研究，认为这些检材可以用作生物监测指标。这必将在预防医学特别是职业病防治方面发挥重要作用。

（2）在临床医学中的应用。

随着spme与其他分析仪器或分析方法联用技术的不断发展和成熟，spme正逐步在医药学分析领域得到广泛的应用。

（3）在法医学中的应用。

由于法医毒(药)物分析所用检材的特殊性和复杂性，自1993年美国supelco公司推出商品化的spme装置后，spme就很快应用到毒物分析中。christoph grote等就曾用spme－gc－ms通过测定呼出气体中乙醇含量而可以换算出血液中乙醇含量10min内便可以完成。如果将spme－gc便携仪用于酒后驾车肇事现场检测，必将给 交通 事故的处理带来极大的方便。 目前 ,spme已成功的分析了血液、尿液、脏器组织等生物检材中的毒鼠强、氰化物、有机磷农药、乙醇、麻醉剂等。watanabe等人应用顶空——固相微萃取——气相色谱——质谱联用的方法(hs－spme－gc－ms)分析血液中的5种麻醉剂，该方法已成功地应用到法医学鉴定中。

1.6.4 spme在环境分析中的应用

在应用研究领域，大量学者将spme技术应用于各个分析领域，对大量的待测物质进行了分析测定，得到了令人满意的分析结果。其中又以其在环境分析中的应用最多，主要有：

在气态样品的分析方面：研究者对空气中的btex类化合物，甲醛，胺类物质，石油烃化合物等进行了分析研究。而gorlo danuta等人通过利用spme－gc－ms方法对几种有机污染物的分析，建立了一种评估室内空气质量的方法。

在液态样品的分析方面：主要用于分析水中的有机氯化台物，btex类化合物，脂肪酸及脂肪酸盐，15种甘油醚，氯苯类化合物，杀虫剂，环境水样中的有机磷农药和除草剂等。我国的李攻科等人利用spme－gc－ms联用检测了赤潮海水中的有机物，研究了其种类和含量的变化 规律 。陈文锐等人用spme技术代替传统的进样技术，对污染棕桐油中的低浓度二甲苯进行了测定。此外，对水中和沉积物中的有机金属化合物的分析也有大量报道。

在固态样品的分析方面：土壤样品中的氯代苯，对三嗪在沉积物中的吸附系数的测定，固体样中的卤代苯，卤代酚，污泥及沉积物中脂肪酸与洗涤剂组分，纺织品及皮革品中的禁用偶氨染料的测定。

参考 文献 

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［12］schafer b.,hennig,j. high resolut chromatogr,1995,l8:587.

第3篇：微生物多样性分析范文

【关键词】微生物检验；质量管理

临床微生物检验全面的质量管理包括：分析前质量管理、分析中质量管理、分析后质量管理。平时我们说质量控制，大多数临床医师甚至实验室工作人员都会认为这是实验室的事，也就是只注重了分析中的质量控制。有学者对发生在不同阶段的误差率进行了统计，发现由于分析前因素导致的误差率占总误差率的46.0%-68.2%，由于分析中产生的误差率在占总误差的15%以下，由分析后原因导致的误差率占总误差的18.5%-47.0%[1]。据本人统计，2012年我院微生物检验由于分析前因素造成的误差率高达65%。由此可见，分析前因素是目前全面质量管理中最薄弱的环节。因此，加强对分析前质量管理对微生物检验结果的准确可靠，提高医疗质量是非常重要的。

分析前质量管理，从临床医师开检验申请单，至样本送到微生物实验室，检验程序正式启动时终止。关于微生物分析前质量管理，我要从两方面进行阐述：

1微生物实验室外分析前质量管理

造成分析前误差的原因有：临床医护人员对微生物检验的认识不足、分析前涉及的人员多、影响因素复杂、质量缺陷隐蔽、责任很难确定等，都不是检验人员完全可控制的，需要临床医护人员甚至患者的参与和配合。为了保证微生物检验结果能真实客观的反映患者当前的病情所采取的必要的措施：

1.1检验项目的正确选择也就是临床医师要根据患者病情正确的开出检验申请单，实验室能正确的解读并执行。

1.1.1申请单的填写①病人信息：姓名、性别、年龄、科别、床号、住院号等。②申请单上医师签名。③检验项目。④标本种类⑤开单时间，采样时间，日期。⑥临床诊断。⑦其他为保证检验结果准确和及时报告的相关信息。检验项目的选择要有针对性，不做过多无用的检查，比如肺部感染的患者有25%-50%可能发生菌血症，应在痰培养的同时作血培养。

1.1.2申请单及样本的运输，标本运送人员应根据申请单上检验项目的要求在规定的时间内送到微生物实验室。

1.2病人的准备、标本的正确采集、及时送检与保存病人准备，即病人在采样之前的准备。比如：痰培养需清晨漱口3次后的第一口痰，尿培养需清晨清洁中断尿。样本的正确采集，要重视可控制下的环节：

1.2.1采样时间宜选择阳性率高的时间段采集，例如：血培养：①宜在发热开始时②抗生素使用之前③如果已经使用了抗生素，又必须采集时，选择在下次用药之前④应采集双侧双瓶送检，至少要双瓶送检，因为单瓶报阳并不能判断其是感染菌还是污染菌。血培养先采需氧瓶，后采厌氧瓶。

1.2.2无菌操作血培养护士要严格无菌操作，因为即使按要求严格无菌操作，仍有10%左右的污染率。及时送检与保存，微生物标本要求采集样本后及时送到实验室，比如：脑脊液标本要求15-30分钟送到微生物实验室，亦可将脑脊液注入儿童瓶增菌培养，提高检出率。脑脊液培养建议同时送血培养。血培养不能及时送检，应该放室温保存，而不能放冰箱保存。

2微生物实验室内的分析前质量管理

分析前实验室应采取以下措施：

2.1要求实验室内工作人员较强的责任心，一定的专业技能，同时具有良好的职业道德[2]。人定期进行业务培训与交流，切实加强实验室工作人员的业务水平。制定实验室手册，各种规章制度，对实验室各种仪器设备进行监测，实验室需要使用的实验器材、试剂准备充足。

2.2在院内开展样本采集、运送的学术讲座，对临床医师、护士、患者关于样本的正确采集进行指导和培训。同时制定《样本采集手册》发放到临床。这样有利于实验室和临床的沟通，提高实验室的知名度，引起临床对分析前质量管理的重视。

2.3微生物实验室严格执行样本接收制度。微生物工作人员应仔细核对患者姓名、科别、床号是否与申请单一致，检验项目，标本类别是否填写清楚，盛装的容器是否合符规定，是否规定时间内送到实验室。确保微生物实验室收到的是合格的样本，一份合格的样本对检验结果的准确性是至关重要的。对于样本来源比较困难的情况下，例如：脑脊液样本、胸腹水样本、婴幼儿及ICU的病人，可以适当放宽条件，作为让步标本处理，要做好登记，报告时在备注栏加以说明。对于不合格标本，要坚决拒收。拒收标本包括：①样本无标签。②送检延误。③使用容器不当或有渗漏。④样本不符合要求。⑤一天之内收到同一患者多份样本检测相同项目，除非样本性状发生改变。拒收标本要做好记录，拒收原因、注明科室。

通过以上各项措施，各实验室和临床医护人员要重视和加强分析前质量管理，严格按要求执行，提高微生物样本的合格率，为微生物检验结果的准确性提供有力的保证，更好的服务于临床，为实现全面的质量管理而努力。

参考文献

第4篇：微生物多样性分析范文

长期大量施用化肥、农药,导致土壤板结,易缺氧,土壤酶活性及微生物多样性降低。近年来,上海都市农业生产发展迅速,尤其是蔬菜生产,在实际生产中,大部分菜农为了片面追求高产而忽视品质,大量使用化肥,特别是氮肥的过量施用现象非常普遍。然而,近年来国家统计数据显示,我国农业资源消耗,包括化肥、农药等的用量增长速率与农业增产量不呈正比,并导致品质下降[14]。相关研究调查显示,这些化肥的利用率仅为35%左右,其余未被利用的大部分都变成了污染源,造成水体、空气和土壤污染等环境问题[58]。为了解决农作物高产与化肥过量施用而引起环境污染之间这一突出矛盾,农业部都市农业(南方)开放重点实验室开展了长期的农田污染源头控制与过程治理的研究工作,并且创新开发出了一种农用功能微生物菌剂。本试验以该微生物菌剂为试验材料,应用于叶菜类菠菜,探讨化肥减量化技术对菠菜营养吸收利用的影响,研究微生物菌剂对菠菜的促生效应,并应用PCR-DGGE(变性凝胶梯度电泳)等现代分子生物学的手段[89],研究化肥减量与微生物菌剂配施处理方式对土壤微生物种群多样性的影响,旨在为从源头控制农业面源污染,保护水源地生态健康,减少化肥用量,推广环保节能的农用混合微生物菌剂提供理论基础和试验参考。

1材料与方法

1.1供试材料与试验设计

供试菠菜品种为河北佳禾种子公司提供的大叶菠菜;供试菌剂由河北省科学院微生物研究所提供的硅酸盐菌剂和上海交通大学农业部都市农业(南方)重点开放实验室分离纯化培养的自生固氮菌液,二者进行混合培养而形成的混合菌液。该混合菌液具有溶磷、解钾及固氮等功能,主要菌株为Paenibacillusmucilaginosus和Bacillussubtilis,有效活菌数大于2×108cfu•mL1。选用直径30cm、高30cm的花盆。试验前每处理每盆等量施用30.55g有机肥,有机肥的有机质含量≥400g•kg1,N、P、K含量≥80g•kg1,含N43.6g•kg1,含水率27.55%,pH7.85,Cd含量7.23mg•kg1,Pb含量78.24mg•kg1,Cr含量116.43mg•kg1,As含量54.23mg•kg1。有机肥与土壤拌匀。本试验共设6个不同处理,每处理设3个重复(见表1)。菠菜定植密度为7株•盆1。试验所用氮肥为尿素,磷肥为过磷酸钙,钾肥为硫酸钾以及上海雨霖牌生物有机肥料。第1季菠菜从2010年11月20日播种开始,到2011年1月24日收割结束;第2季从2011年3月8日到2011年5月5日。供试土壤采自上海交通大学农业与生物学院试验田,土壤类型为褐壤土,试验前土壤理化性质背景指标测定如下:土壤全氮、有效磷、速效钾、有机质含量分别为1.117g•kg1、0.212mg•kg1、125.00mg•kg1、12.40g•kg1,电导率(Ec值)为1.84mS•cm1,pH为7.25。试验期间人工浇水,根据菠菜不同生长期的需要,每1~5d浇水1次。

1.2菠菜测定分析

在第1季菠菜六叶期(2010年12月20日14:00)和营养生长后期(2011年1月24日14:00),每盆随机抽取3株,挑选每株新长出的成熟叶片,使用SPAD-502仪测定叶绿素含量SPAD1和SPAD2。2011年1月14日下午,用OSI-FL叶绿素荧光仪、经暗适应30min后,测定菠菜叶片叶绿素荧光参数,每处理9次重复。2011年1月24日,菠菜收割当天,用紫外分光光度法测定菠菜可食部分硝酸盐含量,每样品3次重复。电子天平计量菠菜收割产量,每盆单独收割测产;菠菜N、P、K含量由上海交通大学分析测试中心测定,其中N使用Elementer公司元素分析仪(EAI)测定,P、K使用离子光谱仪(ICP)分析测定,每个样品3次重复。

1.3土壤样品采集与处理

试验期间,分别在菠菜六叶期(2010年12月20日)和营养生长后期(2011年1月24日)两次采集土样。使用不锈钢取土器采集0~15cm土层,部分土壤放于20℃冰箱冷冻保存,另一部分土壤样品风干后研磨,分别过2mm筛和0.45mm筛,塑料袋封装保存,待测。

1.4土壤微生物分析

1.4.1土壤总DNA的提取、16SrDNAV3区片段PCR扩增

每个样品取0.5g土样提取DNA,本试验采用Omega公司生产的soilDNAKit提取土壤微生物基因组DNA,按试剂盒使用说明的操作步骤进行。将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板。采用微生物16SrDNA基因V3区具有特异性的引物对F341GC和R517,其序列分别为:（略）。GC夹(下划线)的目的是为了防止在DGGE过程中,引物的完全分离的扩增。反应体系为50μL,PCR反应采用降落PCR策略,即:预变性条件为96℃5min,前20个循环为94℃1min,65~55℃1min和72℃3min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃),后10个循环为94℃1min,55℃1min和72℃3min,最后在72℃下延伸7min。PCR反应的产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2DGGE和染色

采用DcodeTM突变检测系统(CBS)对16SrDNAV3区扩增产物进行DGGE分析。使用梯度胶制备装置,变性剂浓度从30%到60%(100%的变性剂为7mol•L1的尿素和40%的去离子甲酰胺),聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%;在150V的电压下,上样量为18μL。其运行条件为:0.5×TAE电泳缓冲液,60℃电泳条件下,150V,10h。电泳完毕后,再用去离子水漂洗,固定15min,染色15min,显色10min。在图像处理过程中,对于在DGGE电泳图上是肉眼可见、但被软件忽略掉的一些小条带进行了手动处理,条带的密度由该软件自动算出。

1.4.3指纹图谱的处理与分析

基于PCR-DGGE的基本原理,所扩增的DGGE条带的数量可代表群落DNA序列的丰富度(S),群落DNA序列的多样性可采用Shannon-Weaver指数及其均匀度指数来表示,Shannon-Weaver指数及其均匀度指数计算公式为:（略）。

1.5数据统计分析

采用Excel2003及SPSS13.0进行数据处理及统计分析,用单因素方差分析及邓肯检验(DMRT)对数据进行显著性差异分析。采用Bio-rad公司Quantityone软件的UPGAMA程序进行微生物群落的聚类分析。

2结果与分析

2.1菌剂处理对菠菜生长特性和产量的影响

2.1.1对菠菜营养状态的影响

通过对菠菜叶片叶绿素含量进行测定结果显示(表2),不同施肥处理间差异明显。各处理相比,就两次测定的叶绿素含量的变化,T2、T3、T4、T5处理增幅较大,其中T1增加24.2%,而T5则达到45.6%。最后测定各处理的叶绿素含量差异为:T5>T4>T2>T3>T1>>CK。结果说明,化肥对叶绿素合成量的影响在菠菜生长前期影响更为明显,且常规化肥处理(T1)为最大;而在生长后期,随着微生物菌剂在环境中的定植与适应,在土壤中繁殖量显著提高,活性显著增强,对菠菜的作用逐渐显现,相反,化肥的作用却呈下降趋势,从而导致最终化肥减量20%和40%的处理比完全用化肥的叶绿素含量要高。可见,化肥作为速效性肥料对菠菜生长影响较快,作用时间较短,成本较高;而菌剂与化肥的混施,不但更能提高叶绿素含量,且作用时间长,成本也更低。Fv/Fm指标反映菠菜叶绿素荧光动力学参数,是叶片光合系统II原初光能转换效率,即可变荧光产量与最大荧光产量之比。测定结果显示,相比对照处理,使用菌剂的T2、T3、T4和T5处理的Fv/Fm都有所提高,其中T3达到0.797,比对照提高0.012,处理间差异显著。由此可见,菌剂处理的菠菜在营养生长中的光能转化能力优于不施肥CK。添加微生物菌剂的处理与纯粹使用化肥的T1处理差异不显著。菠菜对化肥及土壤中N、P、K等养分的吸收直接表现为各元素在植株体内的含量。由表2可知,在收割期,各处理间菠菜N含量存在显著差异。以T2和T3最高,T5和T4次之,CK处理最低,且T2处理较CK处理的增幅为100%。由此可见,菌剂处理后,固氮菌提高了植株N含量,也就是提高了N吸收,减少了N损失。菠菜收割后植株P、K含量以T1处理为最低,分别约为35.3g•kg1和56.5g•kg1,且明显低于CK的45.8g•kg1和69.9g•kg1,表明在生长后期,T1处理的菠菜对P、K的吸收较少,土壤中有效磷和速效钾含量低。相比T1处理,T2和T5处理反而有所提高,表明硅酸盐菌的溶磷、解钾作用促进了菠菜对P的吸收利用量,使菠菜P含量较纯化肥处理的T1要高。微生物菌剂的两种菌各自发挥了其主要功能,固氮菌保持了较低氮肥使用条件下的高N含量,硅酸盐菌确保了较低磷肥和钾肥使用条件下的高P、K含量。

2.1.2对菠菜硝酸盐含量的影响

收割后将菠菜全株(包括根、茎、叶)捣碎后测定硝酸盐含量。由表3可知,与不施肥(CK)处理相比,施肥处理对菠菜硝酸盐含量影响较大,使硝酸盐含量显著增加。其中,T1处理的硝酸盐增量最为明显,达到5866.52mg•kg1,T2最小,为4358.23mg•kg1,T3、T4和T5处理在4677.55~5078.25mg•kg1之间。由此可见,T2、T3、T4、T5处理与T1处理相比,硝酸盐含量明显降低。因此,菌剂的配合施用与纯施化肥相比,可以提高菠菜品质,有利于生产有机健康蔬菜。

2.1.3对菠菜产量的影响

根系是植物从土壤获取养分的必要器官,但作为可食用的菠菜,根系重量在菠菜收割期所占总生物量的比重越高(即根生物量比重越高),其可食用部分就相对减少,产量就相对降低。表3表明,固氮溶磷解钾菌剂配合施用后,与不施肥对照相比,根生物量比重有明显降低,由4.36%下降到3.02%,降低约30%,比化肥T1处理的3.54%也有降低。由此说明,功能菌剂的配施不仅促进了菠菜根系的生长,而且提高了养分及光合产物的有机分配,从而提高了菠菜可食部分的生物量比重,提高了菠菜产量,有效提高了菠菜的经济效益。本试验包括两季菠菜,产量计算为两季的总产量。其中,第1季为2010年冬季菠菜,第2季为2011春季菠菜。试验表明,菠菜产量受所施用肥料的影响较大,施肥对菠菜产量提高效果明显。由表3可知,不同处理间每盆菠菜的平均产量差异显著。与CK处理相比,T4处理的产量增加最大,每盆平均产量达到277.73g,产量增加170%;T3、T2、T5和T1处理的增产量依次减少,平均每盆产量分别为267.53g、264.38g、241.62g和220.13g。其中,化肥减量施用的T2、T3、T4和T5处理产量均比常规化肥用量T1处理产量高,达到了化肥减量而不减产甚至增产的效果。由此可见,菌剂可以替代部分化肥,减少农业化肥用量。

2.2菌剂处理对菠菜土壤微生物多样性的影响

2.2.1土壤微生物DGGE指纹图谱分析

对不同处理菠菜栽培土壤微生物16SrDNAV3可变区片断进行DGGE指纹图谱分析的结果(图1a)表明,不同施肥处理下盆栽菠菜土壤的微生物基因区系条带出现较小差别。与CK相比,各处理除T1外,条带亮度略有增加,条带数量无明显差别。从图1b16SrDNAV3区PCR扩增片段DGGE泳道图谱可以看出,多数的明显条带在迁移率上基本一致,说明不同处理间具有大量的共有微生物种群,这主要是存在于试验土壤中的土著微生物。微生物菌剂处理的明亮条带明显在图谱中部多出现1~2个条带,表明混合微生物菌剂与化肥的配施,提高了土壤主要微生物种群基因多样性和数量。由于试验在低温的冬春季进行,土壤微生物本身活性也较低,生长繁殖速率较慢,因而不同施肥制度对微生物种群与数量的影响反映不够明显。

2.2.2土壤微生物DGGE条带图谱的聚类分析

不同施肥处理间的土壤微生物种群相似性表现为DGGE条带聚类分析的相似性系数,相似性系数越高,种群多样性越趋于一致,如图2所示。本试验中,T4和T5处理间的土壤微生物种群相似性最高,达到0.80,被聚为一类,与T1处理的相似性系数为0.76,同时与CK都聚在一个大类;而T2和T3处理又被单独聚在一类,相似性系数为0.70;两个大类间最低相似性系数也达到0.65。一般认为相似值高于0.60的两个群体具有较好的相似性,将6个样品归为一类的相似值达0.65,说明种植1茬菠菜后,不同施肥制度的土壤细菌群落结构相似性程度提高。

2.2.3土壤微生物种群DNA多样性分析

对不同处理土壤的微生物16SrDNA的DGGE条带进行香农威尔多样性指数(Shannon-Wiernerindex)分析,结果见表4。从表4可以看出,丰富度指数以T1处理最低,T3处理最高,与不施肥处理CK相比,常规化肥处理T1的土壤细菌丰富度指数有所降低,而添加微生物菌剂的则有所提高;而Shannon-Wierner指数在各处理间差异较为明显,与不施肥处理CK相比,常规化肥处理T1的土壤细菌多样性有所降低,而添加微生物菌剂的各处理却有明显提高。该结果表明,常规化肥处理不利于提高土壤微生物种群多样性;相反,在化肥减量情况下,配施有益的微生物菌剂,有利于改善土壤中主要微生物种群结构,提高微生物种群多样性。

3讨论与结论

第5篇：微生物多样性分析范文

原位生态修复技术是利用沉水植物在养殖塘中的控藻增氧效应，对养殖塘中氮、磷等营养物质的吸收同化作用，并应用鱼、草、蟹、虾、贝等构建水域生态系统，完善食物链网，同时提供天然饲料和水生动物栖息地，改善养殖塘环境；结合异位生态处理塘、养殖工艺特点进一步削减养殖污水排放，同时从水产养殖健康生态系统角度分析，发挥水域生态系统功能，形成生态化健康养殖模式［1－2］。而浮游细菌是水生态系统的分解者和小型滤食性动物的饵料，在湖泊生态系统的物质循环和能量流动中具有重要的作用，水质的优劣、水体生态状况的改变都会对细菌群落的组成产生影响［3］。此外，水产养殖系统内细菌在物质循环、病害发生与否及水产养殖对象的生长、营养和免疫方面都产生重要作用，与水产养殖系统有关的微生物群落结构研究也有报道，但对于系统微生物状况的持续变化以及养殖菌剂对微生物系统影响的报道不多［4－7］。随着分子生物学方法的发展，以基因检测为基础的微生物检测方法在群落结构的动态监测中具有快速、便捷的优点，变性梯度凝胶电泳（DGGE）是目前应用较为广泛的微生物群落结构分子生物学检验方法之一。笔者除了采用传统法研究微生物数量变化之外，还采用DGGE技术对在养殖区内微生物群落结构的变化开展了较深入的研究，旨在为陆域养殖系统的生物修复提供理论基础。 1材料与方法 1．1材料 实验基地位于江苏无锡市郊胡埭镇龙延村直湖港岸边。由于水产养殖主要收获季节在6—10月，于2009年和2010年的6月、8月、10月3个月在无锡直湖港陆域水产养殖区内采集水样，养殖区包括进水口、蟹塘1号、蟹塘2号、蟹苗塘、鱼塘1号、鱼塘2号、鱼苗塘及甲鱼塘8个点（图1）。 1．2方法 1．2．1环境细菌的检测和样品总DNA的提取 采用平板培养法测定异养细菌数量，用0．2m的聚碳酸酯膜过滤200mL水样富集水中的细菌，采用申能博采的“环境样品DNA提取试剂盒”进行水样细菌总DNA的提取，具体操作方法参见说明书。 1．2．2PCR－DGGE扩增 根据参考文献［10］，采用上海英骏公司合成的引物序列P338fGC：5’－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG－3’和518r：5’－ATTACCGCGGCTGCTGG－3’，用于扩增细菌16SrDNA的V3区段，片段长度为236bp。扩增总体系为50μL：模板DNA40～80ng；10mmol／L4×dNTPs1．5μL，5U／μLTaq酶1μL，20pmol／μL引物各1．5μL，10×扩增缓冲液（含Mg2＋）5μL，ddH2O补足至50μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃1min，55℃退火30s，72℃3min，35个循环；72℃延伸10min。反应产物直接用于变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。 1．2．3PCR－DGGE凝胶电泳及结果处理 DGGE凝胶电泳∶所用胶浓度为8％（丙烯酰胺∶双丙烯酰胺＝37．5∶1，体积比），细菌page胶变性梯度55％～70％，真核生物变性梯度30％～50％，用1×TAE作为电泳缓冲液。每孔上样量50μL。在60℃，150V电泳300min后溴化乙锭染色，紫外凝胶成像观察。通过QuantityOne软件将DGGE图谱照片转化成数字信号，运用MSVP软件对DGGE指纹图谱的多样性和相似性数据进行计算，用SPSS软件进行主成份分析（PCA分析）。多样性和相似性的计算方法分别采用香侬威纳（Shannon－Wie－ner）多样性指数和索伦森相似性系数（Sorensen’sCoefficient）表示。 2结果与分析 2．1细菌数量变化 从异样细菌变化情况（图2）可知，养殖区内的异样细菌数量变化波动较大，特别是2个鱼塘的细菌数量波动可达10倍以上。从图3也可看出，采用综合治理技术的蟹塘1号及蟹塘2号的微生物数量明显下降，分别从2009年的6500个／mL及11000个／mL下降到2010年的1500个／mL和2000个／mL，水质净化效果明显，证明综合治理技术确有效果。在其他养殖塘内，鱼塘的细菌数量一直较高，最高17000个／mL，两年的平均值也都在10000个／mL上下波动，这可能与养殖密度较高有关，相对鱼苗塘和甲鱼塘细菌数量变化较小，平均值都在5000个／mL左右。统计数据亦表明，2010年的微生物数量总体低于2009年同期，这可能与养殖方式的改进以及太湖整体水质变好有关。 2．2水样细菌的16SrDNA多态性 采用DGGE分析PCR产物，均得到若干分离的条带（图4）。每个月的电泳图谱条带一直在变化，而且每个图谱中共有条带并不多见，因此，在不同的养殖系统内，微生物的变化非常明显，很难找到共有的微生物的存在。尽管8个养殖池水是相通的，但每个池内的小生态系统对微生物的影响较大，导致这一变化的出现。 2．3细菌的Shannon－Wiener多样性指数 由图5可见，8个样点的香农威纳指数都在2．0以上，多样性较好，进水、蟹塘以及鱼塘2号的多样性指数变化稍大，可能与生态系统不太稳定有关，而鱼苗塘、甲鱼塘的多样性指数较为稳定，联系微生物数量来看，这2个塘的生态系统较为稳定，可能与两塘受到的外界干扰较少有关。从图6可见，2010年的微生物多样性普遍高于2009年，这也表明，2010年微生态系统情况好于2009年，也从另一个方面说明水质有变好的趋势。#p#分页标题#e# 2．4相似性分析 由图7可见，太湖水进入到养殖区后，水体中的微生物结构发生了明显变化，2009年与2010年进水和养殖区的微生物相似性最低，其中，2009年进水的相似性仅为20％。而从具体的养殖区域分析，微生物的相似性受年份的影响比受到养殖系统的影响更大，同一年的样品相似性比同一个养殖区不同年份的样品相似性更高。说明，在一个系统中，环境因子对微生物的影响可能比生态因子对微生物群落结构的影响更大。 3小结 通过对2009年和2010年收获季节的养殖水体微生物的比较可明显看出，采用原位生态修复和异位湿地处理集成的生态修复技术处理后，异样细菌的数量明显下降，养蟹池塘从原来的微生物中污染状态转为轻污染状态，系统中微生物的多样性也有明显上升，因此，整个生态修复措施对于维持养殖区的生态化运行具有良好的意义。此外，2010年的系统微生物状况要普遍好于2009年，也与生态化养殖的改进有一定关系。从微生物的相似性分析上看，每个不同的养殖区域有各自的微生物系统，而且每年的微生物种类和数量变化很大，很少出现水质净化万能菌种。因此，改善养殖环境的水质条件，形成良好的养殖生态系统，由此加强对土著微生物的培育，，对水质的净化具有重要意义。

第6篇：微生物多样性分析范文

【关键词】DGGE；微生态；纯培养

1.DGGE技术的原理

变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据小片段DNA分子（1kb以下）的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA分子。DN段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢[4]。当DN段处在变性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分融化，达到一定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳图谱中成楼梯式排列。通过对比熔解状态下DN段的多态性，就可以推测有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。

为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区―GC夹（GC clamp）；GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的连续GC碱基，这样在PCR产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%[4]。

2.DGGE技术在微生物生态学中的应用

自然界中85%～99.9%的微生物是不可纯培养的[5]，并且微生物的形态具有难观测性和可变性，在传统的实验方法下不能提供足够的微生物学信息，这严重阻碍了对自然环境中微生物构成及特征的客观认识。PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的一个最主要的应用就是分析微生物群落构成，Muyzer 等人于1993年首次将DGGE技术应用于微生物膜系统和生物菌苔的群落多样性分析。此后，该技术被广泛应用于各种微生物生态系统的检测，绝大部分研究都是通过扩增原核生物 16S rDNA 基因来研究各生态系统中的古细菌或细菌的群落多样性[6]，或者用真菌的通用引物扩增18SrDNA 基因，从而研究真菌的群落多样性，另外除了通过rDNA基因来分析微生物群落结构组成外，还可以通过扩增功能性基因来研究功能基因及功能菌群的差异。

Lam等利用DGGE技术对真菌18SrDNA的序列进行分析，研究Magnolia liliifera叶片中真菌的多样性，结果在叶片的不同部位得到通过培养和形态学研究未能得到的14株不同菌株[7]。Eeva等对挪威红杉残枝样本直接进行DNA提取，利用DGGE分析通过FR1和NS1引物对扩增的1650 bp rDN段，结果得到了46株木材腐烂真菌，为真菌群体中难培养的菌株的检测提供了新的方法[8]。Zhou等对藏灵菇发酵液里的真菌和细菌的DNA进行提取后，扩增细菌16SrRNA和真菌28SrRNA上的相应片段，之后用DGGE进行分析得到11株优势菌株，并且在不同样本之间细菌存在78～84%的相似度，酵母存在80-92%的相似度[9]。

PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的另一个重要应用是检测微生物的动态变化。宋亚娜等运用16SrDNA和18S rDNA特异性引物对，将土壤中提取的总DNA进行PCR扩增后，通过DGGE技术对PCR产物进行分析，研究不同间作和轮作种植体系对作物根际真菌和细菌菌落结构的影响，结果表明，间作明显改变玉米的根际细菌、真菌的菌落结构[10]。Takada利用PCR-DGGE研究化学熏蒸后对散土和菠菜根部土壤中真菌群落的变化，结果表明，三氯硝基甲熏蒸两个月后，在散土和菠菜根部土壤中真菌的多样性都减少，并且一年后真菌的多样性并没有完全恢复到原来的水平，但是菠菜根部土壤中真菌减少量比散土中要少，1，3-二氯丙烯处理两个月后，真菌的多样性只发生微小的改变，并且六个月后就与对照组没有显著差异了[11]。

PCR-DGGE技术还可用于发现新的微生物菌株。Santegoeds等通过DGGE分析细菌16SrRNA上的基因片段来检测多次富集培养的菌藻系，得到了14条独特的16SrRNA基因序列，其中有10个细菌株的基因是以前利用纯培养手段及单纯的分子技术方法均没有发现的[12]。

3.DGGE技术的局限性及改进方法

DGGE 技术作为一种分子生物学手段在研究微生物群落的动态行为和复杂性方面发挥着重要的作用，是目前被普遍接受的的分子生物学工具，但是作为一种分子水平上的技术，除了具有多数分子技术所固有的缺点之外（如PCR产物偏差等），本身也有一定的应用局限性。

首先，利用DGGE分离的PCR产物一般要求DNA长度在200～ 700bp范围内[1]，超出该范围DGGE的分辨率会下降，然而这些序列只能提供有限的系统发育信息，不利于判断微生物所属的系统类群。其次，DGGE通常显示的是微生物群落中的优势种群，Muyzer研究发现该技术只能对菌体数量大于总菌量1%的菌群进行分析[1]。再次，每种菌可能含有数目不等的rRNA基因[13]，则可能会导致群落中菌株数量被过多的估计从而夸大群落差异性和多态性。另外，如果选用的条件不是特别适宜就不能保证将每类DN段完全分开，这样序列不同的DN段迁移到凝胶的同一位置，导致同一条带中含有不同种类的细菌[14]。

对于DGGE存在的这些缺限我们可以通过各种手段加以改善，例如可以优化电泳及PCR的条件从而减少误差，并且在进行DGGE之前通过软件来分析检测PCR过程中形成的嵌合体，另外，可以与其他技术方法相结合，如纯培养、直接形态观察、原位杂交、核酸探针检测技术等，这样不仅更客观的从多方面反映环境中微生物的多样性信息，还可以与其他方法相互补充，从而不断提高分子微生物生态学的研究水平。DGGE技术与传统方法或其它分子生物技术的结合进一步促进了人们对微生物生态的认识；随着分子生物学技术的快速发展，DGGE技术将会得到不断的补充和完善，必将在微生物生态研究中发挥更大的作用。

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第7篇：微生物多样性分析范文

关键词：顶空分析；顶空固相微萃取法；膜萃取技术

中图分类号：O657.7文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)10-0047-04

Headspace Analysis Technology and Application

GUO Wei, WANG Shao-yun

(Institute of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China)

Abstract：The classification and application of modern headspace analysis are reviewed. Headspace gas chromatography (HS-GC), which is an important method designed for the analysis of volatile components with trace quantity in samples, is developing fast. HS-GC is a technology with wide application prospect.

Key words：headspace analysis; headspace solid-phase microextraction; membrane extraction technology

顶空气相色谱法（HS-GC）、通过对样品基质上方的气体成分进行气相色谱分析来测定这些组分在原样品中的含量，是一种重要的分离分析方法。现代顶空分析法已经有了较完善的分析体系，分为静态顶空分析法（static headspace analysis）、动态顶空分析法或吹扫捕集分析法（dynamic headspace analysis or purge and trap analysis）和顶空固相微萃取提取法（headspace solid phase micro extraction analysis）。HS-GC法采用气体直接进样方式，无需有机溶剂提取，大量消除了基体的干扰，对色谱柱污染小，得到的谱图简单，在痕量挥发性组分的分析研究领域中发挥着重要的作用。随着现代仪器的不断发展，操作简单快捷的新型顶空进样器被开发出来并得到广泛应用；一些新技术的应用，如固相微萃取、膜萃取、顶空溶剂微萃取等，在样品分析前实现了在线萃取与富集，克服了顶空分析检测灵敏度低的不足。顶空气相色谱法在环境、医药、天然产物、生物等领域将有新的应用前景。

1 现代顶空分析方法

1.1静态顶空分析

静态顶空气相色谱是将适量样品密封在留有充分空间的容器中，在一定温度下放置一段时间使气液（或气固）两相达到平衡，取容器上方的气体进行GC分析。按达到气液（或气固）平衡的次数可分为一次顶空进样法和多次顶空进样法。按仪器模式可分为顶空气体直接进样模式、平衡加压采样模式和加压定容采样进样模式[1]。基于静态顶空的分离特点，它具有适用性广和易清洗的优点，主要缺点是灵敏度低，有时必须大体积进样，导致峰宽较大，分离度达不到要求。但如果样品中待测组分的含量不是很低，较少的气体进样量就可满足分析需要时，静态顶空仍是一种非常简便有效的分析方法。由于气液体积比，样品基体成分，平衡温度与时间等因素影响分析的准确性与重现性，定量分析时须保持操作条件一致。

静态顶空主要用于分析沸点在200 ℃以下的组分，以及较难进行前处理的样品，对于不易挥发的物质宜先进行化学衍生化。静态顶空普遍用于分析天然产物、食品、生物样品、烟草中的有机挥发物。Bolanda等[2]用静态顶空分析法测定果胶和动物胶中草莓味化合物的气/胶分配系数。 Chalier等[3]用静态和动态顶空研究了全部甘露糖蛋白和分离后的甘露糖蛋白中4种芳香化合物之间的相互作用。

1.2动态顶空分析

动态顶空气相色谱是在未达到气液平衡状况下进行多次取样，直至样品的挥发性组分完全萃取出来为止，因此又称气相连续萃取。常用的方法是向样品中不断通入惰性气体（气体萃取剂），挥发性成分即随萃取气体从样品溢出，然后由吸附装置（捕集器）收集，解吸后进入GC仪分析，这种动态顶空GC通常称为吹扫-捕集顶空气相。动态顶空分析根据捕集模式可以分为吸附剂捕集模式和冷阱捕集模式[1]。动态顶空不仅适用于复杂基质中挥发性较高的组分，对较难挥发及浓度较低的组分也同样有效，一般用于测定沸点低于200 ℃，溶解度小于2%的挥发性或半挥发性有机物。由于气体的吹扫破坏了密闭容器中的两相平衡，在液相顶部挥发组分分压趋于零，能使更多的挥发性组分逸出，与静态顶空和顶空固相微萃取相比，动态顶空分析有更高的灵敏度。

动态顶空分析可用于研究食用油中相似的挥发性组分[4]，牛奶中的萜类化合物[5]，芳香化合物的结构与味觉的关系[6]，土壤中有机挥发物的测定[7]等。Juteau等[8]用静态顶空和动态顶空两种方法对影响香味释放的因素进行了研究，测定了动力学和热动学参数，结果表明，动态分析可更好地模拟体内对味觉的感知过程，静态分析则在参数测定方面准确度更高。

1.3顶空固相微萃取法

1993年首次提出顶空固相微萃取法，发展迅速且日趋成熟。由于该技术集提取、净化、浓缩、进样为一体，以无溶剂污染、方便、快速等优势在许多领域得到广泛应用。

固相微萃取是基于气固吸附和液固吸附平衡的原理，利用待测物对活性固体表面有一定的吸附亲和力而达到分离富集的目的。固相微萃取装置类似色谱进样器，由手柄和萃取头构成。在一根熔融的石英纤维表面涂渍各种不同的色谱固定相或吸附材料构成萃取头，其基本功能表现为提取浓缩和色谱进样[9]，前者实际上是组分在复杂基质中的分离过程。顶空固相微萃取与气相色谱联用后，样品分析过程如下：顶空固相微萃取纤维头置于待测物样品的上部空间，将分析物萃取出，在GC的气化室中，温度上升时，分析物对纤维的亲和力下降而被释放，气化室较小的体积能够保证解吸下来的分析物由载气迅速转入色谱柱。一般解吸时间为2 min。影响解吸时间的因素有气化室的温度、载气流速等。通常气化室的温度设定在可保持纤维涂层稳定的最大温度，解吸温度越高，分析物的滞留时间越短。目前，与顶固相微萃取联用的检测器多为质谱（MS）和氢火焰检测器（FID）。该方法适用于挥发性特别强的样品，由于样品处理为顶空萃取，可以减少复杂基质的干扰。这项技术现已自动化，并可用于分析浓度低于十亿分之一的样品。

近年，研究人员应用顶空固相微萃取法解决了环境、医药、食品、天然产物分析中的诸多问题。

1.3.1 在环境中的应用顶空固相微萃取技术可用于测定水中苯系物（BTEX）的LOD值 [10]，测定水及沉积物中的有机锡 [11]、四乙基铅、有机汞、氯乙醚、二甲基次砷酸等的含量。

1.3.2在医药中的应用顶空固相微萃取技术可从毛发中提取用于止痛的化合物 [12,13]。Camarasu等[14]利用顶空固相微萃取法测定药物中的有机溶剂残留，灵敏性好，准确度高，RSD在2％～3％之间。与静态顶空技术相比，在有机挥发物的测定方面表现了更好的保留行为。

1.3.3在天然产物中的应用顶空固相微萃取技术可用于分析不同种类蜂的有毒挥发性组分 [15]，松果体韧皮部的挥发性组分 [16]。Wajs等[17]利用顶空固相微萃取技术测定了松木中的有机挥发物，提取了100多种挥发性和半挥发性有机物。结果表明，此法的提取效率高于动态顶空分析法。

1.3.4 在食品中的应用顶空固相微萃取技术在食品中可用于研究葡萄汁及葡萄酒中3-烷基-2-甲氧沙林的含量[18]，乳酪中的挥发性化合物[19]，白酒中的挥发性组分[20]。有人用顶空固相微萃取技术分析啤酒中12种醇和酯，确定了聚丙烯酸酯萃取头的固相微萃取分析参数，并与静态顶空方法相比较。顶空固相微萃取技术的检测限一般都低于静态顶空方法，两种方法都有很好的重复性及线性，所得结果高度相关，表明了在分析啤酒中高级醇和酯时以廉价的顶空固相微萃取技术取代自动静态顶空方法的可能性[21]。

2 新顶空技术及其应用

随着静态、动态、顶空固相微萃取技术的日趋成熟，一些新技术逐渐得到研究者的重视。新技术主要包括膜萃取技术和顶空溶剂微萃取技术，以下主要介绍顶空膜萃取技术。

2.1顶空膜萃取技术的分类

膜萃取（membrane extraction）是用膜将目标分析物从样品溶液（给体）萃取到萃取剂（受体）中。处理样品时，应使系统到达平衡时间，将目标分析物充分地从给体转移到受体上。膜萃取可与反相-液相色谱（RP-HPLC）、GC和毛细管电泳（CE）等在线联用。与顶空技术联用时，称为顶空膜萃取技术。以下主要介绍5种顶空膜系统：薄层顶空（the thin-film head-space，THFS）、气体发生器（a bubble sparger）、平板微孔聚四氟乙烯膜（a flat microporous polytetrafluoroethylene membrane）、中空纤维微孔聚丙烯膜（a hollow fiber microporous polypropylene membrane）和中空二甲硅膜（a hollow silicone membrane）。

2.1.1薄层顶空[22]样品沿管向下流动，洗脱气与样品的流动方向相反，两者只是发生物理性接触，挥发性的有机化合物从水相扩散到气相。

2.1.2气体发生器气体发生器的原理与TFHS相似，也是在两相直接接触时，有机挥发物从水相转移到气相。这一萃取系统被认为是两相萃取系统，其萃取效率主要取决于有机挥发物在水相和气相的分配系数。但是易产生气泡，尤其是流体中有表面活性剂存在时。

2.1.3板式微孔膜板式微孔膜系统采用微孔聚四氟乙烯膜，将有机挥发物从水相转移到洗脱气。整个膜装置有两层不锈钢板组成，中间隔一层聚四氟乙烯膜（孔径为0.2μm），接触面积大约50 cm2。易挥发的有机物处于膜的一侧，通过膜孔扩散进入洗脱气。

2.1.4中空纤维膜中空纤维膜装置是一个管状结构（一般为长20 cm，内径12.7 cm的不锈钢管），其中常填30目微孔聚丙烯中空纤维（孔径0.2μm，内径400μm），通常样品流入纤维孔，洗脱气在孔外逆流而上，以使挥发性有机物最大限度地从样品进入洗脱气。这一装置与前面所述的装置相比，更易插入进样。但若用于在线分析，对过滤的要求比较高。中空纤维膜系统与平面膜系统相比，由于膜孔径小，液体流动的剪切力增加，过滤时不易产生浓差极化，提高了过滤效果。

2.1.5中空二甲硅膜样品从容器的底部流入，顶部流出（搅拌器用于混匀样品溶液），洗脱气在二甲硅管内自上而下进行洗脱。整个探针装置由一个1.83 m的中空二甲硅管（内径0.3 mm，外径0.64 mm）嵌入线性棒的凹槽（保护内管免受磨损）中组成。被分析的物质先溶于二甲硅，然后通过二甲硅膜孔气化进入洗脱气。

2.2顶空膜萃取技术的应用

膜萃取技术与顶空联用，主要应用于环境及工艺流程监测。Kaykhaii等[23]利用GC-MS和顶空膜萃取技术结合连续测定不同温度时聚丙烯腈聚合物中热降解产物，该系统简单、快速，可靠性强，集提取、浓缩、测定为一体，可测定挥发性和半挥发性的降解产物。Ciucanu 等[24]开发了一种户外便携的装置，基于吸附剂界面的膜萃取原理，用于连续测定空气质量。Ojala等[25]将膜萃取与动态顶空联用分析土壤解析的有机挥发物，其检测限范围取决于土壤类型，线性关系良好（相关系数大于0.990），因此，该方法适合测定土壤中的有机挥发物。Kou等[26]将膜萃取与气相色谱联用，将液体样品以气体形式直接进样，大大减少了界面层的形成，总体扩散系数增加了7倍，消除了渗透过程中产生的拖尾现象，并且快速，易于操作。Luo等 [27]利用带有吸附剂的膜萃取装置（Cap-MESI）进行液体样品的在线处理，具有可水下检测的优势。样品的磁力搅拌和顶空气体的循环可加速物质的相间分配系数，提高萃取率。用于水上检测时，线性关系好，检测限低，精确度高。研究表明，Cap-MESI是一种有效的用于野外顶空检测有机挥发物的装置。

3小结

随着分析仪器的发展和分析技术的提高，顶空气相色谱的应用越来越广泛。静态顶空分析是一种方便简单的样品制备和导入方法；动态顶空的检测限低，最低可达静态顶空检测限的0.1%，可用于分析痕量挥发性物质；顶空固相微萃取技术提供了最为简单快捷的进样方法。一些新技术比如顶空膜萃取作为可在线提取的分析方法，由于简单、环保和有高速、灵敏等特点越来越受到分析者的青睐。GC-MS技术的实现和不断优化，使顶空气相色谱有了更广阔的发展前景。顶空气相色谱可快速测定复杂基质中的有机挥发物，并将在挥发物成分的分析中发挥重要的作用。

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第8篇：微生物多样性分析范文

关键词:宏基因组;不可培养微生物;筛选系统

中图分类号:Q75 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-06-0044-3

0 引言

Woese和Pace基于16S rRNA或DNA基因序列分析的先锋研究工作给微生物生态学领域带来了革命性的变化。在此之前,人们完全没有意识到真实存在于自然界和在实验室能培养的微生物数量之间重大的差别。伴随着克隆和测序技术的发展,细菌通用引物对环境中生物群落总DNA的直接PCR扩增,产生了大量的数据并重新定义了原核生物的多样性。近年来一些学者对微生态学和宏基因组进行了研究。以下是近几年报道的关于不可培养的大多数微生物的新的见解和技术。

1 宏基因组的研究

1.1 DNA的分离

环境样品DNA的质量直接关系到宏基因组分析的质量。Tiedjie等发展了从不同类型的土壤中直接分离DNA 的方法,但是这些方法仍然不能确定在所有的具有代表性的高度复杂的生物群落中能够获取全部的总DNA。尽管Coutois等人发现,从土壤中直接提取DNA和先从土壤分离细胞再从中提取DNA所得到的细菌多样性范围并无重大差别,但是Luna等人证实,在检测海水沉淀物时,只用单一的DNA提取方法严重低估了细菌多样性。不同的方法适用不同的环境。比如,Fortin等人发现,在细胞裂解前冲洗被碳氢化合物和重金属严重污染的土壤和海水沉淀能改善DNA的质量。

选择一种DNA提取方法用于宏基因组分析需要分析样品的信息。在预测一个生态环境中不同的微生物群落成员的潜在功能的时候,分辨DNA来自样品来自可培养的微生物还是来自死细胞是很有价值的。Nocker和Camper表明,用ethidium monoazide(EMA)的衍生物分析成熟的生物膜16S rRNA基因指纹图谱,提取处理过的样品和未经处理的样品的DNA有重大的区别。对环境中的活体,很有必要区分DNA来自胞内还是胞外。水沉淀中包含了大量来自胞外的DNA,Corinaldesi等人改进了一种允许同时提取胞内和胞外DNA的方法,这些DNA可能对细菌的新陈代谢起着重要的作用。

1.2 系统发生和宏基因组的分析

DNA提取方法的改进、测序手段的进步和测序成本的降低使我们能够解决以下问题:在一个群落中不连续的单元里共生多少种类的细菌以及环境中是什么因素影响着群落的组成和多样性。Acinas等运用不同的PCR扩增方案建立了两个独立的沿海浮游生物的16S rRNA文库。这两个文库的比较表明了PCR扩增可能会高估文库中独特的rRNA序列。尽管如此,PCR的误差仍然不能说明样品中的所有16S rRNA基因的微小差异(1%的序列差异)。97种已完全测序细菌全基因组比较表明,它们包含242种属于非同源多操纵子的不同16S rRNA基因。序列分析还表明任何基因组中的16S rRNA内部操纵子的差异在1%以内。引入一个修正参数2.5(242个rRNA操纵子和97个基因组相除)到浮游生物样品待测序的序列中,以99%的相似性(1113)为标准,Acinas等预测这些样品中至少包含了446种紧密相关的基因组。因此这些数据间接的表明了这个种群内部包含有大量相似的种类。基因序列也开始用于推断一个群落中各个体的角色和功能,这比仅确定群落中的种类更有意义和更具挑战。

在低度多样性环境中,普通的测序就能得到环境中的微生物信息。比如在一个种群细菌复杂程度不高的酸性矿井排水装置中的生物膜中,可以对单个菌株的代谢途径进行分析。在Tyson等人的研究中,细菌种群只由五种主要的种类组成,而且其中两种几乎存在所有的覆盖面积内。而许多自然环境中种群结构高度复杂,不能采用现在的方法。据估计在一份农场土壤样品中有超过5000种,104-105株的细菌。要得到这些复杂环境中占有最优势地位的细菌种类的八倍的覆盖量,必须产生二十亿到五十亿个碱基对的序列。为了避免对全基因组集合,Tringe等大量使用未集合的序列来读取一定时期内环境中标记基因。基因定量包括对特定生态环境能反映已知环境特点的环境样品的分析。以基因比较为中心对特定环境中基因定位给我们更好地认识和解释环境带来了新的机遇,也提出了新的问题。

处理复杂环境的另一条途径是将许多种类混合的16S rRNA基因克隆到单一的载体里面。其中,SARST(serial analysis of ribosomal sequence tags)发现了V1或V6高变区。这些位于核糖体小亚基rRNA上的高变区(叫做V1或V6区)长度大约为17-55bp,这些复杂的生物体中的片断可以连接到单个的克隆里面去。用这种方法,单个测序反映能达到的序列标记可达20个。这种方法可以鉴定菌群可达到属的水平。van der Lelie等人报道了一种改变的序列标记方法,用于基因组中短的保守序列,结合限制性内切酶消化产生标记,可以区分亲缘关系很近的菌株。一些细菌的保守基因已经鉴定出来,包括rpoC,uvrB, recA 和16S rRNA 基因。在这些基因中,16S rRNA是差别最大而且可以应用于所有的原核生物种类分析的基因,可以达到属的水平,很大一部分还可以分辩到种的水平。

近年来,以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列已经成为鉴定微生物区系的最有力的方法。这种微生物分类阵列由大量不同门类的细菌的标记探针组成。不同原型的阵列已经发展并开始用于估计环境种群中微生物的多样性。这种以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列将成为监测各种复杂环境中微生物多样性的一个最重要的工具。

复杂环境中微生物区系指纹图谱和宏基因组分析将来可能发展为基因芯片。一个完全的综合芯片到目前为止仍然是一个对未来的展望。Hong等人描述了一种基因芯片的概念,这种芯片通过分离不同种类和数量的细菌或哺乳动物的细胞并裂解提纯DNA或者mRNA来实现。基因芯片的研究对我们认识和监测一定的微生态环境中微生物种群结构的认有着非常重要的意义。

直到今天,宏基因组的研究还只在生物量相对较高的环境中进行。在对细胞、量很少的环境进行宏基因组的分析还需要一种新的文库构建方法。Abulencia等描述了一种多态性扩增严重污染的土壤中有机体基因组的方法。从严重污染和细胞密度极低的地表下土壤样品中提取DNA,￠29DNA聚合酶用于扩增总基因组。通过第一次基因组DNA的扩增,污染的土壤中细菌多样性分析,和细菌基因组文库构建是可能的。尽管存在扩增的偏好现象,在一个微小的细菌样品中扩增宏基因组DNA,仍然可以得到一些以前无法得到的基因组的信息。

1.3 筛选宏基因组表达文库

另外一种方法是通过构建和筛选宏基因组表达文库,或者通过测序和限制性内切酶的方法来筛选。直接筛选宏基因组文库的一种局限就是需要超高通量的筛选系统,或者大量的可用的筛选的阵列。可以通过富集基因的方法来筛选由数百万个基因组成的宏基因组文库中的稀有基因。其中一种富集的方法是底物诱导表达筛选(substrate-induced gene expression screen,SIGEX)。Uchiyama等完善了一种高通量的SIGEX筛选方法,他们将目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)连接起来,转到表达载体内,通过检测激发的荧光来检测相应的克隆。宏基因组DNA被克隆到gfp基因序列的上游后,通过FACS方法来排除所构建文库中组成型表达gfp的克隆。再将未表达gfp的克隆转移到含有靶标底物的培养基中,通过诱导gfp基因表达来筛选克隆子。这种筛选体系的机理是:分解代谢相关的基因能够在特定代谢物的作用下被诱导表达。

1.4 通过培养方法获取不可被培养的大多数微生物

要大量精确测序复杂环境中的微生物DNA样品,不是一件很容易的事情,这也说明了全面的获取微生物信息的方法的重要性,可以通过这些信息来理解微生物间及微生物与环境间的相互作用。尽管“环境基因组”能够提供大量的信息,但对生理学,生态学和进化学有重要影响的分类单元中可培养微生物单菌落的会给生态小环境的研究带来深远影响。Proteorhodpsin的发现及它的编码基因存在于Pelagibacter ubique证明了获取可培养单菌落的作用。Proteorhodpsin编码基因是在海水和环境微生物宏基因组的克隆测序过程工程中第一次被发现的,但是我们不能确定不可培养的微生物基因组中包含Proteorhodpsin基因。通过培养Pelagibacter ubique,我们就有可能将Proteorhodpsin与固定的种类联系起来。

许多研究者们正在努力研究与模拟专一的可培养的微生物,并且利用将这些微生物来研究它们环境中所处的地位和发挥的作用。基因组测序已经为我们提供了大量的信息并了解这些微生物在环境中的作用。

经典的微生物培养策略都是一贯地给微生物系统提供过量的营养,从而导致能形成菌落或薄膜的和快速生长的细菌富集。对于依赖稀释培养基或模拟自然环境培养基才能生长的细菌,Ferrari等人描述了一种模拟自然环境条件的用于培养土壤微生物的新颖方法。他们研究组所采用的泥浆膜系统中,一种聚碳酸酯是作为生长培养支持物,土壤提取物作为培养基。研究结果是长出了大量的未被鉴定的微型菌落。Koepke等人将多种不同的培养方法应用到沿海地表下的沉积物,研究发现多数情况下没有一组微生物能够在几种培养方法中都被培养出来。他们的研究肯定了这个观点:没有一种单一的培养方法或者培养基适用于分离专一样本中的多种多样的微生物。同时采用低营养条件富集和分子方法,在冰岛富含中性硫化物的热温泉中得到了具有一种高度差异型的淀粉酶基因。使用热温泉水的微生物富集方法采用低浓度淀粉和长时间温育,最后选育出能够降解淀粉但生长缓慢的微生物。

在培养之前,将样品中的多种特定的微生物选择性地分离出来可以降低微生物群落的复杂性。Miteva和Brenchley的过滤培养,结合长时间温育,使一些新颖而极小的细胞菌落得到富集。这种方法对于研究极端条件下的微生物的代谢特性及长时间存活机制是很有益的。

2 结语

要得到不可培养的大多数微生物的信息,还有很漫长的路要走。在不久的将来,使用更便宜更快捷的测序方法,环境工程测序技术将会产生更加多样的数据和信息。然而,测序并非我们认识环境微生物的唯一方法。我们需要一种新技术,它能够针对直接分析和估量环境和培养条件下的微生物细胞,并且尽可能地和自然界真实的状况接近。对于单个微生物细胞进行完全的特征分析也是一项很有意义的工作。虽然在当今的条件下还没能实现,但是关于单细胞微生物学已是一个很明显的趋势,能让我们解决更多悬而未决未的环境微生物的问题。总之,在工程学,生物地球化学,生物化学,生物信息学,生理学和生态学等多种学科快速发展的基础上,宏基因组学的研究将会使我们进一步加强对于环境对微生物多样性分析的理解和对微生物环境功能的认识。

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第9篇：微生物多样性分析范文

关键词：土壤微生物；环境胁迫；响应机制；农业发展；土壤肥力；农作物；种植产量 文献标识码：A

中图分类号：S154 文章编号：1009-2374（2017）11-0145-02 DOI：10.13535/ki.11-4406/n.2017.11.074

1 概述

地球表面最表层覆盖的是土壤，土壤不仅是自然资源中最与人接近的资源，还是分布量最大的资源，几乎在地表上到处都有土壤，可以说土壤与人类的生产生活紧密相连。同时，土壤作为大自然赋予的保护层，对维护自然生态系统的稳定性有重要意义，对此必须重视对土壤生态系统功能的养护，加强对破坏土壤营养成分的因素进行分析，以便提高土壤在环境中的抵抗力。众所周知，土壤生态系统自成一个完整的循环体，在土壤中生存了大量具有多样性特点的生物群落，正因为这些生物具备多样性特点，且含有对土壤起到积极影响的营养元素，才能维持土壤生态循环系统的平衡，并且部分微生物是参与地球化学循环必要物质，对植物生长、气候调节等陆地生态系统的生态功能起到不可替代作用。因此，探索微生物群落对环境的胁迫所引起的环境变化做出的响应，根据微生物响应机制做出调整，提高土壤自身生态功能的稳定性是十分必要的。

2 土壤微生物与环境胁迫之间的联系

环境胁迫是指在自然界中，环境对其范围内存在的生物产生了一定程度的威胁和制约，破坏了生物的自然生长和存在，这种胁迫主要是受到外来因素的干扰，例如受到天灾冰冻、洪涝、盐碱等或者受到人为的干扰如倾倒垃圾、碾压等。土壤作为自然环境中四处存在的物质，其受到环境的影响作用十分V泛，并且长期以来，由于人类工业化发展和城市化的变革，给土壤生态环境造成了难以想象的破坏。

在环境给土壤造成的破坏之中，突出的土壤污染表现为土壤重金属沉积，大量重金属经过日积月累，会导致土壤的生态系统失去平衡，造成土壤中微生物群落活性降低，使微生物生长逐渐朝向单一化演变，最终导致土壤的机能下降。已知关于土壤微生物对环境胁迫的响应机制研究中，人们多数是将重金属污染作为研究生物和环境胁迫的切入点。目前，科研人员已经发现了重金属在土壤中的沉积，会对土壤内部微生物群落多样性以及土壤生态稳定性等多方面造成影响，从这个角度切入进行实验，可以获得多项研究结果，有利于科研对比实验的展开。

3 土壤微生物多样性及土壤生态稳定性研究方法分析

3.1 土壤微生物多样性研究

土壤微生物群落因为自身的物质特点具备多样性的性质，正是由于微生物群落的多样性，为土壤提供了充分的营养，能够维持土壤生态系统平衡。而要想探究土壤微生物对环境胁迫的影响机制，首先就要了解土壤微生物多样性，对土壤微生物多样性的掌握有利于提高人们认识微生物的生态功能。测量土壤微生物群落多样性主要利用培养方式进行实验，传统的测量方法有底物利用分析法、分离培养分析法，也有依靠新技术产生的新兴研究方法，比如说高通量同高分辨率结合的宏基因组学分析法。在研究过程中，根据所具备的实验条件选择恰当的实验方法，对土壤微生物群落多样性进行分析和记录，在反复比对实验数据后得出土壤微生物群落多样性特征。目前，实验研究人员会根据微生物群落多样性的差异做出区分，多以微生物群落α多样性、β多样性和γ多样性为研究内容。

3.2 土壤生态稳定性研究

实际上，土壤生态稳定性决定了土壤在遇到环境胁迫时的响应机制反应度，土壤生态稳定性是指生态系统在面临外部环境发生变化，对土壤的各个方面的性能和生态性造成影响时，可以利用自身功能与性能抵抗外部侵袭的影响，使得土壤生态系统能够保持原有的状态。土壤生态稳定性包括了许多方面，但是起到绝大部分作用的有两个，即土壤抵抗力稳定性和恢复力稳定性。这两个功能是土壤本身含有的，不同的是不同的土壤因为具有的微生物群落不同，会体现出不同程度的差异。根据相关数据显示，土壤中的微生物群落如果功能性显示出多样化，并且微生物群落的数量越多，土壤自身的抵抗力稳定性和恢复力稳定性就越大，所以在研究土壤生态稳定性的实验中，研究人员主要讨论的就是这两个功能指标。

4 土壤微生物对环境胁迫响应机制的分析

4.1 土壤微生物群落功能冗余情况

功能冗余一般指具备多项功能的事物会存在生态功能重叠情况，对于土壤微生物群落而言，微生物具有多样性的特征，不同的微生物群落都会存在一些生态功能，这些功能本质上所起到的作用都是一致的。有实验证明，土壤微生物群落中的某些生态功能被剔除后，这些微生物群落的生态系统功能并没有发生太大改变，仍然可以维持原有的生态体系。也就是说，一旦土壤面对环境胁迫，微生物群落会选择脱离出一些个体，来应对环境变化造成的恶果，剩余微生物群落可能会减少微生物种类，使功能结构发生改变，但是这些改变还不足以支持整体土壤微生物群落的正常功能。众多数据显示出，土壤具备功能的稳定性，很大程度上与土壤微生物群落的功能冗余存在联系，正是因为这些功能冗余的原因，会始终保持土壤在自然环境的变化中呈现出平衡性，所以研究功能冗余的物种发挥重要作用可以很好的解释生态系统稳定性的潜在机理，对研究土壤生态系统平衡起到了重要的影响作用。自然微生物群落多样性与功能之间的联系始终都没有得到详细的认知，科学家们对微生物群落的研究体现在多方面，其中非常明确地表示出微生物群落的功能冗余对各种研究都有影响。

4.2 土壤微生物对重金属污染的抵抗性能

当前，社会环境问题严重，给土壤的生态系统造成了严重威胁，除了人为的治理以外，土壤微生物群落在应对土壤环境恶劣情况中发挥了巨大作用。在研究土壤微生物群落对环境胁迫的响应机制过程中，人们着重关注了微生物群落对土壤中因重金属带来的环境变化进行抵抗并自我恢复的研究，经过多项实验观察，确定了微生物群落在面对重金属物质的胁迫时能够及时激发响应机制，助力土壤保持生态系统稳定平衡。当土壤微生物群落感受到重金属的威胁时，一般会采取自动应对机制，形成相应的能力。其一，当重金属物质入侵土壤后，土壤中的微生物群落会改变性质，由耐受型微生物群落逐渐取代敏感型；其二，当遇到重金属量过大时，土壤中的微生物群落会发生对这些重金属的水平转移，会逐渐在群落内部生成抗性基因，对抗重金属；其三，有可能在遇到重金属入侵时，土壤微生物群落发生物种遗传变异，从初始微生物群落开始逐渐产生的新的群落会具备这些抗金属性能。在对抗重金属入侵过程中，土壤中用以对抗重金属的微生物群落还是会受到影响，时间越长，这些对抗重金属的微生物群落对抗性能和恢复性能降低越快，在面对环境胁迫时，土壤生态系统的稳定性更多还是依靠耐受型微生物群落和抗性基因转移（水平转移）。

4.3 环境胁迫下土壤微生物的其他机制

环境胁迫一旦发生，会引起原核生物与真核生物细胞产生蛋白质错误折叠与聚合。当环境胁迫为热胁迫，此时土壤微生物群落中的细菌会发生蛋白质变性与聚合，温度超过一定的限定值后会在原有细菌内部的蛋白质基础上诱变为热激蛋白，其内部含有分子伴侣，作用于细胞蛋白质，能够防止出现聚合或者降低蛋白质错误折叠，并且在热激蛋白中存在一种非蛋白酶，这种酶的作用是降解不可逆损坏的多肽。

5 结语

总之，当土壤遭遇环境胁迫时，土壤微生物群落会依靠自身的生态功能引发响应机制，应对已经发生的环境胁迫。但是单靠土壤微生物自发性的响应机制仍然不够，随着社会环保观念的加强，要持续加大投入研究土壤微生物对环境发生胁迫时响应机制的内容。就我国当前的实际情况而言，更要注重对土壤中的重金属抗性基因转移（水平转移）做深入研究，找出科学方法提高土壤微生物群落的生态活性，加强土壤微生物群落对重金属的抗性，以便提高土壤肥力，为恢复土壤生产力奠定坚实基础。

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