单细胞生物的定义精选(九篇)
第1篇：单细胞生物的定义范文
[关键词]关键词语 初中生物 概念教学
[中图分类号] G633.91[文献标识码] A[文章编号] 16746058（2016）140117
生物是一门特殊的学科，它有相当多的概念需要记忆和掌握，学生在学习时很难把握住概念的重点，在理解的时候有很多困难。而且生物对概念、名词、定律的知识要求精确到位，这样才能针对多种情况做出最准确的判断。因此，针对生物学科的这些特点，在进行生物概念教学时教师要引导学生把握关键词语，以此来提高生物概念教学的效率。
一、让学生在概念学习中学会把握关键词语
生物概念是影响概念形成的因素之一，复杂的概念有较多的自身特征，也有无关的特征，不容易分辨，学生记忆起来相当困难。根据科学实验表明，有关特征清晰的概念，学生记忆起来比较容易，而且概念的逻辑性和关联性越强，学生学习起来越容易。在进行生物概念教学时，如果无任何的知识准备，教师很难引导学生将新学的概念与已学的概念联系起来，所以，教师一定要在新旧概念之间搭建必要的“桥梁”，而这种桥梁就是生物概念的关键词语。
关键词语是概念的一个大致概括，也是概念的浓缩，往往取概念中几个最为重点的词语，来代表整个概念。教师在引导学生把握关键词语时一定要将概念涉及的点先全部列出来，然后每一点选取一个或者多个关键词语，提示学生概念的关键所在，从而提高学生学习生物概念的效率。以植物细胞的结构和各结构的作用为例，教师可以从以下几个关键词语入手，引导学生进行把握。如（1）细胞壁：支持和保护细胞，透明；（2）细胞核：包含植物的遗传信息；（3）细胞质：植物细胞最主要的成分，其中含有大量的物质，主要有液泡和叶绿体，液泡内物质不断流动，加速细胞内、外物质交换；（4）细胞膜：控制物质进出细胞，起到保护细胞的作用。
从上述四个关键词语来看，它们取自于植物细胞相关概念的每一个知识点，然后在其中选取了可以代表每个知识点的词语，用于引导整个概念。这样把生物概念拆分成几个小的部分，再记忆起来就较为方便，将一个繁杂的概念整理得有条理，看起来也较为清晰。这几个关键词语涵盖了植物细胞相关的知识点，如果用这些关键词语来教学，逐步引导学生掌握每个关键词语所代表的内容，学生学习起来就会更容易，且通过记忆关键词语来延伸思考相关的生物概念，学生更能理解生物概念的本质内涵。
二、把握关键词语，理解生物概念的内涵与外延、广义与狭义
1.把握关键词语，理解生物概念的内涵与外延
生物概念具有一定的复杂性，不仅有文字本身代表的含义，还包含着内涵与外延。内涵与外延是概念的基本特征，应用在生物概念上，其内涵指的是生物的生命活动规律与生命现象，外延是指概念包含内容的使用范围和使用条件。为了让学生准确理解概念的内涵与外延，教师应把内涵与外延所包含的内容反映在关键词语上，进而引导学生把握关键词语。
以细胞的分裂过程概念为例，书本上的定义是：细胞从一个细胞分裂成两个细胞，使细胞的数目增多。这个概念的内涵是细胞的数量增加，外延是细胞从一个变成所两个。所以在对这一概念选取关键词语时，有以下两个：
（1）分裂过程：细胞从一个变成两个；
（2）分裂结果：增加了细胞的数量。
通过把握关键词语的方法，将细胞分裂的概念分为了两个关键词语，关键词语中体现了概念的内涵与外延。这样，学生再记忆起来就较为简单。
2.把握关键词语，理解生物概念的广义与狭义
生物概念的广义与狭义是针对概念的外延来说的，如果一个生物概念的外延较大，那么它就是广义的概念；如果概念的外延较小，那么它就是狭义的概念。应用把握关键词语的方法进行生物概念教学时，一定要先区分概念是广义的还是狭义的。
以“染色体”这一生物概念为例，广义的染色体是指在细胞分裂期间呈丝状的染色质，原核生物没有这种物质；狭义的染色体指存在于细胞周期的分裂期，由蛋白质和DNA组成的物质。我们从狭义与广义上理解染色体这一概念是不同的，在把握关键词语时也要考虑到这种因素，这样才可以使概念更加清晰，方便学生的理解。
三、引导学生比较分析相似关键词语
生物概念中，一些名词是十分相似的，但是具体表达的含义却差别很大，在学习的时候学生很容易混淆。所以，在进行生物概念教学时教师要引导学生对相似的关键词语进行比较，使学生明确相似关键词语之间的差别，从而深刻、透彻地理解概念。
以植物细胞和动物细胞为例，两者在字面上都是以细胞为基础，表述的却是完全不同的属性，学生在学习时容易将两者混淆，所以我们要引导学生对两者的关键词语进行比较，以方便学生理解和记忆。
例如，植物细胞的关键词语有：
（1）组成：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、液泡、线粒体、绿色部分有叶绿体；
（2）分裂过程：原细胞的中部形成新的细胞膜和细胞壁，然后分裂成两个细胞；
（3）生长表现：生长时先出现较多的小液泡，最终合并成一个大液泡；
（4）细胞分裂时染色体变化：先加倍再减半，两个细胞核的染色体数目与原细胞核的染色体数目相同；
（5）细胞本质：遗传信息的携带者，植物体结构和功能的基本单位。
动物细胞的关键词语有：
（1）组成：细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体；
（2）分裂过程：细胞中部的细胞膜向内凹陷，缢裂成两个细胞；
（3）生长过程：从周围环境中吸收营养逐渐长大，细胞的体积也增大；
（4）细胞分裂时染色体变化：先加倍再减半，两个细胞核的染色体数目与原细胞核的染色体数目相同；
（5）细胞本质：遗传信息的携带者，动物体结构和功能的基本单位。
从上述两个概念的关键词语可以看出，植物细胞与动物细胞有着本质的差别，而且相关的知识点也比较多，所以学生在记忆时才会出现混淆的现象。教师在进行生物概念教学时可以把两个概念的关键词语比较分析，重点指出两者的不同之处。这样利用把握关键词语 [本文由WWw.DYLw.NET提供，第 一论 文网进行和服务，欢迎光DYlw.NeT 联系方式QQ 712086966]的方法，使学生可以重点记忆和理解易错的知识，简化了学习的复杂性。同时，这种比较关键词语的方法还可以增强学生的学习效果。学生在学习与复习一个关键词语时，自然而然地就会想到另一个关键词语，生物概念的学习效果显著增强。
生物是一门特殊的学科，它虽然被归类为理科，但是它有较多的知识点需要记忆，而且生物概念十分繁杂，记忆起来比较困难。所以，在生物概念教学中可以用把握关键词语的方法，将生物概念划分成不同的小份，以方便学生理解和记忆。这种方法在概念教学中有很好的效果，可以极大地提高生物概念教学的效率和学生学习的积极性。
[ 参 考 文 献 ]
第2篇：单细胞生物的定义范文
【摘要】 目的 探讨PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2（4吗啉基）8苯基4氢1苯并吡喃4酮〕联合化疗药物顺铂（DDP）治疗肺癌的效应及可能机制，以期为肺癌的临床治疗提供新的理论依据。方法 培养肺腺癌A549细胞，采用MTT方法及流式细胞仪检测LY294002联合DDP对A549细胞增殖及凋亡的影响；通过裸鼠移植瘤实验检测LY294002联合DDP对A549细胞成瘤性的影响。结果 在一定剂量范围内，LY294002与DDP均可抑制A549细胞的生长，其抑制作用呈量效关系。LY294002与DDP联合作用可增强对A549细胞的抑制作用。LY294002与DDP均可有效的诱导A549细胞凋亡，联用后凋亡率显著增加。裸鼠移植瘤实验显示，LY294002与DDP均可抑制移植瘤的生长，联用后抑瘤率增加。结论 LY294002可增强DDP对A549细胞、裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用，该作用可能是通过增强对A549细胞增殖的抑制以及诱导其凋亡来实现的。
【关键词】 肺肿瘤；凋亡；PI3K；LY294002；顺铂
细胞生存信号的转导对肺癌的发生发展起着至关重要的作用。PI3K/Akt信号转导通路在国外被视为癌细胞存活的首要通路。近年来对Akt的研究发现，Akt能够通过磷酸化其下游的多种作用底物促进对化疗和放疗的抵抗。PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2 (4吗琳基)8苯基4氢1苯并毗喃4酮〕可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔1，2〕。而LY294002对肺癌的研究还处于初始阶段，本研究旨在对PI3K/Akt的抑制剂LY294002与化疗药物顺铂（cisplatin，DDP）联用对肺癌细胞株A549及裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其机制进行探讨，为肺癌治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株与试剂 人肺腺癌细胞株A549购自中科院上海细胞生物研究院；F12K培养基、LY294002及噻唑蓝(MTT)购自sigma公司；胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所；DDP（云南个旧生物药业有限公司，国药准字@53021740）；裸鼠由北京大学医学院实验动物中心提供。
1.2 细胞培养 A549细胞用F12K培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养。细胞为贴壁生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.3 MTT比色分析法 检测LY294002对A549细胞生长抑制作用。取对数生长期A549细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔加液量200 μl。于培养24 h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的DDP，DDP浓度依次为0.5、1、2、4、8、16 μg/ml，每组LY294002终浓度分别为20 μmol/L)，每组设6个复孔。于培养48 h后加入MTT(5 g/L)20 μl，继续培养4 h后吸出上清，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μl，振荡溶解10 min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长490 nm，空白孔调零，测定各孔吸光度A。计算细胞生长的抑制率，抑制率=(1-实验组A平均值/对照组A平均值)×100%。
1.4 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的变化 取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为2×105/ml接种于培养瓶，加入上述不同浓度的药物（LY294002终浓度为20 μmol/L， DDP终浓度别为3 μg/ml），培养48 h后获取细胞，制成单细胞悬液， 4℃ 70%冷乙醇固定，放置4℃冰箱固定12 h以上。检测时，弃去乙醇，加入0.5%胃蛋白酶1 ml（pH值 1.5～2.0）消化，采用碘化丙锭（PI）一步插入性DNA定量荧光染色法，上机检测细胞周期和细胞凋亡率。
1.5 裸鼠移植瘤模型的建立与干预 24只裸鼠，均为雌性，鼠龄为3～4 w，体重约18～20 g，实验和饲养均在无特定病原（SPF）条件下进行。随机将裸鼠分为4组：对照组、LY294002组、DDP组和LY294002+DDP组，每组6只，于裸鼠右上背部皮下接种对数生长期的A549细胞1×107/0.2 ml。待1 w后肿瘤长出。①LY294002组：给予LY294002 25 mg/kg，腹腔注射，每周2次；②对照组：等量生理盐水，腹腔注射；③DDP组：给予DDP 4 mg/kg，腹腔注射；④LY294002＋DDP组： LY294002 25 mg/kg＋DDP 4 mg/kg，腹腔注射；共3 w。裸鼠于最后注射药物2 d后处死，用药3 w。实验中注意观察裸鼠精神、进食、排便及体重情况，隔日测裸鼠体重及移植瘤直径。实验结束取出移植瘤，注意肿瘤转移情况，称重瘤结节，计算抑瘤率：抑瘤率（％）＝（对照组瘤结节重量-各实验组瘤结节重量）/对照组瘤结节重量×100％。取LY294002组及LY294002＋DDP组裸鼠肝、胃及肠做HE染色。
1.6 统计学方法 计量资料用x±s表示，用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析和Pearson相关分析，率的比较采用χ2检验。
2 结果
2.1 LY294002联合DDP对A549细胞生长的抑制效应 MTT结果显示：LY294002浓度分别为5、10、20、40 μmol/L时，其抑制率分别为：26.94％、34.33％、42.53％、49.88％，可见在一定的浓度范围内，随着LY294002剂量的增加，其抑制率增加。根据LY294002对A549细胞的抑制效应选用LY294002浓度为20 μmol/L 作为与DDP联合的干预浓度。见表1。
由表1可以看出：DDP单用时，浓度达1 μg/ml可显示抑制A549细胞的增殖，抑制率为11.41％，各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；随着浓度的增大，抑制作用增大，呈剂量效应关系（r＝0.808，P＜0.05）。LY294002与DDP联用时，DDP浓度为0.5 μg/ml即可显示出抑制A549细胞的增殖，抑制率为9.65％。各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。LY294002+DDP各浓度组与DDP单独作用对应各浓度组相比，DDP浓度为0.5 μg/ml和1 μg/ml时，抑制率的差异有统计学意义（P＜0.05）。当DDP浓度再增加，各药物联合组抑制率与DDP单用组相比，有增高的趋势，但其差异无统计学意义（P＞0.05)。低浓度组，药物联合组抑制率与DDP单用组相比，差别较大，DDP浓度越高，其差别越小。
2.2 LY294002与DDP联用对A549细胞周期及凋亡率的影响 DDP、LY294002及LY294002与DDP联用干预A549细胞后，各药物组凋亡率与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）；DDP＋LY294002组与DDP组及LY294002组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。细胞周期分布与对照组相比都发生变化，表现为S期和G2/M期细胞减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。LY294002+DDP组细胞与DDP或LY294002单独作用于A549细胞相比，S期和G2/M期细胞减少（P＜0.05）。见表2。
2.3 LY294002联合DDP对裸鼠移植瘤生长的影响 裸鼠皮下接种A549细胞后，约1 w左右见皮下移植瘤出现，呈圆形或椭圆形结节。在实验过程中，各组裸鼠均未出现精神、进食、排便的明显异常及死亡。各组间裸鼠体重无明显差异（P＞0.05）。LY294002、DDP组、DDP+LY294002组瘤结节重量均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。DDP+LY294002组瘤结节重量又低于LY294002、DDP组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。LY294002、DDP组、DDP+LY294002组的抑瘤率分别为40.3％、43.53％和67.46％，提示LY294002与DDP均能抑制裸鼠移植瘤的生长，两者联合应用抑瘤作用强于单独应用。见表3。
表1 LY294002与DDP联用对A549细胞生长的抑制效应（略）
与对照组相比：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与DDP单用组相比：3）P＜0.05
表2 LY294002联合DDP或紫杉醇对A549细胞周期的影响（略）
与对照组相比：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与DDP组相比：3）P＜0.05；与LY294002组相比：4）P＜0.05
表3 LY294002联合DDP对裸鼠移植瘤生长的抑制效应（略）
与对照组相比：1）P＜0.01；与LY294002组相比：2）P＜0.01；DDP组相比：3）P＜0.01
3 讨论
非小细胞肺癌（NSCLC）约75％的肺癌患者在发现时已属晚期〔3〕，放、化疗对各期病人均为重要的治疗方法。而单纯采用化疗或放疗效果并不令人满意。研究证实DDP等化疗药物除直接杀伤肿瘤细胞外，还可诱导肿瘤细胞进入凋亡程序，由此推论，凋亡是耐药产生的共同途径〔4〕，细胞凋亡能力可直接影响化疗药物的效应〔5〕。肿瘤细胞可通过抑制进入凋亡程序，表现出对化疗药物的耐受性，是肿瘤细胞所具有的自我保护功能之一。选择性诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的一条途径，有可能改善患者的预后〔6〕。P13K信号转导通路具有调节细胞的增殖、生存和分化等功能，PI3K可上调抗凋亡基因的表达，抑制由cmyc诱导的细胞凋亡〔7〕，以抑制细胞进入凋亡程序，促进细胞生存，因此推测P13K信号转导通路可能在多细胞耐药中发挥作用。最近肿瘤分子靶向治疗研究发现信号转导途径与肿瘤进展和放、化疗抵抗有密切的关系。PI3K/Akt抑制剂在体外可抑制多种肿瘤细胞的生长，导致肿瘤细胞凋亡〔8，9〕。近年的研究还发现PI3K/Akt抑制剂LY294002可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔2，10〕。
本研究显示，DDP及LY294002对A549细胞的增殖有显著抑制作用，二者联用与单独干预相比对A549细胞增殖的抑制作用增强，说明LY294002有增加化疗药物治疗效果的趋势。DDP与LY294002均可影响细胞周期的分布，使细胞阻滞于G0/G1期，二者联用后，该作用增强。裸鼠移植瘤体内实验结果表明LY294002、DDP均能抑制裸鼠移植瘤的生长，LY294002与DDP联用时抑瘤率增加，说明LY294002能促进DDP的抑瘤效应。以上作用可能是通过以下3方面来实现的：①LY294002使细胞周期阻滞G0/G1期，抑制细胞的增殖；②LY294002促进细胞的凋亡；③有研究发现〔11〕若将P13K亚单位基因引入体外细胞系中，可使PI3K/Akt信号转导通路活性增强，细胞对化疗药物的敏感性会随之降低，耐药性增强。说明LY294002也可能通过增强对信号转导通路的调控增强肿瘤细胞对DDP的敏感性，从而使DDP的化疗效果增强。本研究过程中各组裸鼠均未出现精神、进食、排便的明显异常及死亡。实验结束后各处理组裸鼠体重亦无显著差异，解剖未见远处及局部淋巴结转移，各组肝、胃及肠道等重要脏器的HE染色未发现明显差异，说明LY294002在体内应用相对来说是安全的。但LY294002对人体是否有毒副作用及增加化疗药物的抗癌效果，由于细胞内及动物脏器的生理特点与人类有差别，还需要进一步的研究去证实。
本研究认为，LY294002可促进Akt高表达肿瘤的抗肿瘤药物的疗效，而对于Akt低表达的肿瘤化疗效果无影响，其促进化疗疗效的作用主要是通过促进细胞凋亡实现的。而Howells等〔12〕在应用LY294002作用于乳腺癌细胞时，却发现其抑制癌细胞增殖与导致细胞凋亡并无直接关系。因此，LY294002本身抗肿瘤及与化疗的协同作用具体机制还不清楚，还存在许多悬而未决的问题，仍需进一步的更加精确的研究证实。
参考文献
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第3篇：单细胞生物的定义范文
【摘要】 目的： 采用Survivin反义寡核苷酸(ASODN)复合物抑制survivin的表达，研究其对槲皮素诱导肝癌SSMC7721细胞凋亡的影响. 方法：体外培养人肝癌SSMC7721细胞，取对数生长期细胞进行实验. 实验分Ⅰ，Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400 μmol/L SODN复合物组、400 μmol/L ASODN复合物组(设平行组)，转染48 h; Ⅱ弃掉Ⅰ部分各组培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40 μmol/L槲皮素组、脂质体LipofectamineTM2000组、SODN复合物组、ASODN复合物组、ASODN复合物+ 40 μmol/L槲皮素组(联合组)，孵育细胞24 h后检测. Ⅰ结束时采用RTPCR、细胞免疫组化染色检测各组SSMC7721细胞survivin表达变化；Ⅱ结束时用吖啶橙染色法观察细胞凋亡时形态变化，MTT法检测SSMC7721细胞生长抑制率，AnnexiV/PI双染流式细胞仪检测SSMC7721细胞凋亡率. 结果：ASODN复合物作用肝癌SSMC7721细胞48 h后能下调survivin mRNA及Survivin蛋白的表达 (P
【关键词】 反义寡核苷酸； 槲皮素； 肝肿瘤； 细胞凋亡；细胞周期； Survivin
0引言
肝癌(hepatic carcinoma， HCC)是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，对于大多数肝癌患者，经肝动脉化学药物栓塞治疗和全身化疗仍是最常用的治疗方法. 近年来抗凋亡机制在肿瘤细胞耐药性发生中的作用倍受关注［1］. survivin是1997年由Ambrosini等［2］发现，Ito等［3］报道Survivin蛋白对破坏肝癌细胞增生凋亡平衡、促进肝癌细胞快速增生具有重要作用. 槲皮素(quercetin，Quc)是广泛分布于蔬菜、水果、中草药等的一种天然的黄酮类化合物，化学名为3，3′，4′，5，7五羟基黄酮. LopezLazaro等 ［4］研究表明，Quc没有毒副作用. 近年来的研究表明Quc在体外、动物实验模型中均显示出抗癌活性［4-6］. 本实验旨在研究反义抑制survivin的表达，检测其对Quc抑制肝癌SSMC7721生长和诱导细胞凋亡的影响，探讨反义抑制survivin的表达是否在体外可增强Quc抗癌作用及可能的机制，为其进一步动物实验和临床应用提供新的实验依据.
1材料和方法
1.1材料人肝癌细胞株SSMC7721兰州大学医学实验中心提供. RPMI1640 (Sigma公司)，小牛血清(杭州四季清公司)，槲皮素(Sigma公司，用前以少量DMSO溶解，用时加RPMI1640稀释至使用浓度)，MTT(Sigma 公司)， Trizol(BBI公司)，Survivin蛋白一抗兔抗人抗体、二抗羊抗兔抗体(北京中山公司)，TaKaRa试剂盒(宝生物工程公司)，AnnexiV/PI试剂盒(宝灵试剂公司)， 阳离子脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司). 寡核苷酸(ODNs)脂质体(Lip)转染复合物survivin正、反义寡核苷酸的设计、合成：根据survivin的基因序列(GenBank Accession Number U75285)，应用Primer5.0软件设计互补于survivin mRNA的232-251序列的20个碱基组成的ASODN链：5′ CC C AGCCTTCCAGCTCCTTG 3′，同时合成正义链：5′ CGCAGTAGCTGCGCTGATTG 3′，两条链均采用硫代磷酸化修饰. 在GenBank中证实反义寡核苷酸(ASODN)及正义寡核苷酸(SODN)与任何已知哺乳动物基因无匹配，上海生工公司合成. 用LipofectamineTM2000输送ODNs，依文献［7］ ODNs/LipoTM2000=4 g/L配置ODNs LipoTM2000转染复合物，按质脂体转染试剂盒说明书进行操作.
1.2方法取对数生长期的SSMC7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔或6孔培养板或100 mL细胞培养瓶.
1.2.1分组实验分Ⅰ，Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400 μmol/L SODN复合物组、400 μmol/L ASODN复合物组(设平行组)，转染48 h; Ⅱ弃掉Ⅰ部分培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40 μmol/L槲皮素组、脂质体LipofectamineTM2000组、SODN复合物组、ASODN复合物组、ASODN复合物+40 μmol/L槲皮素组，孵育细胞24 h后检测.
1.2.2RTPCR检测SSMC7721细胞survivin mRNA表达变化在实验Ⅰ部分结束时，按Takara试剂盒操作说明书进行，收集各组细胞，Trizol提取总RNA，用紫外分光光度计检验纯度并定量. 设βactin为内参照，对样品模板用量标准化， survivin和βactin分管扩增， 引物由上海生工公司合成. 其序列如下：survivin引物序列5′ AAAGAGCCAAGAACAAAATTGC 3′(F)和5′ GAGAGAGAAGCAGCCACTGTTAC 3′ (R)， 338 bp; βactin引物序列5′ CTTCTACAATGAGCTGCGTG 3′(F)和5′ TCATGAGGTA GTCAGTCAGG 3′(R)， 243 bp. 10 μL逆转录体系用于逆转录合成cDNA，30℃ 10 min， 42℃ 30 min， 99℃ 5 min， 5℃ 5 min完成逆转录. 10 μL cDNA用于PCR反应，分别单独加入相应上下游引物等在50 μL PCR反应体系进行PCR反应. 94℃预变性2 min后进入PCR循环，条件：survivin和βactin，94℃变性30 s， 54℃复性30 s， 72℃延伸30 s，共35个循环；RTPCR产物8 μL在18 g/L琼脂糖凝胶上电泳，经凝胶图像分析仪分析结果，以survivin与βactin的比值作为survivin mRNA表达的相对含量.
1.2.3细胞免疫组化染色检测SSMC7721细胞Survivin蛋白表达变化取对数生长期细胞于预先置入盖玻片6孔板进行细胞爬片，在实验Ⅰ部分处理结束时，取出各组爬片细胞，PBS液轻轻漂洗，750 mL/L乙醇固定，按试剂盒操作步骤进行细胞免疫染色. 以正常鼠血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗行替代对照和空白对照. 于普通光学显微镜下观察，以细胞核或细胞质出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性，随机选取5个高倍视野进行计数，每个高倍视野计数100个细胞，共500个细胞，计算细胞Survivin蛋白阳性表达率.
1.2.4吖啶橙(AO)染色法观察细胞凋亡时形态变化消化、收集实验Ⅰ，Ⅱ两部分处理的各组细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，制成单细胞悬液，浓度1010个/L，750 mL/L乙醇固定4 h，离心弃乙醇，加入8.5 mg/L的AO 2 mL工作液，室温染10 min后，滴几滴在载玻片，加缓冲甘油封片. 在荧光显微镜下用吸收波长405 nm，发射波长550~630 nm观察，并随机拍照.
1.2.5MTT法检测细胞增殖变化取对数生长期的SSMC7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔板，每孔2×103个，并设3个复孔. 实验设数个平行板，分Ⅰ，Ⅱ两部分；到实验预定点前4 h加5 g/L的MTT 10 μL，37℃反应4 h，弃掉MTT，加200 μL DMSO，轻轻振荡10 min，使结晶溶解，酶标仪检测570 nm波长A值. 计算细胞生长抑制率(inhibitory rate，IR). 重复2次，取平均值. IR(%)=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%.
1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡率消化、收集经实验Ⅰ，Ⅱ两部分各处理组细胞，按AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入Binding buffer缓冲液200 μL、AnnexinV/FITC (20 mg/L) 10 μL和PI液(50 mg/L) 5 μL，室温避光孵育30 min后加入Binding buffer缓冲液300 μL，立即用流式细胞仪FACScan(Beclon Dickison公司)测定，经计算机软件处理，计算凋亡细胞百分率，实验重复2遍.
统计学处理: 实验数据以x±s表示；应用SPSS13.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析，并进行两两比较(q检验). 以P
2结果
2.1ASODN反义复合物对肝癌SSMC772细胞survivin mRNA表达的影响RTPCR检测survivin mRNA水平显示400 nmol/L ASODN反义复合物组(0.21±0.03)较空白对照组(0.99±0.02)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组(0.94±0.03)， 400 nmol/L SODN复合物组(0.94±0.03) RTPCR扩增的条带减弱(P
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2.2ASODN反义复合物对肝癌SSMC772细胞Survivin蛋白表达的影响细胞免疫组化染色结果显示，400 nmol/L ASODN反义复合物组(19.7±3.7)%较空白对照组(76.5±8.7)%、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组(74.5±8.2)%，400 nmol/L SODN复合物组(73.9±7.9)% Survivin蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(P
2.3细胞凋亡形态学变化ASODN反义复合物联合槲皮素组凋亡细胞数量明显较空白对照组、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、SODN复合物组、ASODN复合物组及槲皮素组增加，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质成红色荧光. 凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体等典型改变(图1).
2.4MTT法检测SSMC7721细胞增殖变化ASODN复合物组（28.4%）或槲皮素组（43.1%）可抑SSMC7721细胞增殖(P
2.5细胞凋亡率的变化与空白对照组、脂质体对照组相比，ASODN复合物组、槲皮素组、ASODN复合物+槲皮素组均能诱导细胞凋亡，且其诱导细胞凋亡率(Annevix(+)PI(-))分别是脂质体组的3.1倍、4.3倍、18.2倍，差异有统计学意义(P
3讨论
Survivin的组织分布特征具有明显的选择性，其表达于胚胎和发育的胎儿组织，但不见于终末分化的成人组织(胸腺、生殖腺除外)，而表达于大多数肿瘤组织中［8-9］，使它成为一个癌的分子标志和治疗靶点. 研究发现，Survivin能够通过杆状病毒IAP重复序列(BIR)作用于Caspase3， Caspase7来抑制凋亡蛋白酶活性，阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡，而且能在细胞有丝分裂前期通过与纺锤体微管发生特异性结合反应，使肿瘤细胞逃避细胞周期G2/M期检测点的监控，抵抗因DNA损伤或突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞异常分裂增殖［10］，另外Survivin蛋白亦可通过p21蛋白间接抑制caspase酶而起作用，阻断细胞的凋亡过程，其抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl2家族成员，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子. Survivin的高表达可以使肿瘤细胞免受各种凋亡信号的刺激而帮助细胞存活［11-12］. 槲皮素(Quercetin)是具有多种生物活性的黄酮类化合物，其维生素P样的作用已应用于临床. 国内外已有研究显示，槲皮素是目前已知的最强的抗癌剂之一，能够诱导多种肿瘤细胞凋亡［13］，同时槲皮素还有抗炎、抗过敏、抗氧化、降血脂、降压等生理活性. 本实验应用反义核酸技术，用脂质体LipofectamineTM2000介导人工合成的特定DNA片段ASODN分子转染SSMC7721细胞，人工合成的特定DNA片段ASODN分子与进入细胞质的survivin mRNA上的特定位点相结合，形成DNARNA复合物，抑制survivin mRNA与核糖体结合，同时激活RNA降解酶H，降解survivin mRNA，从而抑制或封闭基因的表达，干扰survivin致病蛋白的产生［14］. 实验结果显示， ASODN复合物作用于肝癌SSMC7721细胞48 h后，采用RTPCR和细胞免疫组化检测示与空白对照组比较，ASODN复合物组survivin mRNA、Survivin蛋白表达明显下调，而等量脂质体组、SODN复合物组survivin mRNA、Survivin蛋白表达变化差异则无统计学意义，实验证明了ASODN复合物可有效抑制survivin基因的表达. 实验进一步用等剂量的槲皮素(亚致死浓度)处理实验Ⅰ部分各实验组肝癌SSMC7721细胞24 h后，实验结果显示，与其它组比较，ASODN复合物+40 μmol/L槲皮素组(联合组) AO染色法观察在相同条件联合组满视野见典型细胞凋亡形态学变化且凋亡细胞数量明显增加，MTT法、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测示在同等条件联合组细胞生长抑制率和细胞凋亡率明显高于其它组，差异有统计学意义. 也就是有效封闭肝癌SSMC7721细胞survivin基因的表达能增强槲皮素对该细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用即ASODN反义复合物联合槲皮素对肝癌SSMC7721细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用具有协同效应. 实验结果还表明，SSMC7721细胞survivin基因表达降低后，其抗凋亡能力被有效抑制了，推测联合组对肝癌细胞的协同细胞毒性导致的凋亡可能是通过两个凋亡途径的共同通路［15］即激活Caspase效应子而实现的. 至于是通过死亡受体途径还是通过线立体途径介导的凋亡有待进一步研究.
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第4篇：单细胞生物的定义范文
【关键词】 培哚普利；泡沫细胞；血管内皮生长因子
［abstract］ objective: to study the expression of vascular endothelial growth factor (vegf) induced by oxidized low density liprotein (oxldl) and the inhibitory effects of perindopril on the levels of vegf protein and mrna in the u937 foam cells.methods: the u937 cells were incubated with oxldl 80 μg/ml for 48 h and a macrophagederived foam cell model was established. the medium was pretreated with perindopril (0.01、0.1、1 μmol/l) for 24 h , incubated with oxldl 80 μg/ml for 48 h.reverse transcriptionpolymerase chain reaction(rtpcr) and enzymelinked immuneosorbent assay (elisa) were applied to determine the expression of vegfprotein and mrna in u937 cells and treated u937 cells.results: vegfmrna levels in u937 cells after incubation with oxldl 80 μg/ml increased significantly compared with control cells(foam cells vs control cells, 2.371±0.253 vs 0.954±0.245, p<0.01).after treated with perindopril(0.01、0.10、1.00 μmol/l), vegf protein levels were concentrationdepently attenuated(foam cells vs perindopril treated cells, 2.371±0.253 vs 2.168±0.270、1.533±0.248、1.022±0.189, p<0.01). vegf protein levels in the medium after incubation with oxldl 80 μg/ml increased significantly compared with control cells(foam cells vs control cells , 1 804.18±177.59 pg/ml vs 716.19±60.82 pg/ml, p<0.01).after treated with perindopril(0.01, 0.10, 1.00 μmol/l), vegf protein levels were concentrationdepently attenuated(foam cells vs perindopril treated cells, 1 804.18± 177.59 vs 1 601.46±154.68 pg/ml, 1 377.09±110.36 pg/ml, 1 017.89±147.18 pg/ml, p<0.01). conclusion: perindopril can signifantly attenuated vegf mrna and protein expression in foam cells.
［key words］ perindopril ； foam cells ； vascular endothelial growth factor
动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是常见的危害严重的心血管疾病。泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞，一般认为在动脉粥样硬化形成的早期,血液中的单核细胞进入内皮下间隙,在内膜下被激活后分化为巨噬细胞,后者主要通过清道夫受体无反馈性下调地吞噬大量氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxldl),导致细胞内脂质堆积，形成泡沫细胞。研究表明斑块内巨噬泡沫细胞分泌的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，vegf）可促进斑块内血管新生（angiogenesis），而血管新生与斑块的生长、破裂、出血及血栓形成关系密切［1］。本研究通过氧化低密度脂蛋白诱导体外培养的人单核/巨噬细胞系u937细胞成泡沫细胞,观察vegf在泡沫细胞中的表达情况及培哚普利对其表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人单核/巨噬细胞系u937细胞（上海午立生物技术有限公司），培哚普利（天津施维雅制药有限公司），胎牛血清（杭州四季青公司），低密度脂蛋白（ldl，中国医学科学院基础研究所），trizol试剂（invitrogen公司），逆转录试剂盒（晶美公司），taq酶、10×pcr反应缓冲液、dntps、6×溴酚蓝上样缓冲液、dna marker（takara公司），vegf酶联免疫吸附试验（elisa）检测试剂盒（r&d systems公司）。
海南医学院学报 vol.15 no.1 feb.20091.2 ldl的氧化修饰
取0.9 mg/ml的ldl 1 ml放入0.01 mol/l的pbs 100 ml（ph 7.4）中4 ℃透析24 h，以除去离心过程中所加的抗氧化剂，用pbs将ldl稀释至蛋白浓度为0.5 mg/ml，放入新鲜配制的含10 μmol/l cuso4 的pbs溶液中37 ℃孵育氧化12～24 h，然后放入含1 μmol/l edta的pbs（ph 7.4）中4 ℃透析24 h，以终止氧化还原反应。测定oxldl丙二醛（ mda）的含量为31.97 nmol/l（mda药盒），鉴定其氧化修饰程度。将制备好的oxldl以0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存。将上述最终反应物用无血清无酚红1640定容至9 ml，配制成80 μg /ml的oxldl溶液备用。
1.3 u937泡沫细胞模型的建立和分组
将人单核/巨噬细胞系u937细胞悬浮生长于含10% 胎牛血清的rpmi 1640培养液中，放入37 ℃、5% co2培养箱中培养，2 d换液传代一次,至细胞密度达1.0×109个/ l，将培养细胞分为u937细胞对照组、u937泡沫细胞组及3种剂量的药物干预组。u937细胞对照组：u937细胞中除加rpmi 1640培养液外，不加其它任何药物；u937泡沫细胞组：rpmi 1640洗2遍，换入无血清的rpmi 1640培养液中，同时加入oxldl至终浓度80 μg/ml培养48 h，使u937细胞泡沫化。药物干预组：u937细胞用rpmi 1640洗2遍后分别加入0.01、0.10、1.00 μmol/l 不同浓度的培哚普利液中，在温箱中37 ℃温育24 h，再加入浓度80 μg/ml的oxldl孵育 48 h。处理后的各细胞组及亚组分别采用逆转录聚合酶链式扩增反应（rtpcr）方法检测细胞vegf mrna表达及elisa方法检测细胞上清液vegf蛋白水平，每组重复检测6次。
1.4 u937泡沫细胞油红o染色
收集细胞低速离心制成细胞悬液，涂于干净的被有1%明胶的玻片上，自然晾干。在4%的甲醛中固定12 h 后以新鲜配制的0.3% 油红o染色20 min，再以氧化苏木精衬染2 min，然后以丙酮脱水1～2 s后pvp封片。各步骤间均用双蒸水冲洗干净。胞浆内出现红染颗粒的为脂质染色阳性。
1.5 rtpcr检测细胞vegf mrna的表达
采用逆转录试剂盒以trizol试剂一步法抽提细胞rna并定量，各样本均加入总rna 2 μg，逆转录合成第一链cdna。cdna扩增聚合酶链反应，引物：vegf上游 5′ggacatcttccaggagta3′，下游5′tgcaacgcgagtctgtgt3′，扩增产物356 bp；内参βactin 上游5′atcgtgcgtgacattaagg 3′， 下游5′acaggactccatgcccagg3′，扩增产物195 bp。逆转录酶链反应条件：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环。反应完成后用含有5 mg/l 溴化乙锭的1.5 % 琼脂糖凝胶对rtpcr反应产物进行电泳，用数字成像系统进行分析和拍照。
1.6 elisa检测细胞上清液vegf蛋白水平
采用双抗体夹心法，按照试剂盒操作步骤，以rpmi 1640培养液为空白对照，将不同浓度的vegf标准品（2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.5 pg/ml），在酶标仪上波长为450 nm波段测定光密度值，以vegf标准品浓度为横坐标、光密度值为纵坐标进行直线相关回归，根据待测标本的光密度值在直线上查出相应的vegf蛋白水平。
1.7 统计学处理
所有计量资料均用均数±标准差（±s）表示，采用spss 11.0统计软件，数据处理用单因素方差分析，检验水准a= 0.05。
2 结果
2.1 u937泡沫细胞模型的建立
u937细胞长至1×106/ml后用80 μg/ml的oxldl刺激48 h，油红o染色后光镜下可见细胞胞浆内存在大量的脂滴，符合泡沫细胞的形态特征， u937泡沫细胞模型建立。
2.2 u937细胞vegf mrna表达的变化
oxldl刺激u937细胞48 h成为u937泡沫细胞后，vegf mrna的表达较u937细胞对照组明显增加（p<0.01）。采用不同浓度的培哚普利干预u937泡沫细胞后，其vegf mrna表达水平呈浓度依赖性下降，较u937泡沫细胞组差异有统计学意义（p<0.05～0.01）,不同浓度培哚普利组间差异亦有统计学意义（p<0.01）（表1）。不同浓度培哚普利处理u937细胞后rtpcr检测vegf mrna的结果见图1。
2.3 u937细胞上清液vegf蛋白水平的变化
与u937细胞对照组相比，u937泡沫细胞组vegf蛋白表达水平增加了1.52倍，差异有统计学意义（p<0.01）。采用不同浓度的培哚普利干预u937泡沫细胞后，vegf蛋白水平呈浓度依赖性下降，较u937泡沫细胞组差异有统计学意义（p<0.05～0.01）,不同浓度培哚普利组间差异亦有统计学意义（p<0.01）（表2）。表1 各组u937细胞vegf mrna表达的变化注：与u937细胞对照组比较，*p< 0.01；与u937泡沫细胞组比较，＃p<0.05，p<0.01；与0.01 μmol/l培哚普利组比较，■p<0.01；与0.10 μmol/l培哚普利组比较，p<0.01。 表2 各组 u937细胞上清液vegf蛋白水平 的变化 注：与u937细胞对照组比较，*p<0.01；与u937泡沫细胞组比较，＃p<0.05，p <0.01；与0.01 μmol/l培哚普利组比较，■p <0.01；与0.10 μmol/l培哚普利组比较，p<0.01。
3 讨论
研究表明， oxldl是动脉粥样硬化的独立危险因子，在动脉粥样硬化过程中起着关键作用［2］。oxldl作为氧化信号使巨噬细胞中接受氧化物成分的转录因子激活，刺激包括vegf在内的一系列细胞因子及生长因子表达，诱导单核细胞粘附于动脉内皮并分化为巨噬细胞，巨噬细胞清道夫受体大量摄取oxldl而不受胞内胆固醇含量的影响，导致体内胆固醇蓄积，最终促进单核/巨噬细胞转变为泡沫细胞，无疑促进了动脉粥样硬化的发生［3，4］。泡沫细胞的形成贯穿了动脉粥样硬化发生、发展的整个过程，泡沫细胞分泌的炎性细胞因子和生长因子对于斑块的稳定性有重要的作用 。
vegf与斑块内的血管新生有密切关联。vegf是ferrara等［5］从脑垂体滤泡星状细胞培养液中提取的一种能与肝素结合的二聚体糖蛋白，这种蛋白对血管内皮细胞有特异性分裂增殖的作用。vegf作为一种特异的内皮细胞丝裂原分裂蛋白，可引起血管系统和一系列病理过程，包括肿瘤生长、伤口愈合和糖尿病视网膜病变的发展［6］。vegf在正常血管上无表达，但主要存在于人动脉粥样硬化损害部位，在早期动脉粥样硬化损害中，vegf多存在于内皮下巨噬细胞丰富的部位。在粥样斑块中，检测到vegf存在于由脂质丰富的巨噬细胞组成的粥样损害中央和主要由平滑肌细胞组成的斑块基底部［1］。celletti等［7］将新西兰大白兔高脂喂养3个月，单独肌肉内注射vegf，7～21 d后取兔胸主动脉进行形态学和免疫组化分析，发现注射vegf组兔的平均斑块面积、斑块周长、最大斑块厚度、内皮密度（内皮占斑块厚度的比率）以及巨噬细胞密度均较注射白蛋白组（对照组）有非常显著性增加，从而提示vegf能增加高脂喂养的兔胸主动脉动脉粥样硬化斑块形成的程度和数量。inoue等［8］发现oxldl可使thp1、u937等单核巨噬细胞及人冠状动脉内皮细胞的vegf mrna及蛋白表达增加，并指出该作用是通过激活细胞过氧化物增殖体激活受体γ信号来实现的。此外，血管紧张素ⅱ（angiotensinⅱ，angⅱ）、高葡萄糖、高同型半胱氨酸均可诱导血管平滑肌细胞、单核巨噬细胞表达vegf［911］ ，说明vegf参与了动脉粥样硬化有关的危险因素，如高血脂、高血压、高血糖、高同型半胱氨酸血症导致动脉粥样硬化的过程。
u937细胞是一种人单核/巨噬细胞株，常用于动脉粥样硬化发病机制的研究，用oxldl刺激u937细胞可制作可靠、稳定的单核/巨噬细胞源性泡沫细胞模型［12］。该泡沫细胞模型避免了个体差异,也避免了从人体取材原代细胞培养的麻烦，能为研究泡沫细胞提供大量稳定可靠的细胞材料。u937细胞无经典的a类清道夫受体，但存在b类清道夫受体cd36。本实验用80 μg/ml oxldl刺激u937细胞48 h，通过油红o染色发现泡沫细胞形成。用trizol一步法抽提细胞的总rna并进行rtpcr发现经oxldl刺激后形成的u937泡沫细胞vegf mrna表达较对照细胞组明显增加，差异有统计学意义。夹心抗体酶联免疫定量法检测vegf蛋白表达量发现，与u937细胞对照组相比，u937泡沫细胞组vegf蛋白水平升高了1.52倍，差异有统计学意义。本实验的oxldl对单核/巨噬细胞vegf mrna及蛋白表达的影响与以往的报道相符。以往的报道多是单纯的从单核/巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞角度来考虑的，而本研究则是从泡沫细胞角度来观察vegf的表达情况。泡沫细胞是动脉粥样硬化的重要特征，泡沫细胞的vegf表达可能更具有病理意义。本实验提示了oxldl诱导的泡沫细胞vegf表达可能在动脉粥样硬化发生、发展过程中起一定作用。
angⅱ能促使动脉粥样硬化斑块形成，血管紧张素转换酶抑制剂（acei）可抑制angⅱ生成从而具有抗动脉粥样硬化的作用。acei还具有稳定斑块作用，动物实验表明它不仅能降低斑块体积，还能减少巨噬细胞聚集发生率和增加细胞外基质，但这种有益的效应不能完全用降血压作用来解释。hope试验结果表明，acei雷米普利能显著减少高危冠心病病人的心血管不良事件，提示雷米普利具有抗炎、稳定斑块的作用。europa也揭示了培哚普利防治冠心病的作用，能显著减少主要终点事件（心血管死亡、急性心肌梗死和血运重建）。europa亚组研究（pertinent）进一步阐明了培哚普利的可能机制［13］：（1）减少angⅱ和肿瘤坏死因子a（tnfα）水平；（2）显著增加缓激肽水平；（3）上调内皮型一氧化氮合酶（enos）的活性并降低内皮细胞凋亡率；（4）降低血管性血友病因子（vwf）水平。本实验结果发现oxldl刺激的u937泡沫细胞vegf mrna及蛋白水平表达显著增加。在加入acei培哚普利后，随着浓度（0.01、0.10、1.00 μmol/l）的增加，u937泡沫细胞表达vegf mrna及蛋白逐渐降低，差异有统计学意义。本实验证实了培哚普利体外干预泡沫细胞可从转录、翻译角度呈浓度依赖性降低vegf表达水平，培哚普利有可能通过降低泡沫细胞vegf的表达来发挥治疗动脉粥样硬化、稳定斑块的作用。murakami等［14］报道急性心肌梗死发作36 h内给予培哚普利或坎地沙坦，并不能显著降低外周血vegf水平。本研究与该报道不同，原因可能为急性心肌梗死具有严重的缺血缺氧，而缺氧是vegf表达的强刺激，vegf表达对缺血心肌侧枝循环的建立有帮助，是一种代偿性保护机制，可能acei降低泡沫细胞vegf的程度不足以抵消外周血vegf升高的程度。
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第5篇：单细胞生物的定义范文
【摘要】
探讨NFκBp65和ICAM1在甲状腺肿瘤中的表达及相关性分析。方法：收集武汉大学人民医院及十堰市太和医院病理科1999年至2004年存档蜡块40例， 均为手术切除后诊断明确的甲状腺肿瘤， 其中，男20例，女20例，年龄23～71岁(平均43.8岁)；按照WHO标准组织学分类: 乳头状腺癌(PTC)12例，滤泡性腺癌(FTC)10例，髓样癌(MTC)10例，未分化癌(UTC)8例; 按照AJCC标准临床病理分期:Ⅰ期12例， Ⅱ期10例，Ⅲ期11例，Ⅳ期7例。同时取甲状腺瘤旁组织15例及正常甲状腺组织5例作对照。患者术前均未行放疗或化疗。采用组织学及免疫组织化学SP法，分别对乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌、甲状腺瘤旁组织及正常甲状腺组织的组织学结构变化、相关NFκBp65因子和ICAM1进行了观察，利用HPIAS2000图像分析系统测定了NFκBp65和ICAM1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果： NFvκB p65和ICAM1在乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌细胞胞浆内表达强；NFκB p65和ICAM1在甲状腺瘤旁组织中表达极弱或无表达；NFκB p65和ICAM1在正常甲状腺组织中表达极弱或无表达。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05 )。经q检验，乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P＜0.01 )；甲状腺瘤旁组织与正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P＞0.05)。结论：①NFκBP65具有调控ICAM1的表达作用；②NFκBp65和ICAM1与甲状腺肿瘤的发生、发展有密切的联系。
【关键词】 NFκB p65 ICAM1 甲状腺肿瘤 免疫组织化学
甲状腺肿瘤作为一种较常见的内分泌肿瘤，其中大部分为良性，但约有5%为恶性，即各种甲状腺癌。由于甲状腺肿瘤起病较隐匿，生物学特性多变，故鉴别诊断困难，容易误诊。目前随着分子和蛋白质水平研究的不断进展，已发现许多与肿瘤的发生、发展、转移及预后有关的分子标志物，其中NFκB和ICAM1是近几年来研究较多的，NFκB和ICAM1不仅可以作为用于诊断甲状腺肿瘤的因子，并可以利用NFκB抑制物的研究为肿瘤的治疗开辟一条新路。本研究应用免疫组织化学方法研究了NFκB和ICAM1在甲状腺肿瘤中的表达并进行了相关性分析，探讨NFκBp65和ICAM1与甲状腺肿瘤的发生、发展的联系。
1 材料与方法
1.1 材料来源
收集武汉大学人民医院及十堰市太和医院病理科1999年至2004年存档蜡块40例， 均为手术切除后诊断明确的甲状腺肿瘤。其中，男20例，女20例，年龄23～71岁(平均43.8岁)；按照WHO标准组织学分类: 乳头状腺癌(PTC)12例，滤泡性腺癌(FTC)10例，髓样癌(MTC)10例，未分化癌(UTC)8例；按照AJCC标准临床病理分期:Ⅰ期12例， Ⅱ期10例，Ⅲ期11例，Ⅳ期7例。同时取甲状腺瘤旁组织15例及正常甲状腺组织5例作对照。患者术前均未行放疗或化疗。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 主要试剂
浓缩型鼠抗人NFκBp65单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；浓缩型鼠抗人ICAM1单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新公司）；DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 常规HE染色
实验标本经常规石蜡包埋、切片、HE染色。
1.3.2 免疫组织化学染色SP法检测
NFκBp65和ICAM1抗原，具体步骤如下：
① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；
② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；
③ NFκB、ICAM1采用微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×5min；
④ 正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应；
⑤ 一抗(NFκB，1: 200；ICAM1，1:150 )37℃孵育1h，PBS洗4×5min；
⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；
⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；
⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；
⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。
用PBS代替一抗作为阴性对照组。
1.4 免疫组织化学结果判断
① NFκBp65以胞核和胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，ICAM1以胞膜和胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。② 采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对NFκBp65和ICAM1的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1.5 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q 检验，检验水准α为0.05。
2 结果
2.1 NFκBp65的表达
乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌细胞胞浆内有较多棕黄色颗粒，NFκBp65表达强；甲状腺瘤旁组织细胞胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积， NFκBp65表达极弱或无表达；正常甲状腺组织细胞胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积，NFκBp65表达极弱或无表达。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05 )。经q检验，乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P＜0.01) ；甲状腺瘤旁组织与正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P＞0.05)。见表1。表1 甲状腺癌、甲状腺瘤旁组织及正常甲状腺组织NFκBp65表达的平均光密度和阳性面积率(略)注：* 乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与瘤旁组织比较，P
2.2 ICAM1的表达
乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌细胞胞膜和胞浆内有较多棕黄色颗粒，ICAM1表达强；甲状腺瘤旁组织细胞胞膜和胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积，ICAM1表达极弱或无表达；正常甲状腺组织细胞胞膜和胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积，ICAM1表达极弱或无表达。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05 ）。经q 检验，乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P＜0.01） ；甲状腺瘤旁组织与正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P＞0.05)。见表2。表2 甲状腺癌、甲状腺瘤旁组织及正常甲状腺组织ICAM1表达的平均光密度和阳性面积率(略)注：* 乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与瘤旁组织比较，P
3 讨论
NFκB最早是1986年被Sen和Baltimore［1］提出并鉴定的一种转录因子，其命名是基于它能结合在细胞免疫球蛋白K轻链基因增强子的相应位点上。到目前已发现NFκB家族有5类：NFκB1（p50/p105）、NFκB2(p52/p1O0)，p65(Re1A)、Re1B和CRel。NFκB的主要存在形式为p50和p65组成的二聚体，p50是与DNA结合的部位，p65参与基因转录的起始调节，并可促进p50与DNA结合。当p50与细胞质内抑制蛋白IκB结合，可掩盖p50上核定位信号，当NFκB处于p50、p65与抑制蛋白IκB结合的多聚体时，为非活化状态，IκB抑制其活性。当细胞受到TNF、IL等异常刺激时，NFκB被过度地激活，细胞的正常信号转导发生改变，某些下游基因被异常激活，导致细胞癌变。随后的研究发现NFκB在多种细胞中都有表达，并能被多种细胞外的刺激活化，参与多种基因的转录调控、与炎症反应、免疫应答、以及细胞的增生、转化和凋亡等重要的生理病理过程关系密切，是细胞激活的标志［2～5］。
已有多项研究表明，NFκB因子的持续活化可作为包括乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠癌、胰腺癌，前列腺癌以及黑色素瘤等多种实体肿瘤的标志［6，7］，Sovak等［8］在乳腺癌的研究中发现NFκB不仅高表达于未分化乳腺癌中，并且随临床分期增高、转移发生愈早，其表达越显著，提示NFκB的功能异常不仅可介导乳腺癌的发生，还可能对乳腺癌侵袭生长和转移进程施加影响。
我们采用免疫组织化学染色SP法检测了40例甲状腺肿瘤患者的癌组织及对照组15例甲状腺瘤旁组织与5例正常甲状腺组织中NFκBp65的表达，结果显示甲状腺乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P
ICAM1为免疫球蛋白家族成员之一，是一种细胞表面单链糖蛋白，在细胞膜上分细胞外段、跨膜区段和短的细胞内区段。细胞外段含有5个椭圆体，以非成对形式存在的同源结构区、是淋巴细胞功能相关抗原1（LFA1）的配体。ICAM1的分子量为80～115ku，基因位于19号染色体，ICAM1分布在内皮细胞、纤维母细胞、肾上皮细胞等，是参与介导细胞间粘附、识别的重要粘附分子［11］。ICAM1（CD54）广泛表达于单核细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞、人体癌细胞表面，能通过与其配体β2整合素LFA1（淋巴细胞功能相关抗原，CD11a/CD18）和Mac1（巨噬细胞1，CD11b/CD18）的结合而促进T细胞活化及白细胞从血管内向炎症部位浸润，在炎症和免疫反应中起重要作用。同时ICAM1在肿瘤浸润转移中的作用也引起了研究人员的重视，ICAM1表达于淋巴管、血管内皮细胞和白细胞表面，可与其他细胞表面的淋巴细胞功能相关抗原(1FA)结合，使这些细胞与内皮细胞等稳定黏附，当肿瘤细胞发生浸润、转移时，淋巴细胞和白细胞分泌如IL1、TNF等细胞因子杀灭癌细胞，同时也激活了淋巴管、血管内皮细胞内NFκB，而内皮细胞存在NFκB激活ICAM1启动子的部位，NFκB的过度活化可使内皮细胞ICAM1活化增加，进入血液或淋巴结的癌细胞与淋巴细胞竞争性地与内皮细胞结合［12］，使癌细胞能在淋巴结或其他脏器中黏附、生长、增殖。另一方面，ICAM1的过度活化可促使过多可溶性ICAM1进入血液，竞争性结合白细胞表面的受体，抑制了血液循环中ICAM1/LFA依赖的主要组织相容性复合物1（MHC1）类抗原对游离癌细胞的免疫识别作用，从而使癌细胞逃避免疫监视，更容易发生侵袭和转移［13］。另外，癌细胞内活化的NFκB还可诱导IL6和尿激酶纤溶酶原激活物，调控其周围的成纤维母细胞基质产生血管生成因子(VEGF)和细胞外基质降解酶，促进肿瘤细胞的浸润和转移［14］。
我们用免疫组织化学染色SP法同时检测了40例甲状腺肿瘤患者的癌组织及对照组15例甲状腺瘤旁组织与5例正常甲状腺组织中ICAM1的表达。研究结果显示40例甲状腺癌患者的癌组织中，乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P
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第6篇：单细胞生物的定义范文
关键字：shRNA表达载体RNA干涉HIF1基因
RNA干涉（RNA interference， RNAi）是将双链RNA（dsRNA）导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。它是转录后基因沉寂（PTGS）的一种。1998年， Fire等[1]在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现， 由正义和反义RNA退火形成的dsRNA引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义RNA强10倍以上。dsRNA引起的基因表达抑制不是正义或反义RNA引起的基因表达抑制在数学上的叠加， 这就说明dsRNA触发了细胞内的一些反应机制， 从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果。当时， 他们就把这种现象命名为RNAi。RNAi的应用谱非常广泛， 从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫， 其次就是果蝇。哺乳动物细胞的RNAi应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。Wianny等[2]将dsRNA用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了RNAi。Sayda等[3]用人工合成的21ntRNA二合体在培养的哺乳动物细胞成功进行了RNAi。Brummelkamp等[4]利用载体表达的shRNA在许多培养的人源， 猴源和鼠源的哺乳动物细胞的RNAi实验中取得了成功。
在真核细胞内， RNA聚合酶III能指导短RNA的表达和RNA聚合酶III结合的启动子有H1， U6等。目前， 这两种启动子都被尝试作为表达短RNA的工具。本实验旨在克隆得到的H1启动子的基础上构建一个能稳定表达shRNA的真核载体。然后针对HIF1基因mRNA设计靶标， 在培养的SGC7901细胞（胃癌细胞系）内进行RNAi实验， 以观察新建的pWH1载体在基因沉默中的使用效率。这将为以后新基因的功能研究和基因治疗奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 pEGFPC1质粒为CLONTECH公司产品； 各种限制性内切酶为NEB公司产品。T4连接酶、 Pfu DNA聚合酶和DL 2000 DNA marker为TaKaRa公司产品。各种引物均由北京赛百盛公司合成。SGC7901细胞由全军消化病研究所保存。Superscript II反转录试剂盒购自Invitrogen公司； 兔抗人HIF1多抗、 兔抗人βactin多抗和Western blot Luminol Reagent为Santa Cruz公司产品。Top10菌种由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 以pEGFPC1为框架构建shRNA表达载体pWH1 （1）用Ase I和Mlu I双酶切， 去掉pEGFPC1质粒上PCMV， EGFP， MCS 和SV40polyA等片段， 剩余的部分作为构建pWH1的框架。在Ase I和Mlu I之间加上一个接头DNA序列， 该段接头DNA由下面2条引物退火形成（退火温度： 39.5℃）： 序列1： 5′TAATGGAATTCGAAGCTTA3′； 序列2： 5′CGCGTAAGCTTCGAATTCCAT3′。（2）通过PCR从人血细胞基因组DNA获得H1 RNA基因Promoter[5]。取新鲜血液20 mL， 以1300 r/min离心15 min， 取淡黄层细胞（白细胞）重悬于15 mL抽提缓冲液（10 mmol/L TrisCl pH8.0， 0.1 mmol/L EDTA pH8.0， 20 mg/L胰RNA酶， 5 g/L SDS）， 37℃温育1 h。加蛋白酶K至终浓度为100 mg/L， 温和混匀。50℃水浴中放置3 h。冷却至室温后， 用等体积酚和氯仿抽提后， 加入0.2体积10 mol/L乙酸铵和2体积的乙醇， 放置30 min， 12000 r/min离心10 min。700 mL/L乙醇洗涤2次， 空气中晾干。加入1 mL TE（pH8.0）溶解DNA， 此即人血细胞基因组DNA。以此DNA为模板， PCR引物为： P1： 5′CCATGGAATTCGAACGCTGACGTC3′（含EcoR I位点）； P2： 5′GCAAGCTTAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC3′ （含Hind III， Bgl II位点）。 PCR产物通过EcoR I和Hind III两个酶切位点克隆入pUC19质粒， 进行序列验证。（3）pWH1载体的构建： PCR产物用EcoR I和Hind III双酶切， 克隆入同样用这两种酶双酶切的上述框架载体。新载体命名为pWH1。
1.2.2 用pWH1进行沉默HIF1基因的表达 （1）以人HIF1 cDNA基因为靶标的引物设计： 选取人HIF1 cDNA基因（GenBank登录号： AF304431）中的512～530核苷酸为靶标， 设计两条引物。序列如下： 引物1： 5′GATCCCCTGAAGTGTACCCTAACTAGTTCAAGAGACTAGTTAGGGTACACTTCATTTTTGGAAA3′； 引物2： 5′AGCTTTTCCAAAAATGAAGTGTACCCTAACTAGTCTCTTGAACTAGTTAGGGTACACTTCAGGG3′。（2）构建针对HIF1基因的shRNA表达载体pWH1HIF1。将上面合成的两条引物用TE（pH8.0）稀释成0.5 nmol/μL。各取5 μL混匀， 沸水中放置10 min， 缓慢冷却至室温4℃-20℃保存备用。用限制性内切酶Bgl II和Hind III对质粒pWH1做双酶切。用T4连接酶对pWH1质粒和退火产物进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。铺于含卡那霉素的LB平板上， 37℃培养24 h。挑取单克隆并提取质粒。用限制性内切酶EcoR I和Hind III对候选阳性克隆质粒做双酶切鉴定。阳性克隆质粒命名为pWH1HIF1。（3）转染胃癌细胞系SGC7901： SGC7901细胞用RPMI1640培养液（含100 mL/L小牛血清）在37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。转染前24 h将处于对数生长期的细胞重新接种于6孔板（瞬时）和24（稳定）孔板中， 贴壁细胞在长满底面积80%时进行转染。转染按照LipofectamineTM2000试剂说明书操作。于转染后48 h收集6孔板内细胞，做为瞬时转染细胞表型鉴定用。于转染后72 h按1∶10比例传代于60 mm直径培养皿中， 然后加入适量（400～1000 mg/L）G418进行筛选， 2周后挑取单个细胞集落， 扩大培养， 然后做为稳定转染细胞表型鉴定用。（4）RTPCR检测HIF1基因的mRNA水平： 待6孔板内细胞生长至底面积90%～95%时， 收集细胞。参照Gibco公司TRIzol试剂使用方法提取细胞RNA， 溶于20 μL DEPC水内。用SuperScriptTM II RT kit参照其使用说明进行cDNA第1条链的合成。人βactin内对照引物： P1： 5′GGCCGGGACCTGACTGACTAC； P2： 5′TCTTTGCGGATGTCCACGTC（长度331 bp）。人HIF1 RTPCR引物： P3： GATCTCGGCGAAGTAAAGAATCTG； P4： AGAAAATTTCATATCCAGGCTGT（长度680 bp）。PCR反应条件： 95℃ 1 min（94℃ 40 s； 56℃ 40 s； 72℃ 40 s）×26 cycle； 72℃ 10 min； 4℃保存。（5）Western blot检测HIF1的蛋白水平： 已处理的转染细胞样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后， 100 伏转移3 h至NC膜上， 50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h， 依次加入1∶2500稀释的兔抗人一抗4℃孵育过夜， 1∶5000稀释的HRP标记的鼠抗兔二抗作用2 h， 加入Luminol试剂， 并以X光片捕捉HRP催化Luminol试剂所产生的激发光。
2 结果
2.1 shRNA表达载体pWH1构建的实验结果
2.1.1 从人血细胞基因组DNA中扩增得到H1 RNA基因Promoter PCR反应体系： DNA模板2 μL， P11 μL， P21 μL， Taq 0.5 μL， dNTP 2 μL， 10×buffer 5 μL， H2O 38.5 μL， 总体积50 μL。PCR反应条件为： 94℃ 5 min（94℃ 30 s； 45℃ 45 s； 72℃ 30 s）×5 cycle； （94℃ 30 s； 56℃ 45 s； 72℃ 30 s）×25 cycle； 72℃ 2 min； 4℃保存。10 g/L琼脂糖凝胶电泳后， 在250 bp左右可以见到一扩增条带（图1）， 大小与理论预计一致。
图1 H1基因启动子的PCR扩增电泳结果（略）
Fig 1 AGE analysis of PCR products encoding H1 gene promoter
M： DNA marker DL 2000； 1： PCR of H1 gene promoter.
2.1.2 重组质粒pUC19H1的酶切鉴定 上述PCR产物经EcoR I和Hind III双酶切后， 克隆入pUC19载体。阳性克隆命名为pUC19H1（图2）。pUC19H1质粒递交上海生工公司测序， 结果显示， 与GenBank的H1基因启动子序列（登录号： X16612）完全一致。
图2 重组质粒pUC19H1的酶切鉴定结果（略）
Fig 2 AGE analysis of recombinant plasmid pUC19H1 digested with EcoR I and Hind III
M： DNA marker DL 2000； 1， 2： pUC19 H1.
2.1.3 pWH1双酶切鉴定 pEGFPC1质粒经Ase I和Mlu I双酶切后， 加上一段由2条引物退火形成的接头DNA， 此框架质粒命名为pWK。再利用接头上带有的EcoR I和Hind III酶切位点将pUC19H1质粒上的目的片段亚克隆到这个框架质粒上。新的质粒命名为pWH1（图3）。
图3 pWH1质粒的酶切鉴定结果（略）
Fig 3 AGE analysis of plasmid pWH1 digested with EcoR I and Hind III
M： DNA marker DL 2000； 1： pWK； 2： pWH1.
2.2 pWH1HIF1的酶切鉴定结果 将合成的2条引物退火后， 从Bgl II和Hind III两个酶切位点克隆到质粒pWH1。新的质粒命名为pWH1HIF1。用EcoR I和Hind III对pWH1HIF1进行双酶切鉴定（图4）， 阳性克隆切下约310 bp片段， 阴性克隆切下约250 bp片段。
图4 pWH1HIF1质粒的酶切鉴定（略）
Fig 4 AGE analysis of recombinant plasmid pWH1HIF1 digested with EcoR I and Hind III
M：DNA marker DL 2000； 1： pWH1HIF1； 2： pWH1.
2.3 pWH1HIF1瞬时转染SGC7901细胞 将准备好的pWH1HIF1质粒5 μg用脂质体方法转染入SGC7901细胞， 48 h后收集细胞。用TRIzol试剂抽提细胞RNA， 进行RTPCR。12 g/L琼脂糖凝胶电泳结果（图5）可以看出， RNAi后和对照组相比mRNA被明显降解。
图5 pWH1HIF1瞬时转染SGC7901细胞后的RTPCR结果（略）
Fig 5 RTPCR result of SGC7901 cells transient transfected with pWH1HIF1
M： DNA marker； 1： SGC7901； 2： SGC7901transfected with pWH1； 3： SGC7901 transfected with pWH1HIF1.
2.4 pWH1HIF1稳定转染SGC7901细胞 将准备好的pWH1HIF1质粒2 μg用脂质体方法转染入SGC7901细胞， 按有限稀释法挑取单克隆细胞。用TRIzol试剂抽提细胞RNA， 进行RTPCR。12 g/L琼脂糖凝胶电泳结果（图6）可以看出， RNAi后和对照组相比mRNA被明显降解。
图6 pWH1HIF1稳定转染SGC7901细胞后的RTPCR结果（略）
Fig 6 RTPCR result of SGC7901 cells stable transfected with pWH1HIF1
M： DNA marker； 1： SGC7901 transfected with pWH1HIF1； 2： SGC7901 transfected with pWH1； 3： SGC7901.
2.5 Western blot检测HIF1基因的RNA干涉效果 挑取3个稳定转染pWH1HIF1质粒的SGC7901单克隆细胞。用抗HIF1抗体进行Western blot和化学发光显色（图7）可见， RNAi后和对照组相比HIF1的蛋白表达水平明显下降。
图7 pWH1HIF1稳定转染SGC7901细胞后的Western blot结果（略）
Fig 7 Western blot result of SGC7901 cells stable transfected with pWH1HIF1
1-3： 3 SGC7901 cell clones transfected stably with pWH1HIF1； pWH1： SGC7901 cell clone transfected stably with pWH1.
3 讨论
RNAi一经发现， 立即成为科学研究的一大热点。这是因为RNAi这个生物领域的新兴事物， 本身具有它的神秘性， 同时又具有广阔的应用前景[6]。RNAi已经被应用到线虫的系统基因组研究上， RNAi作为一个工具， 它的应用范围可以从单细胞的原生动物一直扩展到人。使哺乳动物细胞产生特定基因的功能丧失表型， 对于新基因功能研究、 新蛋白质药物的开发和基因治疗等方面都具有重要的意义。本实验构建的pWH1载体， 能在真核细胞内表达shRNA， shRNA可以有效模仿siRNA， 使目标蛋白的mRNA发生特异性的降解。pWH1可被广泛用于真核细胞的RNAi实验模型。
缺氧诱导因子1（HIF1）是机体细胞在低氧环境中产生的一种结合DNA蛋白质因子， 在低氧信号中起到一个重要的中介作用， 通过转录水平参与对低氧反应基因的调控， 从而使机体对低氧刺激作出复杂的病理生理反应[7]。HIF1在多种肿瘤中广泛存在， 它与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点缺氧反应元件（hypoxia response element， HRE）结合， 从而启动靶基因的转录表达， 同肿瘤的增殖、 转移密切相关[8]。Talks等[9]发现大多数恶性肿瘤细胞中有HIF1表达， 且HIF1在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘表达明显增多。本实验在胃癌细胞系SGC7901中利用所构建的pWH1载体成功降低了HIF1基因的表达， 这对研究胃癌的发生、 增殖、 多药耐药和治疗等均有重要的意义。
【参考文献】
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第7篇：单细胞生物的定义范文
【关键词】 骨肉瘤； 氨甲喋呤； 咖啡因； 肿瘤细胞，培养的
Abstract［Objective］To observe whether or not caffeine can improve the cyto-toxicity effect of methotrexate (MTX) on osteosarcoma cell line.［Method］Osteosarcoma cell(OS-732)were incubated with no drug，caffeine，MTX or MTX adding caffeine separately，and were named as control group，caffeine group，MTX group and mixing group respectively.The ratios of cells on G2M phase of each group were measured with flow cytometry after 48 h incubation and the cell inhibition ratios were measured with the MTT colorimetric analysis after 72 h incubation.［Result］The ratios(%)of cells on G2M phase were control group（23.210±0.416)，caffeine group（23.120±0.440)，MTX group（28.770±0.531）and mixing group（0.105±0.002）(P＜0.01，except control group between caffeine group)，the absorbency of survival cell(A value)were control group（0.411±0.006)，caffeine group（0.401±0.006）；MTX group（0.304±0.007）and mixing group（0.105±0.002）(P＜0.01).［Conclusion］Caffeine can improve the cyto-toxicity effect of MTX on osteosarcoma cell line.
Key words：osteosarcoma; MTX; caffeine; tumor cell，incubation
肿瘤细胞在化疗药物作用后，有的会出现细胞周期受阻的现象，包括G1停滞，S期蓄积，G2M期阻滞等。G2M期阻滞被认为是细胞的一种保护性调节，可以使DNA受损的细胞获得充分的修复时间，从而顺利地进入下一个细胞周期，避免被诱导凋亡。咖啡因是近年来发现的肿瘤化疗增加剂，主要作用机理是缩短G2M期阻滞。氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后会不会出现G2M期阻滞，加入咖啡因能否增加其细胞毒性，目前尚缺乏试验依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
OS-732细胞株购于北京积水潭医院创伤骨科研究所，RPMI 1640干粉及胰酶购于美国Cibco公司，氨甲喋呤购于浙江万马药业有限公司，咖啡因购于美国Sigma公司，FCM美国Coulter公司生产，酶联免疫检测仪美国Coda公司生产，CO2孵箱Sheldon Manufacturing公司生产，倒置显微镜重庆光学仪器厂生产，96孔培养板Nunclon International公司生产。
1.2 方 法
1.2.1 细胞培养
细胞常规培养于体积分数为10%新生小牛血清（经56 ℃30 min水浴灭活）的RPMI 1640培养液中，其中含有青霉素100 IU/ml及链霉素100 μg/ml，在37 ℃体积分数为5%CO2、95%空气、饱和湿度的CO2孵箱内闭式培养。取传代后第3 d处于指数增殖期的细胞备用。
1.2.2 细胞处理
取生长良好的细胞，以少量胰蛋白酶将贴壁细胞消化、离心，倒去上清液，加入适量RPMI 1640培养液，用吸管反复吹打均匀制成细胞悬液。根据析因试验设计原理将细胞株分为4组，1组无药组（阴性对照组）；2组咖啡因组，培养液内加入咖啡因，浓度为5.0 mmol/L；3组氨甲喋呤组，培养液内加入氨甲喋呤，浓度为320 μg/ml；4组混合用药组，培养液内同时加入浓度为5.0 mmol/L的咖啡因与浓度为320 μg/ml的氨甲喋呤。同时调整细胞浓度为2×105/ml。各组细胞加入96孔培养板，每组设3复孔，每孔200 μl。置37 ℃体积分数为5%CO2、95%空气、饱和湿度的CO2孵箱内闭式培养，供测量各组药物的细胞抑剂率。同时各组取相同浓度的细胞悬液10 ml于培养瓶中在37 ℃体积分数为5%CO2、95%空气、饱和湿度的CO2孵箱内闭式培养供观察G2M期比例。
1.2.3 流式细胞仪（FCM）对细胞周期进行分析
将置于培养瓶内的各组细胞于48 h取出，以0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，至贴壁细胞间出现筛状间隙为止。弃去消化液，加Hank’s液。用吸管将细胞自瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。短时低速离心（1 000 r/min，5 min)。弃上清，加冷PBS（pH 7.4)，均匀吹打，并短时低速离心3次（1 000r/min，5 min)以去除悬液中的细胞碎片。再次加入冷PBS（pH 7.4)均匀吹打，制成单细胞悬液。将细胞液以500目尼龙网过滤，以去除重叠成团的细胞。调整细胞浓度为1×104/ml。在4 ℃冰箱内进行荧光染色后用流式细胞检测G2M期细胞百分比。每组细胞测3次，用SPSS 12.0统计软件，对结果进行方差分析。
1.2.4 MTT法测定各组细胞的A值及抑制率
72 h后将96孔板取出，每孔再加1∶2稀释的MTT应用液（5 mg/ml)20 μl，继续培养4 h后弃除上清液，于每孔中加入10%的二甲亚砜10 μl，振荡5 min，直到结晶完全溶解，液体呈蓝紫色，然后在酶联免疫检测仪上以570 nm波长测定吸光度（A）值。并可根据A值计算出各组的细胞抑制率。用SPSS 12.0统计软件，对结果进行方差分析，观察各组间的差异及药物间交互作用是否具有统计学意义。
2 结 果
2.1 FCM分析各组48 h G2M期细胞所占比例（表1）
1组与2组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义（P＜0.01）。单独应用5.0 mmol/L的咖啡因对G2M期无明显影响，单独应用氨甲喋呤时出现G2M细胞比例增高，二者联合应用后G2M期细胞比例降低。表1 各组48 h G2M期细胞所占比例（略）
2.2 MTT法测定各组细胞72 h A值（表2）
各组间差异具有统计学意义（P＜0.01）。单独应用5.0 mmol/L的咖啡因对骨肉瘤细胞有轻微影响，320 μg/ml的氨甲喋呤对骨肉瘤细胞有较大抑制作用，二者联合应用后可明显减少A值，对肿瘤细胞抑制作用最明显。根据统计分析二者联合具有交互作用，差异有统计学意义（P＜0.01）。表2 MTT法测定各组细胞的A值（略）
3 讨 论
新辅助化疗的开展及新的细胞毒性药物的使用使包括骨肉瘤在内的许多肿瘤治疗有了明显改观〔1〕，尽管如此，肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药性仍是造成化疗失败的主要原因。传统上对肿瘤耐药及逆转剂的研究主要集中在细胞膜/核膜蛋白，即药物输出泵：如P糖蛋白（Pgp）、多药耐药相关蛋白（MRP）和肺耐药相关蛋白（LRP）。已有的逆转剂大部分是针对细胞P糖蛋白（Pgp)，通过抑制P糖蛋白（Pgp)对进入细胞内化疗药物的外排作用，提高细胞内化疗药物的水平，来增加化疗药物的杀伤作用。如钙离子通道阻滞剂，环孢酶素A及其衍生物，抗激素类化合物等，但其效果仍欠理想。
近年来研究表明，DNA作为多种抗癌药物攻击的靶分子，其损伤修复能力异常与肿瘤耐药性的形成有着密切关系。因此，从DNA损伤修复的研究入手，将为肿瘤治疗和耐药性逆转开辟新的途径。周期运转中的细胞有一种识别DNA损伤的能力，一旦出现DNA损伤，细胞周期就会受阻，包括G1停滞、S期蓄积和G2M期阻滞，从而给细胞修复提供足够的时间。细胞周期素(Cyclin)为重要的细胞周期蛋白的调控基因。目前发现的Cyclin有Cyclin A～H。Cyclin B主要出现在G2M期〔2〕。其表达的产物细胞周期蛋白与P34cdc2蛋白复合物被称为有丝分裂促进因子(maturation promoting factor，MPF)。在正常细胞，G2后期MPF氨基酸被磷酸化或去磷酸化，从而具有激酶活性，进而诱导一系列底物(如核层蛋白，H1组蛋白，核仁蛋白等)磷酸化，引导核膜崩解，染色质凝聚等有丝分裂所具有的变化。细胞通过抑制cyclin B表达，或抑制P34cdc2激酶活性，使细胞不能进行有丝分裂，从而产生G2M期阻滞。Yao SL〔3〕等发现，咖啡因有活化受抑制的MPF的能力。因此可以缩短甚至取消G2M期阻滞，从而可以逆转肿瘤耐药。该原理在国外已经临床使用，并取得不错的临床效果〔4〕。国内也开始对此进行研究。万双林〔5〕等发现安全浓度的咖啡因在骨肉瘤细胞株(OS-732)顺铂热化疗中具有增效作用，并发现咖啡因能促进经顺铂热化疗后的骨肉瘤细胞由G2/M期向G0/G1期移行，导致G2/M期缩短，细胞不能进行足够的DNA修复而进入分裂期，从而加速细胞死亡。李钧等〔6〕的研究表明，咖啡因有促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。
目前在临床上使用更多的Rosen T12〔5〕化疗方案，其中氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后，是否出现G2M期阻滞，咖啡因能否缩短甚至取消G2M期阻滞，二者联合应用能否增加肿瘤细胞抑制率，尚未见报道。作者根据析因试验设计原因，设置4个实验组，用FCM测定各组细胞于48 h G2M期比例，用MTT法来测定各组药物对肿瘤细胞作用72 h后残存细胞吸光度，结果显示，单纯应用5.0 mmol/L咖啡因，对肿瘤细胞G2M期比例无明显影响，对肿瘤细胞有轻微抑制；单纯应用氨甲喋呤，增加G2M期比例，对肿瘤细胞有抑制作用；二者合用后G2M期比例有明显降低，对细胞抑制明显。根据统计分析，二者间交互作用具有统计意义（P＜0.01）。本实验提示，氨甲喋呤与咖啡因联合，可以提高对骨肉瘤细胞株的抑制作用。但由于体外细胞培养不能模仿体内的三维结构，不能准确地反映药物在人体中的全面作用，因此，本试验结果需要更进一步的验证。
【参考文献】
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第8篇：单细胞生物的定义范文
【关键词】 CD56+急性单核细胞白血病；高白细胞血症；髓外浸润
CD56不但是神经细胞黏附分子的异构体， 而且还是自然杀伤细胞的重要标志。基于表达CD56的造血系统肿瘤是常见的恶性疾病， 且侵袭性非常高[1]， 本课题作者在对CD56+表达对急性单核细胞白血病的临床效果进行探究时， 抽取了在本院就诊的32例AML-M5患者， 随机分为CD56+组与CD56-组， 各16例， 进而对两组临床生物学特征、诱导缓解率、缓解时间及复发率进行对比观察， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 抽取2006年9月～2013年10月在本院就诊的32例急性单核细胞白血病患者， 随机分为CD56+组与CD56-组， 各16例。其中， 在CD56+组中， 男7例， 女9例， 年龄18～69岁， 平均年龄49.2岁；在CD56-组中， 男8例， 女8例， 年龄17～70岁， 平均年龄49.4岁。所有患者依照WHO标准， 均符合急性单核细胞白血病症诊断标准， 且两组患者在年龄、症状等方面比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。
1. 2 方法 ①主要是对两组患者的临床生物学特征、诱导缓解率、缓解时间及复发率进行对比观察， 观察标准为是否存在明显的差异性。②使用“柔红霉素、阿糖胞苷”或者是“去甲氧柔红霉素、阿糖胞苷”等诱导缓解治疗， 在2个疗程达到完全缓解之后， 对大剂量阿糖胞苷或者阿糖胞苷等药物交替使用， 其目的是对治疗进行巩固；而在2个疗程没有达到完全缓解者， 需要使用米托蒽醌、依托泊苷及阿糖胞苷等药物方案进行化疗[2]。③2个疗程间的间隔为3周；完全缓解， 骨髓当中的原始细胞
1. 3 统计学方法 所有数据采用SPSS16.0软件进行统计学处理。计量资料以均数± 标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P
2 结果
CD56+组有7例高白细胞血症， CD56-组有3例高白细胞血症；CD56+组有13例髓外浸润， CD56-组有9例髓外浸润。CD56+组诱导缓解率56.25%， 复发率68.75%， 平均缓解时间为（4.2±2.1）个月， 与CD56-组比较差异有统计学意义（P
3 讨论
CD56当被称作为神经细胞黏附分子， 在神经内分泌系统与神经外分泌系统中有着广泛表达， 并且和细胞黏附功能间关系明显， 可介导一些细胞行为， 例如：细胞移居、穿膜及新环境定居等[3]。临床医学表明， 表达CD56的造血细胞恶性肿瘤不但是常见的恶性疾病， 而且还具有很高的侵袭性， 经常伴随髓外浸润症状。对于CD56急性单核细胞白血病患者来讲， 预后效果极差。
有学者经研究发现， 其预后有关的几个因素分别是年龄、白细胞计数、不良细胞遗传学以及CD56表达等。在这其中， CD56的表达对生存时间来讲有很大的影响， 充分认识到， 致使预后的主要不良因素为CD56+的表达， 其主要因素还具有独立性。本课题作者抽取2006年9月～2013年10月在本院就诊的32例AML-M5患者， 随机分为CD56+组与CD56-组， 各16例。对两者临床生物学特征、诱导缓解率、缓解时间及复发率进行对比观察。研究表明：CD56+组有7例高白细胞血症， CD56-组有3例高白细胞血症；CD56+组有13例髓外浸润， CD56-组有9例髓外浸润。CD56+组诱导缓解率56.25%， 复发率68.75%， 平均缓解时间为（4.2±2.1）个月， 与CD56-组比较差异有统计学意义（P
综上所述， CD56+急性单核细胞白血病患者非常容易患高白细胞血症与髓外浸润， 缓解率低， 缓解期间短， 复发率较高， 且预后差， 和CD56-患者相比较差异具有统计学意义（P
参考文献
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第9篇：单细胞生物的定义范文
【摘要】
目的: 构建含人野生型及致病突变A30P、 A53T SNCA基因的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA， 并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、 A53T αsynuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。方法: 通过RTPCR方法扩增SNCA基因， TA克隆后测序。在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR I、 BamH I两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C（Ala30 Pro）、 G209A（Ala53Thr）的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA， 并以PCR、 双酶切、 测序鉴定。以重组质粒pEGFPC3SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞; 以G418进行筛选; 以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、 A53T αsynuclein的单克隆PC12细胞株， 并以稳定转染pEGFPC3的PC12细胞作为对照组细胞， 通过RTPCR、 Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株。结果: PCR、 酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFPC3SNCA构建成功。RTPCR、 Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达。结论: 成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA; 成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、 A53T αsynuclein的单克隆PC12细胞株。
【关键词】 α synuclein（SNCA） 致病突变 真核表达载体pEGFP C3 稳定转染 PC12细胞
[Abstract] AIM: To construct recombinant eukaryotic expression vectors pEGFPC3SNCA containing human wildtype (WT) and pathogenic mutations A30P， A53T αsynuclein (SNCA)， and to obtain monoclonal PC12 cell lines overexpressing human wildtype and pathogenic mutations A30P， A53T αsynuclein by stable transfection. METHODS: Human wild type SNCA gene was cloned by using RTPCR. By TA extension cloning， the gene was ligated with Tvector and sequenced. Based on it， the recombinant eukaryotic expression vectors containing wild type SNCA synonymous mutation or its G88C (Ala30Pro) and G209A (Ala53Thr) pathogenic mutation were constructed by sitedirected mutagensis using primer variance in mononucleotide. And different recombinant plasmids pEGFPC3SNCA were identified with PCR， restriction enzyme digestion and DNA sequencing. PC12 cells were transfected with different recombinant plasmids pEGFPC3SNCA by liposome transfection method， screened with G418， and subcloned by limited dilution method to obtain different monoclonal PC12 cell lines stably overexpressing human wildtype， A30P or A53T αsynuclein， respectively， and PC12 cells stably transfected with pEGFPC3 were used as control group. These monoclonal PC12 cell lines were identified with RTPCR， Western blot and fluorescence microscopy. RESULTS: According to result of PCR， the double digestion and gene sequencing， it was comfirmed that recombinant eukaryotic expression vectors containing wild type SNCA synonymous mutation or its Ala30Pro and Ala53Thr pathogenic mutation had been constructed successfully. By means of RTPCR， Western blot and fluorescence microscope， it was comfirmed that objective gene sequences in PC12 cells were stably overexpressed. CONCLUSION: The recombinant pEGFPC3SNCA vectors containing wild type SNCA synonymous mutation or its Ala30Pro and Ala53Thr pathogenic mutations had been constructed successfully. The transfected monoclonal PC12 cells are obtained in which three SNCA gene isoforms had stable expression.
[Keywords]αsynuclein（SNCA）; pathogenic mutation; eukaryotic expression vector pEGFPC3; stable transfection; PC12 cell
多巴胺能神经元中出现路易小体（Lewy body， LB）是帕金森病（Pakinson’s disease， PD）的特征性病理改变， SNCA基因编码的αsynuclein在病理状态下聚集形成不溶性纤维， 构成了LB的主要成分， 而Ala30Pro、 Ala53Thr的致病突变与家族性PD相关[1， 2]。αsynuclein及其Ala30Pro、 Ala53Thr致病突变体在PD的病理机制中可能起着十分重要的作用， 我们通过构建含绿色荧光蛋白的SNCA同义突变基因及其Ala30Pro与Ala53Thr致病突变基因的真核表达载体pEGFPC3SNCA质粒， 并以此转染PC12细胞， 建立稳定表达该基因蛋白及变异蛋白的多巴胺能PC12细胞模型。
1 材料和方法
1.1 材料 克隆载体pTZ57R与真核表达载体pEGFPC3购自Promega公司; E.coli DH5α菌株、 培养基RPMI1640购自Invitrogen公司; PC12细胞株购自中国科学院上海细胞所; 小牛血清购自杭州四季青公司; Taq酶购自TaKaRa公司; 总RNA提取试剂为Gibco的TRIzol试剂; 反转录PCR试剂盒购自Fermanas公司; Lipofectamine2000转染试剂盒购自GbicoBRL公司; G418购自Mediatech公司; 胰蛋白酶、 兔抗人αsynuclein mAb购自Sigma公司; HRP标记的羊抗兔IgG的二抗购自DAKO公司; ECL显色剂购自Amersham公司。
1.2 方法
1.2.1 PCR引物的合成 根据GenBank中相应cDNA基因序列， 自行设计引物， 委托上海英骏生物有限公司合成， 引物序列: P1: 5′GTGTGGTGTAAAGGAATTCATT3′; P2: 5′CGCGGATCCAGAAACTGGGAGCAAAGATA3′。
1.2.2 总RNA的提取及RTPCR扩增 在50 μL反应体系中加入10 ×buffer 5μL， 10 mmol/L， dNTP 1 μL， 引物1、 2 各1 μL， 5 U/μL Taq酶0.5 μL， 模板cDNA 2 μL， ddH2O 40 μL， 计反应体系50 μL。PCR反应条件为94℃ 5 min， 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 45 s， 后3步反复进行30个循环。扩增产物用Uuiq10柱式DNA胶回收试剂盒提纯。
1.2.3 野生型SNCA基因的TA克隆 取胶回收产物7.5 μL加入1 μL T vector、 1 μL 10×ligation buffer、 0.5 μL T4 DNAligase， 混合为10 μL连接反应体系于4℃过夜。将10 μL连接液与200 μL感受态细菌混匀， 冰浴30 min后于42℃水浴90 s， 置冰浴2 min。加入600 μL不含氨苄青霉素的LB培养液， 37℃、 225 r/min摇床45 min， 将细菌涂布于氨苄青霉素平板上， 37℃倒置过夜。取单克隆菌落加入含氨苄青霉素的LB(100mg/L) 37℃、 225r/min摇床8h， 用Uuiq10柱式质粒小抽提试剂盒抽取质粒， 作PCR及双酶切鉴定， 阳性者送检测序。
1.2.4 同义突变SNCA及Ala30Pro、 Ala53Thr致病突变SNCA的构建在野生型SNCA基因编码区内部存在EcoRI、 BamHI两酶切位点， 以野生型SNCA基因的TA克隆质粒为模板， 利用单核苷酸差异引物定点诱变法针对两酶切位点进行同义突变， 在此基础上同法构建G88C（Ala30Pro）、 G209A（Ala53Thr）已知致病突变体， 并对SNCA同义突变及Ala30Pro、 Ala53Thr致病突变基因进行TA克隆。
1.2.5 含同义突变及致病突变Ala30Pro、 Ala53Thr的SNCA基因重组真核表达载体pEGFPC3SNCA的构建 分别以SNCA同义突变及Ala30Pro、 Ala53Thr致病突变基因的TA克隆质粒为模板， 以P1、 P2引物， 以高保真Taq酶PCR扩增3种不同SNCA基因片段， 扩增条件同前。分别取相应提纯的PCR产物及pEGFPC3质粒5μL， 加入BamHI0.5μL、 EcoR I0.5 μL、 10×buffer2 μL、 ddH2O12 μL， 构成20 μL反应体系37℃ 酶切5 h。将3种不同SNCA的PCR双酶切产物电泳胶回收后分别与pEGFPC3空载体双酶切胶回收产物混合进行连接， 转化细菌后用Uuiq10柱式质粒小量抽提试剂盒抽取质粒， 作PCR扩增、 酶切及测序鉴定。
1.2.6 人同义突变（野生型）及致病突变Ala30Pro、 Ala53Thr SNCA基因在PC12细胞中的稳定过表达 PC12细胞长至80%融合后， 进行转染实验[3]。取2 μg质粒溶于100 μL无血清RPMI1640液， 再取3 μL脂质体溶于100 μL无血清RPMI1640， 静置5 min后将2液体混匀， 室温静置30 min; 培养细胞用无血清RPMI1640洗1次， 加800 μL无血清RPMI1640， 滴入转染混合液， 摇匀; 置37℃ 50 mL/L CO2的培养箱内培养5～24 h， 换液为RPMI1640(100 mL/L FCS)， 继续培养至总转染时间为48～72 h。pEGFPC3SNCA质粒转染PC12细胞48 h后， 加入含500 mg/L G418的选择性培养液， 2～3 d更换新的选择性培养液， 约5 d后见细胞死亡， 2周后见细胞克隆， 将具有G418抗性的细胞用200 mg/L G418维持培养基通过有限稀释法将细胞稀释至约1～30个/mL， 转移至96孔培养板中， 每孔加100 μL细胞悬液， 培养4～5 d后， 在显微镜下可见到小的细胞克隆， 期间更换选择性培养液， 第8～9天时， 肉眼可见细胞克隆。转移至24孔板继续用选择性培养液扩大培养。再用有限稀释法进行2次亚克隆。将单克隆细胞扩大培养备用， 并于荧光显微镜下观察摄片。
1.2.7 RTPCR检测转染PC12细胞中SNCA转录 收集筛选获得的阳性细胞， 用TRIzol抽提其总mRNA， 按TFermanas逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA， 取5 μL cDNA为模板， 用SNCA特异性引物扩增SNCA基因， 同时用转pEGFPC3的PC12细胞作阴性对照。
1.2.8 Western blot检测稳定转染的PC12pEGFPC3SNCA单克隆细胞αsynuclein的表达 将筛选获得的含同义突变及A30P、 A53T致病突变SNCA基因的PC12pEGFPC3SNCA细胞单克隆分别胰酶消化， 用含200 μg/L G418的培养基37℃ 50 mL/L CO2培养3 d后消化收集细胞， PBS洗涤后加入蛋白裂解液超声裂解， 4℃、 12000 r/min离心20 min， 取上清分装， 取适量稀释后进行蛋白定量， 部分存于-80℃待用。用上样缓冲液将各样品蛋白稀释至相同浓度， 100℃水浴5 min后进行SDSPAGE分离， 转NC膜， 脱脂奶粉4℃封闭1 h， 加入稀释的抗αsynuclein（1∶2500）抗体， 4℃过夜， 洗膜后加入HRP偶联的二抗作用1 h， ECL显色， X光片显影。BioRad Gel Doc XR凝胶成像仪读取， 并用Quantity One4.6软件处理。
2 结果
2.1 SNCA基因cDNA克隆及载体酶切鉴定结果 通过RTPCR方法成功克隆了SNCA基因的cDNA序列， 目的基因为481 bp（图1）， 所提质粒pTZ57R SNCA经EcoR I和BamH I双酶切鉴定正确（图2）， 含同义突变及致病突变Ala30Pro、 Ala53Thr的SNCA基因重组pEGFPC3SNCA载体的构建所提质粒经EcoR I和BamH I双酶切鉴定正确(图3)。
图1 RTPCR扩增SNCA基因（略）
Fig 1 SNCA gene by RTPCR
1: DNA marker(DL 2000); 2: Objective band was 481 bp.
图2 pTZ57RSNCA双酶切（略）
Fig 2 The double digestion of pTZ57RSNCA
1: DNA marker (DL 2000); 2: The digestive product by EcoR I and BamH I (objective band was 460 bp， vector was 2800 bp).
图3 pEGFPC3SNCA双酶切（略）
Fig 3 The double digestion of pEGFPC3SNCA
1: DNA marker (DL 15000); 2: The digestive product by EcoR I and BamH I (objective band was 460 bp， vector was 4700 bp); 3: pEGFPC3SNCA (5160 bp).
2.2 对TA克隆载体及pEGFPC3SNCA表达载体测序 M13+通用引物对TA克隆载体进行测序， 同时用目的基因两端序列设计引物对pEGFPC3SNCA表达载体测序， 结果与期望序列一致， 编码Ala30Pro的GCA突变为CCA， 编码Ala53Thr的GCA突变为ACA。
2.3 荧光显微镜观察SNCA基因在PC12细胞中的蛋白表达 稳定转染野生型、 A30P与A53T的重组质粒pEGFPC3SNCA的PC12细胞株， 在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光， 表明野生型、 A30P与A53T的αsynuclein在PC12/pEGFPC3SNCA细胞中得到了表达， 转染空载体的PC12细胞也见到高丰度的绿色荧光， 而未转染的PC12细胞则未见到绿色荧光（图4）。
2.4 RTPCR检测稳定转染PC12细胞中SNCA基因mRNA的转录 转染野生型SNCA、 A30P SNCA与转染A53T的SNCA的PC12细胞中， 能扩增出481 bp的特异性片段， 以重组质粒为模板作PCR作为阳性对照，
而转染空载体pEGFPC3的PC12细胞未扩增出SNCA的目的基因条带（图5）。
2.5 Western blot检测稳定转染PC12细胞中SNCA基因的蛋白表达 Western blot结果显示， 转染野生型、 A30P与A53T的重组质粒pEGFPC3SNCA的PC12细胞中分别检测到Mr为40000的蛋白条带， 转染空载体的PC12细胞中未见αsynucleinGFP融合蛋白的条带， 而4株PC12细胞均可见GAPDH蛋白的表达（图6）。
图4 SNCA在PC12细胞中表达的荧光检测（略）
Fig 4 Detection of expression of SNCA in the PC12 cells under fluorescentmicroscope
A: PC12 cells/pEGFPC3WTSNCA; B: PC12 cells/pEGFPC3A30PSNCA; C: PC12 cells/pEGFPC3A53TSNCA; D: PC12 cells/pEGFPC3.
图5 RTPCR检测转染PC12细胞中SNCA基因mRNA的转录
Fig 5 RTPCR analysis of hSNCA mRNA in transfected PC12 cells
M: DNA marker(DL 2000); 1: PC12 cells/pEGFPC3; 2: PC12 cells/pEGFPC3WTSNCA; 3: PC12 cells/pEGFPC3A30PSNCA; 4: PC12 cells/pEGFPC3A53TSNCA; 5: PCR product from plasmid of WTSNCApEGFPC3.
图6 转染的PC12细胞中αsynucleinGFP融合蛋白的表达
Fig 6 Detection of expression of αsynucleinGFP in PC12 cells by Western blot
1: PC12 cells/pEGFPC3; 2: PC12 cells/pEGFPC3WTSNCA; 3: PC12 cells/pEGFPC3A30PSNCA; 4: PC12 cells/pEGFPC3A53TSNCA.
3 讨论
SNCA基因编码人类αsynuclein蛋白， αsynuclein的过表达、 错误修饰与折叠、 原纤维及纤维形成参与了多巴胺能神经元的损伤过程[4]。当前对αsynuclein的生理功能以及病理过程中的作用仍缺乏足够的认识， 为进一步探索人类αsynuclein及其2种致病突变Ala30Pro、 Ala53Thr体在多巴胺能细胞中的致病机制， 构建一个合理高效的细胞模型显得极为重要。PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤[5]， 由于PC12细胞可合成多巴胺（DA）， 并有单胺氧化酶A， 在其细胞膜上有DA受体及多巴胺转运体（DAT）， 具备了与中枢多巴胺能神经原相似的多巴胺合成、 代谢和运输系统， 所以PC12细胞常用作研究中枢多巴胺能神经元的离体细胞模型。为了进一步研究该基因的作用机制， 我们用构建的野生型及致病突变A30P与A53T的SNCA基因的重组真核表达载体pEGFPC3SNCA转染PC12细胞， 建立稳定表达该基因蛋白及变异蛋白的哺乳动物多巴胺能细胞模型。pEGFPC3是一真核表达载体， 在增强绿色荧光蛋白（EGFP）编码区的C端加多克隆位点， 使插入的基因所表达的蛋白与绿色荧光蛋白融合表达， 在荧光显微镜下可通过观察绿色荧光蛋白的表达而确定目的基因是否表达及蛋白定位等情况。本研究中选用阳离子脂质体介导[6]重组真核表达载体pEGFPC3SNCA转染PC12细胞， 此转染方法方便简单， 具有转染效率高、 无免疫原性、 整合和扩散性小、 容量大等优点， 可使目的基因在靶细胞中高效表达。通过此方法， 成功地将野生型及A30P与A53T致病突变SNCA基因导入了PC12细胞中， 并通过G418筛选， 获得了能稳定表达该野生型及A30P与A53T致病突变SNCA基因的转染克隆。RTPCR、 Western blot均鉴定有SNCA基因的mRNA表达与蛋白表达， 并以荧光显微镜观测到绿色荧光蛋白而看到αsynuclein在PC12细胞中的广泛分布与表达。从而为探讨该基因在多巴胺能细胞中的作用机制作了前期准备。
参考文献
[1] Polymeropoulos MH， Lavedan C， Leroy E， et al. Mutation in the alphasynuclein gene identified in families with Parkinson’s disease[J]. Science， 1997， 276(5321): 2045-2047.
[2] Kruger R， Kuhn W， Muller T， et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alphasynuclein in Parkinson’s disease[J]. Nat Genet， 1998， 18(2): 106-108.
[3] 穆 红， 王玉亮， 刘 蓉. 野生型p53基因在人肝癌细胞的表达及诱导凋亡[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(6): 758-759.
[4] Fujiwara H， Hasegawa M， Dohmae N， et al. αSynuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions[J]. Nat Cell Biol， 2002， 4(2): 160-164.
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