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宫颈癌端粒酶活性与患者诊断预后关系

宫颈癌端粒酶活性与患者诊断预后关系

【摘要】目的探讨宫颈癌人端粒酶RNA(hTERC)扩增和人端粒酶催化单位(hTERT)的表达与患者术后复发和生存的关系。方法选取2010年6月~2013年6月该院接受手术切除子宫的宫颈癌患者45例为观察组,因子宫肌瘤行子宫切除的正常宫颈组织患者45例为对照组。采用荧光免疫原位杂交和Westernblot检测两组hTERC扩增和hTERT蛋白质水平变化,并根据hTERC扩增情况比较阴性和阳性患者术后复发和生存的变化。结果观察组宫颈癌组织中hTERC扩增阳性率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Westernblot分析显示,观察组患者宫颈癌组织中hTERT蛋白质水平较对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。hTERT蛋白质阳性患者术后1年、2年和3年累积复发率明显高于阴性患者,差异有统计学意义(P<0.05),阳性患者术后1年、2年和3年累积生存率明显低于阴性患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论宫颈癌肿瘤组织中端粒酶处于激活状态,可作为诊断宫颈癌的辅助指标,同时可能与患者术后预后有关。

【关键词】宫颈癌;端粒酶;术后累积复发率;累积生存率

近年来提出的端粒酶假说是细胞癌变的早期事件,有望成为宫颈癌早期诊断的辅助标志〔1-2〕。端粒酶活性主要依赖于2个基因的表达,人端粒酶催化单位(hTERT)和人端粒酶RNA(hTERC)。研究显示〔3-4〕,端粒酶活性在许多肿瘤组织(乳腺癌、肺癌)中处于激活状态,参与肿瘤的发生和发展。有研究也显示〔5〕,端粒酶在宫颈癌肿瘤组织中表达阳性率较高,但对其在患者术后预后方面的报道较少。本研究系统分析端粒酶活性在宫颈癌早期诊断和预后方面的价值。

1资料与方法

1.1资料

选取我院2010年6月~2013年6月收治的因手术切除子宫的宫颈癌患者45例为观察组,因子宫肌瘤行子宫切除的正常组织患者45例为对照组。观察组年龄51~69岁,平均年龄(60.4±8.4)岁;对照组年龄50~71岁,平均年龄(61.4±9.4)岁;两组患者年龄、性别等差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准:①所有患者均经病理学和阴道镜检查进行诊断;②患者术前未接受其他任何形式的治疗;③所有患者均签署知情同意书;④本研究经本院医学伦理委员会许可,并监督。排除标准:①合并其他肿瘤者;②心、肝和肾功能异常者;③存在感染或免疫功能缺陷者。

1.2材料

双色位点特异性TERC/CSP3DNA探针购自北京金菩嘉医疗科技有限公司;20×SSC杂交缓冲液和胃蛋白酶K购自Sigma公司;封片剂购自碧云天生物科技有限公司;抗人hTERT小鼠单克隆抗体购自Santa公司;荧光原位杂交仪购自CVCytovisionAC.UNK;荧光显微镜和激光共聚焦显微镜均购自奥林巴斯公司;FISH分析软件购自德国LEICA公司;羊抗小鼠二抗购自北京中山金桥生物有限公司。

1.3实验方法

1.3.1FISH分析

hTERC扩增制备石蜡组织芯片,并在载玻片上做好标记,石蜡组织芯片56℃烘烤过夜,在二甲苯中脱蜡10min后,依次在100%、95%、70%的无水乙醇中水化5min,然后在蒸馏水中浸泡5min,并在水浴锅沸水中处理30min修复抗原表位。紧接着在室温条件下用2×SSC缓冲液漂洗组织芯片2次,每次5min;然后用胃蛋白酶K在37℃消化组织20min,结束后采用2×SSC缓冲液漂洗组织芯片2次,每次5min;用1%甲醛固定10min,再用70%、95%和100%的乙醇逐级脱水2min,56℃加热玻片,结束后再组织玻片上滴加5~10μl探针混合物,盖上盖玻片,用中性树脂封片。然后设置原位杂交仪,83℃变形5min,42℃杂交16h,结束后用2×SSC缓冲液漂洗组织芯片2次,每次5min;泡掉盖玻片,置于65℃0.5%NP-40的2×SSC缓冲液漂洗组织芯片2次,每次5min;再用70%的乙醇浸泡3min,自然干燥玻片。然后再用DAPI染色细胞核3min,避光处理10min,然后在荧光显微镜下观察结果。观察FISH结果,首先在低倍镜下找到细胞区域,然后在40×物镜下观察标本的治疗,最后在100×物镜下观察宫颈细胞的FISH结果。显微镜下GLPTERC标记为红色,CSP3标记为绿色。正常细胞可观察到细胞分裂间期细胞核中红色和绿色信号各有2个,而异常细胞可观察到红色信号大于2个,绿色信号不小于2个。

1.3.2阈值建立

以正常宫颈细胞建立组织细胞芯片,按照上述方法制备关于TERC基因的FISH实验,然后分析100个细胞,统计TERC、C-myc基因异常扩增的细胞比例。阈值计算=平均数+3×标准差。若观察组患者异常数目大于阈值则认为是hTERC扩增呈阳性,若异常数目低于阈值则认为是hTERC扩增呈阴性。

1.3.3Westernblot分析

hTERT表达水平取0.1g宫颈癌组织或正常宫颈组织,加入400μl组织裂解液,采用组织匀浆仪匀浆后,置于冰上静置30min后,12000r/min离心15min,上清部分加入5×Load-ingbuffer,在沸水中煮沸15min后,进行SDS-PAGE,电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上,用5%脱脂牛奶封闭30min后,用抗人hTERT小鼠单克隆抗体(1∶1000)4℃包被过夜,次日,用PBST洗涤3次,每次5min,再用HRP标记的羊抗小鼠二抗室温孵育1h,结束后用PBST洗涤3次,每次5min;在PVDF膜上涂上发光液,在暗室进行显影。以GAPDH作为内参。分析hTERT蛋白的相对表达水平。

1.3.4随防情况

观察组患者术后第1年每3个月来我院检查1次,第2年每半年检查1次。电话随访患者生存情况,随访10~36个月,平均随访(21.4±8.9)个月。

1.4统计学分析

采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量数据采用(x±s)表示,计量资料比较采用t检验,计数资料比较采用χ2检验,累积复发率和累计生存率比较采用Kaplan-Meier和Log-Rank进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组宫颈组织hTERC扩增情况采用FISH分析hTERC扩增情况,对照组hTERC扩增5例,阳性率11.11%,观察组hTERC扩增32例,阳性率为71.11%,观察组患者宫颈癌组织中hTERC扩增阳性率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2两组宫颈组织hTRET表达情况对两组宫颈组织中hTERT蛋白的表达水平进行Westernblot分析,观察组患者宫颈癌组织中hTERT蛋白的表达水平明显高于对照组宫颈组织,差异有统计学意义

2.3hTERC扩增与患者术后复发和生存的关系对观察组hTERC扩增阳性和阴性患者进行跟踪随访,对其宫颈癌术后复发和术后生存率进行比较分析,hTERC扩增阳性患者术后1年、2年和3年的累积复发率分别为12.5%(4/32),21.88%(7/32)和43.75%(14/32),hTERC扩增阴性患者术后1年、2年和3年的累积复发率分别为7.69%(1/13),15.38%(2/13)和15.38%(2/13)。hTERC扩增阳性患者术后累计复发率明显高于阴性患者,差异有统计学意义(P<0.05),见图2A。hTERC扩增阳性患者术后1年、2年和3年的累积生存率分别为84.38%(27/32),65.63%(21/32)和46.88%(15/32),hTERC扩增阴性患者术后1年、2年和3年的累积生存率分别为92.31%(12/13),84.62%(11/13)和69.23%(9/13)。hTERC扩增阳性患者术后累计生存率明显低于阴性患者(P<0.05),差异有统计学意义。

3讨论

全世界每年将近50万宫颈癌新发病例,中国每年约有13.5万新发病例,死亡率位居女性肿瘤第2位,严重威胁女性健康〔6〕。目前,临床上用于诊断宫颈癌的手段较单一,存在缺陷〔7〕。端粒酶在许多肿瘤组织中活性异常,可能与肿瘤的发生和进展相关〔8〕。端粒是真核细胞染色体上一点重复的基因序列,他的主要功能是维持染色体的稳定性和完整性,避免其发生融合、降解或重组等变化。其随着细胞分裂逐渐变短,减小到一定阈值细胞会自动衰老死亡〔5〕。当端粒酶活性异常活跃和人端粒酶RNA扩增异常时,可导致细胞一直处于分裂增殖状态,最终导致细胞异常增生,导致肿瘤发生〔9〕。目前,端粒酶在宫颈癌组织中的活性及表达情况是基础临床研究的热点。本研究采用FISH技术和Westernblot分析对宫颈癌组织中hTERC扩增和hTERT蛋白的表达情况进行分析。结果显示,在宫颈癌组织中hTERC扩增明显增加,高于对照组;hTERT蛋白在宫颈癌组织中表达水平明显高于正常宫颈组织,提示,宫颈癌组织中端粒处于异常活跃的状态,可能成为导致宫颈癌发生的主要原因之一,同时提示,通过检测宫颈组织中端粒酶的活性可以作为宫颈癌分子诊断的主要方法。手术治疗宫颈癌仍然会出现一部分复发,降低了患者术后生存期〔10〕。将hTERC扩增阳性和阴性患者进行分析随访,发现hTERC扩增阳性患者术后累积复发率明显高于阴性患者,术后累积生存率明显低于阴性患者,提示,hTERC扩增情况可能与患者术后预后存在密切关系,可作为临床宫颈癌术后预后诊断的一个辅助标志。值得注意的是,本研究样本数量较少,有望通过增加样本数量进一步探讨hTERC扩增和预后的相关性。宫颈癌组织中hTERC扩增异常,且hTERT蛋白处于高表达状态,参与了宫颈癌的发生,且hTERC的扩增与患者术后预后密切相关。

4参考文献

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10RydzewskaL,TierneyJ,ValeCL,etal.Neoadjuvantche-motherapyplussurgeryversussurgeryforcervicalcancer〔J〕.CochraneDatabaseSystRev,2012,12:CD007406.

作者:吴衡慧 张菊新 单位:河南省人民医院妇产科

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