探究对胶质瘤细胞产生影响的因素

1．方法

(1)本实验将C6细胞分成Q0、Q50、Q100和Q1504个组，Q0组加适量二甲亚砜(DMSO，即槲皮素溶剂，每2mlDMEM全培养基中加1μl二甲亚砜，低浓度DMSO对细胞生长等无影响)处理，Q50、Q100和Q150槲皮素的浓度分别为50、100、150μmol/L。然后将其放入37℃、5%的CO2孵箱中进行培养。

(2)将三维细胞培养基质胶Matrigel置冰上或放于冰箱内2～8℃过夜解冻，吸管轻轻吹打，避免吸入气泡。将用高糖DMEM做1∶5稀释后的Matrigel涂于Insert细胞生长面，150～200μl/cm2，37℃作用30min，备用。将饥饿12～24h后的C6细胞制备细胞悬液，离心弃培养液，PBS洗1～2遍，用含0．1%FBS的DMEM配养基重悬细胞，将细胞密度调至于5×105个/厘米2。取200μl细胞悬液加入Transwell上室，取含10%FBS的高糖DMEM培养基500μl加入下室。37℃、5%的CO2培养36h后，用棉签擦去Matrigel和上室内细胞，甲醛固定10min。0．1%结晶紫室温下孵育10min，清水漂洗3遍以上。将Transwell小室翻过来底面朝上置显微镜下观察拍照，随机选取8～10个视野进行计数。

(3)将饥饿12～24h后的C6细胞制备细胞悬液，离心弃培养液，PBS洗1～2遍，用含0．1%FBS的DMEM配养基重悬细胞，将细胞密度调至于5×105个/厘米2。取200μl细胞悬液加入Transwell上室，取含10%FBS的高糖DMEM培养基500μl加入下室。37℃、5%的CO2培养36h后，用棉签擦去上室内细胞，甲醛固定10min。0．1%结晶紫室温孵育10min，清水漂洗3遍以上。将Transwell小室翻过来底面朝上置显微镜下观察拍照，随机选取8～10个视野进行计数。

(4)将培养好的C6胶质瘤的细胞培养基半量换液，加入1ml含20μmol/LEdU的全培养基，其最终工作浓度为10μmol/L。将其置于37℃，5%CO2的培养箱中培养24h后弃去培养液，加入1ml3．7%甲醛室温下固定15min，弃去固定液，用3%BSA洗两遍。然后再加入1ml0．5%TritonX－100室温下孵育20min;弃去通透液，用3%BSA洗两遍。然后加入0．5mlClick－iT反应混合液，室温下避光振荡30min。弃去反应液，用3%BSA洗1遍。然后再加入1ml1×Hoechst33342反应液室温下避光反应30min。用PBS清洗两遍后，将其置于激光共聚焦显微镜下拍照分析并计算其增殖细胞百分比。

(5)将收集的悬浮细胞室温下400g离心5min。弃上清，加入250μl胰酶溶液(A液)，用手指轻弹将其混匀，室温下反应10min。然后再加入200μl的胰酶抑制剂和核糖核酸酶的混合液(B液)，用手指轻弹将其混匀，室温下反应10min。最后加入200μl冰冷的PI染液(C液)用手指轻弹将其混匀，4℃避光反应10min。然后将其在3h内上流式细胞仪检测。

2．统计学方法

数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS13．0进行方差齐性检验及单因素方差分析(One－WayANOVA)，P＜0．05为差异有统计学意义。

3结果

1.槲皮素处理36h后，Q50、Q100和Q150组的侵袭细胞比率分别为(45．81±7．55)%、(13．63±3．15)%和(4．63±1．12)%，与对照组(100%)相比，槲皮素处理组的侵袭细胞比率显著降低(P均＜0．01)，槲皮素能显著降低C6胶质瘤细胞的侵袭能力，且具有一定的浓度依赖性。槲皮素处理12h后，与对照组(100%)相比，Q50、Q100和Q150的迁移细胞比率分别为57．98%±6．84%、33．60%±3．91%和11．79%±3．27%(P均＜0．05)，槲皮素能显著降低C6胶质瘤细胞的迁移能力，且具有一定的浓度依赖性。

2．槲皮素处理24h后，Q50、Q100和Q150组的增殖细胞百分比分别为21．49%、7．30%和1．12%，与对照组(45．37%)相比，其增殖细胞百分比显著降低(P＜0．01)，且呈现一定的浓度依赖性。

4.讨论

本研究发现槲皮素(处理时间为24h)通过抑制核苷酸类似物Edu掺入到其细胞核中来抑制C6胶质瘤细胞的增殖，并将其阻断在S期。以上研究均证实槲皮素可明显抑制大鼠C6胶质瘤细胞的增殖，但阻断其细胞周期的环节存在差异，这可能与操作时处理的时间及其细胞生长状况密切相关;早期研究发现槲皮素可将癌细胞阻断在G0/G1期、S期或者是G2/M期;槲皮素阻断细胞在S期还是G2/M期依赖于细胞的类型和对其处理的程度。该研究对胶质瘤侵袭与转移的临床研究具有一定的指导意义。综上所述，槲皮素在体外对C6胶质瘤细胞有抑制侵袭、迁移、增殖的作用，但其作用机制和应用于临床治疗还需要进行进一步的研究。

作者：苑召虎 张 彦 王惠丽 姚 芳 胡子有 颜晓慧 吴炳义 单位：南方医科大学