干细胞研发与运用

胚胎干细胞(ES细胞)是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。成体干细胞主要有造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和神经干细胞。用于移植的细胞多数来源于外周血、骨髓和脐带血，也有部分来源于骨骼肌和脂肪组织。虽然胚胎干细胞代表了最原始的全能干细胞，在组织工程和细胞治疗中具有广阔的应用前景，但是它有分化调控机制的复杂性和来源途径的伦理学争议;成体干细胞在成体组织中己经保留了发育过程中出现的完整干细胞谱，为干细胞发育机制研究提供了较为理想的模型，但成体干细胞的分化发育潜能己受到限制。随着干细胞研究的逐步深入，涌现出一些有别于传统干细胞的新型干细胞，下面就新型干细胞的研究进展做一综述。

1新型干细胞

1.1诱导多能干细胞(iPS)

2006年日本京都大学Ya-manaka等［1］率先报道了iPS细胞的研究。他把Oct3/4，Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似［2］。2007年体细胞转变成“iPS细胞”的成果发表。Hanna等［3］用来自患病小鼠尾巴的皮肤细胞产生了iPS细胞，然后用健康的基因取代了涉及镰刀形红细胞贫血症的基因，研究人员将它们输给供体小鼠，这些细胞在小鼠身上开始产生健康的血细胞，这些小鼠的疾病症状因此有了改善。将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞［4］。2009年，中国科学家利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性［5］。因干细胞技术和体细胞核移植技术不同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有伦理学的问题。利用iPS技术可以用患者自己的体细胞制备专用的干细胞，因此不会有免疫排斥问题。然而，iPS的研究还只是起步阶段，有许多技术难题有待解决。例如现在的iPS技术主要采用病毒载体引入细胞因子，这些病毒随机插进基因组后存在着激活致癌基因或抑制抑癌基因的可能性，许多方法中还使用了c-Myc原癌基因，因此存在较大的致瘤风险。

1.2SP细胞

利用Hoechst染料进行造血干/祖细胞的流式细胞仪分析时，常会发现一群分布特殊的细胞，经过紫外激发后用双波长(450nm和675nm以上波长)监测，观察到这群细胞发出微弱的蓝色和红色荧光，在流式二维分析点阵图上，呈彗星状分布在造血干/祖细胞主群的一侧，因此被称为侧群(SP)细胞。随着对SP细胞研究的不断深入，人们对SP细胞的分布、生物学特征、表型标记、信号转导机制及其与肿瘤发生的关系等方面的认识都取得了较大进展。近年来大量研究显示，除了造血系统和血液外，SP细胞在人和动物的许多重要组织器官，如肝、肺、脾、肾、脑、神经等均有广泛分布，其功能除了参与造血系统的重建外，还与相应组织更新与再生、器官系统的自我重建以及成体干细胞的多器官可塑性有关。SP细胞作为干/祖细胞的一种特殊类型，其发育和分化状态可能介于胚胎和成体干细胞之间，因此仍具有很强的多向分化潜能和增殖特性;同时，由于SP细胞广泛分布于各种组织器官中，含量丰富，又具有较明确的表型标记和分离纯化方法，所以较好地解决了其来源问题，这对推动干细胞理论研究与发展具有重要的意义，可在应用研究方面为组织工程和细胞治疗提供新的干细胞材料来源，也为组织再生修复与原位重建提供了新思路。

1.3Muse细胞

日本学者出泽真理和藤吉好泽率领的研究小组发现的新型干细胞被命名为“Muse细胞”［6］。由于这种干细胞是天然细胞，所以不容易癌变，安全性高于培养时需要植入基因的iPS细胞。存在于成人皮肤和骨髓组织中，含有“SSEA-3”蛋白质的细胞，它们能够发育成神经、平滑肌、骨骼肌、肝脏等各种组织。将这种细胞移植到实验鼠受损的皮肤和肝脏以后，这种细胞就与患部结合，成长为受损组织特有的细胞。具有多潜能细胞的特性，但其增殖性不高。这些细胞保留体内的分化能力，与胚胎干细胞不同的是，对免疫缺陷小鼠不构成睾丸畸胎瘤。因为这些细胞很容易获得，能进入细胞的分化与所有三个胚层的特性，而不需要导入外源基因。因此，对这些细胞为基础的治疗和生物医学研究具有巨大潜力。

2新型干细胞在心血管疾病方面的应用

2001年有学者首次报道将骨髓干细胞移植到梗死小鼠的心脏中，局部骨髓干细胞能够分化产生新的心肌细胞，提高心脏功能。随后有学者报道将骨髓单个核细胞移植到梗死缺血的心脏上，可以提高心肌梗死(MI)患者的心脏功能。此后，心肌再生疗法治疗成为当今全球的主要热点。

2.1治疗冠心病

干细胞疗法为MI的治疗带来了希望。在过去10年进行临床前和临床试验表明，几种类型的干/祖细胞可以减少梗死面积，改善心脏收缩功能。其机制包括:(1)新血管的形成，(2)介质的释放有利于血管生成和抗炎因子的释放，(3)心肌细胞功能恢复。心脏祖细胞和多能干细胞具有不容置疑的分化成心肌细胞和其他相应细胞的能力。因此，以促进细胞的存活及体内植入的干细胞疗法是极其重要的发展战略。目前已完成两种细胞类型的Ⅲ期临床试验:即骨骼肌成肌细胞和骨髓单核细胞(BM-MNCs)。在前者，由于骨骼肌成肌细胞增加了心律失常的风险，使得它的益处受到影响。多数研究表明，BM-MNCs治疗组对照组比较疗效显著。iPS细胞被广泛地应用于各种疾病的研究。由于它具有胚胎干细胞的特性，所以可以被诱导分化为心肌细胞，血管内皮细胞甚至是窦房结细胞。Gai等［7］报道，将人皮肤中成纤维细胞进行基因编程后制作出iPS细胞，在活体上形成与胚胎干细胞一样的能够跳动的心肌细胞。iPS细胞可以从患者自身提取，可将基因重新编程，因此对于基因遗传性心脏病，如心肌病、长QT综合征、Brugarda综合征等疾病重新编程，从而治疗该类疾病。它的应用不受伦理限制，无免疫排斥反应，具有其他移植细胞不具备的优点。但由于是病毒载体转染基因，有可能将病毒转染到宿主细胞，引起宿主病毒感染，甚至有畸胎瘤的风险。目前iPS细胞还用于基础研究中，尚未在临床应用。心脏SP细胞(CSP)可分为SCA1(+)/CD31(－)和SCA1(+)/CD31(+)SP细胞。利用荧光激活细胞分选，逆转录聚合酶链反应，检测细胞的增殖、分化和迁移等方法，在小鼠MI模型上SCA1(+)/CD31(+)CSP细胞表达干细胞和血管内皮细胞的特定基因，并驻留在血管中。这些细胞在体外和体内均能够增殖、分化、迁移和血管化。SDF-1α体外诱导这些细胞的迁移。更重要的是，MI后，SCA1(+)/CD31(+)SP细胞可以从非缺血区迁移到缺血区心肌，并形成筒状血管的结构［8］。研究结果表明，SCA1(+)/CD31(+)的心脏SP细胞能够从非缺血性心脏部位迁移到受损的心肌急性缺血性损伤的心肌细胞。SDF-1α/CXCR4系统可能会在这些细胞的迁移中发挥的重要作用［9］。

2.2治疗心力衰竭

目前心力衰竭的治疗方法有限，细胞疗法是一种很有前途的战略。心肌干/祖细胞具有的各种潜力，修复受损的心脏组织，包括更换(组织移植)、恢复(激活原位心肌祖细胞，旁分泌作用)和再生(干细胞植入形成新的细胞)。治疗心力衰竭的目的是补充收缩失败的心肌单元，但能够被成功诱导出cardiomyogenesis的数量有限，因此改善心功能程度较小，此时旁分泌机制可能更重要。目前对于治疗最有效的细胞类型仍不清楚，iPS细胞具有很大的潜力。宿主心肌细胞融合和结合的途径仍然有争议。作用机制、细胞类型或交付方式，时间效力和细胞治疗，药物治疗或辅助治疗剂量，以及最佳的细胞类型等还需要更多的研究。有研究表明，啮齿类动物和人类骨髓来源的SP细胞均能够在心肌上存活，人类骨髓衍生的SP细胞在增强左室收缩功能方面优于普通骨髓单个核细胞［10］。有关SP细胞的研究目前还在基础研究中，其是具有研究和开发潜力的一类新型干细胞。

2.3治疗心律失常

起搏生物基因疗法治疗病态窦房结综合征，心脏传导阻滞等缓慢性心律失常已经取得了长足进步［11－12］。此外，人类iPS细胞已被核实为药物筛选有用的工具。很多个体对心脏活性药物的反应有差异，利用ES细胞源性心肌细胞或iPS细胞来源的心肌细胞，筛选出个性化定制的抗心律失常药物，可以个体化治疗心律失常患者。

2.4心脏瓣膜的组织工程

组织工程心脏瓣膜的三大要素有种子细胞，细胞支架材料和细胞支架的复合，重构。应用生物可降解聚合物支架构建组织工程心脏瓣膜，已在动物实验中取得初步结果，为心脏瓣膜研制开辟了新途径。用于组织工程心脏瓣膜的种子细胞有内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞以及ES细胞。组织工程心脏瓣膜研究已经取得了很大进展，但是还有很多问题尚待解决和克服。如如何进一步提高种子细胞与支架的黏附力，干细胞定向分化中是否会引起基因突变和肿瘤等问题。然而，随着干细胞技术和组织工程技术的日益发展，这些难题终将得到解决。

2.5治疗肺动脉高压

肺动脉高压是一种病死率极高的疾病，患者从确诊到死亡，平均存活时间仅2.8年。由于患者症状不明显，往往确诊时已是病情后期。目前国内外均无特别有效的方法，少数大医院尝试肺移植治疗，但手术风险大，费用高，而且供体来源受限。干细胞治疗肺动脉高压是通过抗增殖和治疗性血管新生，达到降低肺动脉压的作用。有人经体外分离提取内皮祖细胞，培养扩增后，将内皮祖细胞通过导管回输到肺动脉，从而促进血管新生，改变内皮功能。由于是自体移植，手术安全性好，并发症少。该研究领域可能在不远的将来在干细胞治疗上会有突破［13］。

总之，心脏干细胞和祖细胞修复的研究给人类心肌再生治疗带来很大的希望。直到现在，若干问题还有待于进一步研究，如移植的细胞类型、剂量、时间和交付心肌干细胞的治疗模式等。管如此，细胞疗法仍一种很有前途的治疗方法。人类不断探索的脚步永远不会停止。具有很大发展潜力的iPS细胞和新的干细胞的开发，给人们很大的鼓舞。相信在不远的将来，人类会充分利用干细胞的优势为人类造福。