茶多酚的提取工艺探究

在国内外有关复合酶解辅助乙醇提取茶多酚的研究少见报道，因此本实验采用复合酶解技术辅助乙醇提取单枞茶中茶多酚，以茶多酚的提取率为参考指标，探求酶法辅助乙醇提取茶多酚的最佳工艺条件，为单枞茶中茶多酚的提取提供一种新的方法。

材料与方法

1材料与试剂

单枞茶，兴宁市南华现代农业有限公司；复合植物水解酶（纤维素酶和果胶酶），酶活力：1500NCU/g，诺维信（中国）生物技术有限公司；福林酚、碳酸钠均为分析纯，广州市成硕试剂有限公司。

2仪器和设备

752N型紫外线可见光光度计，上海精密科学仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；PL203电子分析天平，梅特勒-托利多；SHZ-Ⅲ型循环水真空抽滤机，上海亚荣生化仪器厂。

3工艺流程

单枞茶→粉碎→过筛（60目）→酶解预处理→乙醇提取→抽滤→滤液→含量测定

4实验方法

酶添加量的选择：精确称取同一批次的单枞茶叶粉末1.000g于7个三角瓶中，在酶解pH4.8，酶解温度50℃，酶解时间3h，料液比1︰40，乙醇质量分数70%，提取温度70℃，提取时间1h的条件下，考察不同酶添加量（1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%）对单枞茶茶多酚提取率的影响。酶解pH值的选择：精确称取同一批次的单枞茶叶粉末1.000g于5个三角瓶中，在酶添加量3.0%，酶解温度50℃，酶解时间3h，料液比1︰40，乙醇质量分数70%，提取温度70℃，提取时间1h的条件下，考察不同酶解pH（3.2、4.0、4.8、5.6、6.4）对茶多酚提取率的影响。酶解时间的选择：精确称取同一批次的单枞茶叶粉末1.000g于5个三角瓶中，在酶添加量3.0%，酶解温度50℃，酶解pH4.8，料液比1︰40，乙醇质量分数70%，提取温度70℃，提取时间1h的条件下，考察不同酶解时间（1、2、3、4、5h）对茶多酚提取率的影响。酶解温度的选择：精确称取同一批次的单枞茶叶粉末1.000g于5个三角瓶中，在酶添加量3.0%，酶解pH4.8，料液比1︰40，乙醇质量分数70%，提取温度70℃，提取时间1h的条件下，考察不同酶解温度（30、40、50、60、70℃）对茶多酚提取率的影响。

乙醇浓度的确定：精确称取5份同一批次的单枞茶叶粉末1.000g于最优酶解条件（酶解温度60℃、酶添加量3.5%、酶解时间3h、酶解pH值4.8）预处理后，在料液比1︰40，提取温度70℃，提取时间1h的条件下，考察不同乙醇质量分数（30%、40%、50%、60%、70%）对茶多酚提取率的影响。提取温度的确定：精确称取5份同一批次的单枞茶叶粉末1.000g于最优酶解条件（酶解温度60℃、酶添加量3.5%、酶解时间3h、酶解pH值4.8）预处理后，在料液比1︰40，乙醇质量分数60%，提取时间1h的条件下，考察不同提取温度（30、40、50、60、70℃）对茶多酚提取率的影响。提取时间的确定：精确称取6份同一批次的单枞茶叶粉末1.000g于最优酶解条件（酶解温度60℃、酶添加量3.5%、酶解时间3h、酶解pH值4.8）预处理后，在料液比1︰40，乙醇质量分数60%，提取温度60℃的条件下，考察不同提取时间（15、30、45、60、75、90min）对茶多酚提取率的影响。料液比的确定：精确称取6份同一批次的单枞茶叶粉末1.000g于最优酶解条件（酶解温度60℃、酶添加量3.5%、酶解时间3h、酶解pH值4.8）预处理后，在乙醇质量分数60%，提取温度60℃，提取时间1h的条件下，考察不同料液比（1︰10、1︰20、1︰30、1︰40、1︰50、1︰60）对茶多酚提取率的影响。

5测定方法

茶样品水分含量的测定参照文献[19]，茶多酚含量的测定参照文献[20]。

结果与分析

1酶解预处理单因素实验结果与分析

如图1~图4所示，茶多酚的提取率随着酶添加量增加和酶解时间的延长呈现先增加后基本保持稳定的趋势，一方面是由于纤维素酶和果胶酶可破坏茶叶的细胞壁与细胞间质，促使茶多酚等胞内物质快速扩散溶出，提高有效成分的提取率；另一方面是由于酶解反应完全，茶多酚充分提取出来，延长时间和增加酶添加量，对提取率的影响不大。茶多酚的提取率随酶解温度和pH值呈现先增加后减少的变化规律。因此，实验选择酶添加量的范围为2.5%~3.5%，酶解时间为2~4h，酶解pH值为4.0~5.6，酶解温度为40~60℃，进行下一步的正交实验。

2酶解预处理正交设计实验结果及分析

在单因素实验的基础上，按照尽量减少实验次数和寻求设计最优的原则，选择酶解温度、酶解时间、酶添加量和酶解pH作为因素，每个因素各取3个水平，正交实验方案及结果见表1。极差分析结果可以看出，对茶多酚提取率影响最大的是酶解温度，影响最少的因素是酶解pH值，各因素影响的主次顺序为：酶解温度>酶添加量>酶解时间>酶解pH值。由k值可以得到最佳组合：A3B3C2D2，即酶解温度60℃、酶添加量3.5%、酶解时间3h、酶解pH值4.8。酶解预处理最优条件实验结果表明最高提取率为24.76%。

3乙醇提取工艺单因素实验结果与分析

如图5~图8所示，茶多酚的提取率随乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比的变化较明显，茶多酚的提取率随着乙醇浓度、提取温度、提取时间升高的变化规律是先增加后减少；料液比对茶多酚提取率的影响：当料液比为(1︰10)~(1︰40)时，茶多酚的提取率随着乙醇溶液体积的增加而增加；当料液比为(1︰40)~(1︰60)时，茶多酚的提取率保持稳定。因此，实验选择料液比的范围为1︰30~1︰50，乙醇质量分数为50%~70%，提取温度为50~70℃，提取时间为60~90min，进行下一步的正交实验。

4乙醇提取茶多酚工艺优化

在前期酶解预处理的优化条件下和乙醇提取茶多酚单因素实验的基础上，对乙醇提取茶多酚工艺进行了正交优化实验，实验设计与结果见表2。影响茶多酚提取率的各因素主次顺序是：提取温度>料液比>乙醇浓度>提取时间，极差分析得最佳条件组合为：A3B3C2D3。即提取温度70℃、料液比为1︰50、乙醇质量分数60%、提取时间为1.5h。

5最佳工艺的验证实验

根据正交实验中复合酶解辅助乙醇提取茶多酚最佳工艺条件进行验证实验：精确称取同一批次的单枞茶叶粉末1.000g于三角瓶中，在酶解温度60℃、酶添加量3.5%、酶解pH值4.8、酶解预处理3h后，转移到圆底烧瓶中，在乙醇质量分数60%、提取温度70℃、料液比为1︰50的情况下提取1.5h，测定茶多酚的提取率，2次平行，提取率取平均值为25.82%，均高于单因素实验和正交实验结果，表明此工艺具有一定的合理性。

6水提法与复合酶解醇提法的比较实验

从图9可知，与传统水提法[21][茶水比1︰15、95℃纯净水2次浸提（第1次、第2次水量分别为总水量的8/15、7/15），每次浸提30min]相比，茶多酚提取率提高了69.87%，且酶解反应温和高效，能保持茶叶茶多酚质构稳定，提高了单枞茶茶多酚的品质，满足市场需求。因此，复合酶解辅助乙醇提取法是－种安全可靠的提取方法，具有很好的应用前景。

小结与讨论

复合酶解辅助乙醇提取茶多酚的工艺参数为：酶解温度60℃、酶添加量3.5%、酶解时间3h、酶解pH值4.8、乙醇质量分数60%、提取温度70℃、料液比1︰50、提取时间1.5h，在此工艺条件下，茶多酚的提取率达25.82%。

目前，茶多酚的提取有热水浸提法和有机溶剂萃取法，前者是在相对高温长时条件下多次浸提茶叶中的茶多酚，存在浸提不充分、高温长时下，茶多酚尤其是儿茶素易氧化生成茶色素，与体系中咖啡碱、蛋白质生成茶乳酪，影响茶多酚的生物活性等不足[22]；后者是由于茶叶中的亲水性成分大多能在有机溶剂中溶解，难溶于水的亲脂性成分，在有机溶剂中的溶解性也较大。乙醇是一种毒性小，价格便宜，来源方便，可回收反复使用的有机溶剂，具有提取率高、提取液不易发霉变质等优点[23]。与传统水浸提法相比，酶解辅助乙醇提取法不仅具有高效温和、节能环保等优点，而且能促进茶叶内不利及无效成分的有益转化，改善茶汤的色、香、味、形及营养价值等综合品质，同时茶多酚提取率比水浸提法高出了69.87%，为茶叶中茶多酚的提取提供了一种新工艺。

虽然酶解结合醇提法在单枞茶茶多酚的提取方面具有许多独特的优势，但其应用研究还处于实验室阶段，在实际生产中的推广与应用时，还有很多工作要做:一是醇提茶多酚安全性评估需进一步深入探讨，二是醇提茶多酚溶液中的脂溶性色素较多，给后续分离纯化带来一定的困难，三是茶多酚中醇味去除关键技术研究；四是放大参数及生产设备都尚须做进一步深入研究。（本文作者：谢蓝华、肖南、张嘉怡、江东文、杜冰、杨公明 单位：华南农业大学食品学院）