干细胞培养技术精选(九篇)

第1篇：干细胞培养技术范文

1998年11月，美国James和JohnGearhart领导的2个科学小组分别阐 述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ESce lls）和胚胎生殖细胞系（EGcells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征 是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体 外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成 成体中各种细胞的能力。

ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出 生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造 人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患 者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束 在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基 因运载系统。总之，其前景十分广泛。

1胚胎干细胞的一般定义特征

考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的 ，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细 胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能 性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常 的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在 体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonictissues）和分属所 有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠 外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义 限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源 于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细 胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的 是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是 十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。

2胚胎干细胞的最新研究

JamesThomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细 胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚 层去除，内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上，经过短暂的粘 附和展开的过程，将细胞重新分散（disaggregated）并转移到另外的饲细胞层， 在培养基和培养系统与方面，培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同，而且 人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们 首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠 ES细胞是不同的，特别是在外形上，且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细 胞。因此，要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的 。但还有一个重要的条件，即人胚胎培养过程的改进，其包括不同发育阶段使用不 同的培养基的两步培养系统，这使得能高效地得到高质量的人囊胚［4］。

Shamblott和同事［2］在《美国科学院论文集》上，报道从受精 5～9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的 成熟过程的小细节知之甚少，但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至 性腺并开始扩增，随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中 已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞［5］。Shamblott小组所使 用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子 ，即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子（LIF）和f orskolin［6］。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞 的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群，都能在体外培养过程中保持有正 常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次，且细胞含有端粒酶 活性，这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久， 但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个 胚层组织的畸胎瘤，且个别组织表现为高级的组织结构性（例如可以形成神经管） 。但是在体外情况下，细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成 的某些标志性分子（如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白）;从生殖细胞来源的细 胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据，但是作者确实观察到了在胚状体（embry oidbodies）中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条 件下，由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两 层，一层是胚胎外的内皮层，一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细 胞分化成多种细胞类型，这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况［2］ 。Shamblott将培养出来的胚状体切片，用免疫化学方法研究，发现不同细胞类型 表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。

人的干细胞的表型，即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型 细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞，猴和人的ES细胞在表 型上十分相似，与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养 条件下呈扁平的克隆，细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长，细胞更圆，细胞 边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的 自我更新可以被白血病抑制因子（LIF）或相关的细胞因子促进［7］但对人的 ES细胞却没有这种作用［1，2］。

在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下，目前对人ES细胞的研究出现 一股热潮。如果成功，将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体 外培养的胚胎干细胞正常地分化，这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有 可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育，非正常发育（通过改 变细胞系的靶基因），新的人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织 移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。

3胚胎干细胞应用前景探讨

人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的 良好条件，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术 ，比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可 以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术， 可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选，人胚胎 干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平，极大减少了药物 实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属，其结果 常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾 病的发病机制和进展结果，从而可找到特效和永久的治疗方法。

人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官， 因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都 可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神 经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重 建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对 于后2项，胚胎干细胞可能会有特别疗效，至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有 干细胞，自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应，还可以对胚胎干 细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞，因为它可以自我复 制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用，而不象分化的细胞那 样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可 以矫正缺陷基因。例如，如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤 维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病，可以收集部分或全部胚胎干细胞，通过 基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌 入胚胎中，将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题，现在还未开展此 类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”，即破坏 细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免 疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因，而且这种细胞发 育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。

另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细 胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应，ES细胞的获得还有另一种方法， 即从患者自身成熟细胞中取出细胞核，移植入去核的卵细胞中（即体细胞核转移技 术SCˉNT），经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种 包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚，若将囊胚植 入假孕妇女的子宫中，将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体，即所谓的“ 克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞（ES）”， 并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等，将这些细胞移植至发病部 位，则能够修复患者的组织或器官，从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养 获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体 细胞的患者完全一致，不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实，这将是人类 医学史上一项划时代的成就，它将使器官培养专业化，全面解决供体器官来源不足 的问题;并达到器官供应专一化，提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组 织一旦出现异常，则医生可给予更换和修复。

利用核转移克隆技术以获取ES细胞，人卵子来源不足是目前的主要难题。至今 为止，非人类哺乳动物的克隆效率非常低，大约100个以上的卵细胞才能得到1个有 活力的克隆［8，9］。要解决这个问题，一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分 化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿，但这需要发展卵细胞 在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞 ，这项技术基于一种假设，即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代，从而不 会形成杂种细胞。

4面对的挑战

要使上述设想变为现实，还需要对人胚胎干细胞做深入研究，还需要解决许多 技术上的因素，这些问题包括:（1）人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持 体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩 ，如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化，但仍需进一步研究干细 胞的培养条件。（2）如何定向诱导干细胞分化［10］?细胞分化是多种细胞因 子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型 的组织，就需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。但是 科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提（祖细胞），将祖细 胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织，因为机体能够分泌所有指导细胞正 确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植，只需要将已 诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用，这些移植的细胞 与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中［11］。（3）要 使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂 的器官，这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过 程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如，肺中的肌组织、血 管和结缔组织来源于中胚层，而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄 代谢产物，分化的组织中需要产生血管，组织血管化目前还处于起步研究阶段。就 目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法 做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞 注射到重度免疫缺陷动物的脏器中，让移植的人干细胞逐步替代动物细胞，使其脏 器人源化，成为可供人体的器官移植。（4）如何克服移植后的问题?前面提到的改 变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激 活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构等等问题，还有待进一步 研究。而且，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的 移植的安全性做一全面、客观、深入的评价，极需人们对此作更深入的研究。

5其他替代胚胎干细胞应用的技术

由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决，因此人们

正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如，根据现阶段的研究可以

认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性，那么在只有有限

分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些

早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象，例如，小鼠和大鼠卵黄囊的内

皮层细胞可以在invivo由异体分化（transdifˉferentiate）状态转变成全能性细

胞［12］，将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更

新的全能性细胞［1～3］。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞（adult

stemcells）替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出

来的干细胞，能在体外长期培养，在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细

胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞，甚至在像脑、肝脏这些更新较

慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中，必须通过特定的分子标志才能将干

细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提

供重要的线索。例如，表皮干细胞表达高水平的β1-integrins，而β1-inte

grins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生［13～16］

。据原先的推测，成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞，即血液干

细胞只能分化出各种血液细胞，而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一

系列研究发现说明:通过控制周围环境，成体干细胞也能够分化成多种不同类型的

细胞，表现出一定的多能性［17～20］。

Bjornson等人报道，将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后

的小鼠的循环系统中，可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞，

这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力［21］。Margaret

A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞，它能够分化成几乎所有

种类的血液细胞，而且效力比完全的骨髓成分高10～14倍［22］。此外，陆续

还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞［23］;小鼠血

液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞［24］;人和小鼠神经干细胞分化成骨

骼肌细胞［25］;人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞［26］;人体血

液干细胞转化成肝脏细胞［27］;人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细

胞［28］。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系

统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出

多种细胞类型特有的相关基因的表达［29～30］，以及当B淋巴细胞细胞的正常

分化由于Pax5的缺失被阻断后，B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细

胞［31］。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的

状态，在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。

以上的发现要应用于临床还存在操作上的困难，必须寻找一种更容易得到，更

容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞，这种细胞可以从成

人骨髓中分离得到，能在去分化的状态下稳定复制，并能分化成多种间质组织包括

骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等［32～33］。最近，从脂肪组织中分

离出干细胞，它能分化成脂肪、软骨、肌肉和骨组织［34］;另外从啮齿动物

真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞，可能

可以作为未来理想的干细胞来源［35］。但到目前为止，成体干细胞能转化的

细胞类型还十分有限，因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之，胚胎

干细胞的研究及应用，将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程，给人类带来

全新的医疗方法。随着研究的深入，许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干

细胞及其相关技术而被治愈。

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第2篇：干细胞培养技术范文

【摘要】 ［目的］探索在旋转生物反应器内，应用微载体技术快速扩增并向软骨分化人脂肪干细胞。［方法］将人脂肪干细胞结合Cytodex3微载体在旋转的生物反应器（RCSS）内进行动态培养，应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的脂肪干细胞进行动态观察，并对收获的脂肪干细胞进行SafraninO、toluidine blue染色等组织化学染色及Ⅱ型胶原的免疫化学染色分析。［结果］脂肪干细胞于24 h内贴附于Cytodex3微载体表面，细胞形态为短梭形，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期，细胞密度可达最初接种的19倍左右，在微载体上收获的细胞进行番红花O、阿利新蓝染色呈阳性，Ⅱ型胶原染色阳性，均强于对照组。［结论］利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增脂肪干细胞，并成功实现向软骨细胞分化。

【关键词】 脂肪干细胞； 生物反应器； 微载体； 软骨细胞

自从2001年Zuk等人［1］从脂肪中提取出了具有多向分化潜能的干细胞后，脂肪干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)以其来源广泛，取材方便，扩增迅速等优点迅速成为了组织工程的研究热点。多项研究证实，ADSCs在体外可以向多种细胞系分化，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、神经及内皮［2、3］。其生物学特性与骨髓基质干细胞非常相似，在组织工程领域颇具应用前景。而软骨是公认的最适于应用组织工程技术构建的组织，因此以ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，具有很高的实用价值。构建组织工程软骨通常要求短期内获得大量的种子细胞，并且在体外培养过程中能够保持良好的表型。传统的静态培养方式很难满足这些要求，而立体三维动态培养不但可以加速细胞的增殖，而且利于软骨方向分化及表型的维持［4］。因此，本研究利用生物反应器技术结合微载体对ADSCs进行快速扩增同时向软骨细胞方向诱导，旨在观察ADSCs在微载体上增殖分化情况，探讨其未来临床应用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

Ⅰ型胶原酶，地塞米松，2磷酸1抗坏血酸，ITS，Cytodex 3(Sigma)，胰酶，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(元亨圣马)，FGF2、TGFβ1(Peprotech，UK)，Ⅱ型胶原鼠抗人单克隆抗体(北京中山公司)，旋转生物反应器(Synthecon)，Olympus倒置显微镜(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分离培养 取膝关节置换术中切除的髌下脂肪垫，严格保持无菌，取材后30 min内进行干细胞分离。在超净工作台中，用显微剪刀仔细剔除脂肪组织表面的筋膜和小血管，DHank's冲洗3遍以洗去红细胞的污染。剪碎，加入5倍体积的0.075%的Ⅰ型胶原酶，37℃、搅拌30 min，离心2 000 r/min，5 min，倾去上层脂肪及上清，DHank's洗涤，100目筛网过滤。离心1 000 r/min 5min，沉淀用DHank's洗2遍，将细胞重悬于含10%FBS的高糖DMEM培养基，48 h后换液。细胞长满80%后，用0.25%胰酶消化传代培养。至第2代时，换培养液为软骨诱导液(5 ng/ml FGF2，10 ng/ml TGFβ1，50 μg/ml Vc、10-7M Dexamethasone，1xITS)进行软骨方向诱导分化。

1.2.2 Cytodex 3预处理 取干重微载体珠50 mg，放入10 ml的洁净玻璃瓶中。向瓶中加入不含钙和镁离子的PBS 10 ml，室温下至少孵育3 h以膨胀微载体珠，用巴氏吸管弃去上清液，PBS清洗微载体2次，弃去PBS，再加入新鲜不含钙和镁离子的PBS 10 ml，高压灭菌20 min，吸除上清液，微载体用培养液清洗，置于4℃冰箱中备用。

1.2.3 细胞培养方式 将Cytodex 3微载体50 mg及ADSCs(最终浓度1×105/ml)加入到10 ml体积的RCSS培养容器中，并补加软骨诱导培养基至充满容器。把接种细胞的容器连接于旋转底座。整个装置放于5%CO2孵箱，于37℃常规条件下培养。开始以5 r/min的速度旋转5 min，以充分混合细胞，然后停止旋转5 min。再旋转容器5 min，再停止容器旋转5 min。多次重复循环，最后持续旋转容器并逐步调整转速至10～12 r/min。视培养基颜色及pH值决定是否换液及换液量。ADSCs静止培养是以1×105/ml接种于6孔板中，每孔2 ml，接种5孔，培养过程中每2～3 d更换培养液，保持细胞供养充足。

1.2.4 细胞形态学观察和计数 人ADSCs分别培养1、3、5、7 d，取样本于倒置显微镜下观察微载体表面ADSCs生长形态及增值变化情况，消化、分离微载体表面的软骨细胞并用血细胞计数板计数，描记细胞培养生长曲线。并取第3 d细胞微载体样本，进行扫描电镜观察，观察细胞生长形态及基质分泌情况。对照组静态单层培养的ADSCs细胞，分别于1、3、5、7 d观察细胞生长形态及增值变化情况，并收集一孔细胞计数，描记细胞生长曲线。

1.2.5细胞化学及免疫细胞化学分析分别将微载体上生长的ADSCs和单层培养的ADSCs进行消化收集，爬片，应用SafraninO染色，toluidine blue染色观察细胞外基质中GAG合成和分泌情况。应用Ⅱ型胶原单克隆抗体与细胞爬片共同孵育，以DAB为底物应用免疫过氧化物酶法显色，阳性染色为棕色反应，观察Ⅱ型胶原分泌合成情况。

2 结果

2.1 ADSCs在Cytodex 3微载体表面贴附生长情况

细胞接种3 h后，细胞开始贴附于微载体表面，24 h后，绝大部分细胞已经贴附在微载体表面，培养基中仅可见少量死亡细胞。细胞由球形、半球形逐渐伸展为短梭形，偶见伪足伸出，形态不规则(图1a)。第3 d，微载体表面细胞明显增多，在不同焦距平面上均可见细胞贴附生长，细胞周围可见基质分泌沉淀，微载体间偶见细胞连接。细胞形态呈短梭形扁平状。培养基中少见死亡细胞，电镜扫描，细胞在微载体表面贴附良好(图1b)。第5 d，微载体大部分空间已被细胞所覆盖，细胞层叠生长，大量基质分泌，单个细胞形态不易区分，微载体之间可见宽大的细胞连接体，微载体呈团状生长(图1c)。第7 d，微载体已被完全覆盖，表面细胞互相重叠呈团块状，这使得微载体表面变得粗糙、凹凸不平。微载体间广泛存在细胞连接，培养基中几乎无脱落细胞(图1d)。

2.2 ADSCs在静态培养中生长情况

细胞接种于诱导培养基2 h后，开始贴壁，24 h后全部贴壁。细胞形态为短梭形或多角形，与未诱导ADSCs相比较细胞个体略大。完全贴壁后即开始快速增殖，3 d达到50%融合，5 d达到80%融合。随细胞密度增加，增值速度减慢，7 d基本完全融合。

2.3 2种不同培养方式下ADCSs的生长曲线

在第1、3、5、7d，分别从RCCS容器及普通培养瓶中收集ADSCs并计数，做生长曲线如图2。台盼蓝染色排除试验显示，从微载体上回收ADSCs存活率90%以上。血细胞计数板计数，可见ADSCs于RCSS接种后的第3 d起生长加速，至第7 d细胞密度达到最高值，约为最初接种的19倍。静态单层培养第7 d收获细胞总数约为最初的6倍余。

2.4 细胞化学及免疫细胞化学检查分析

2组不同培养方式的ADSCs爬片染色显示，微载体培养的细胞SafraninO染色，toluidine blue染色呈强阳性，强于静态培养组，表明细胞外基质中含有大量GAG；Ⅱ型胶原染色亦呈强阳性。结果表明微载体上培养的ADSCs经过动态诱导培养，有软骨特征性基质成分表达(图3～5)。

3 讨论

脂肪来源干细胞容易获得，并且来源广泛，与骨髓基质干细胞一样均属于来自中胚层的成体干细胞。De Ugarte等［5］发现来源于骨髓和脂肪组织的干细胞在细胞获得率、细胞老化、基因转染和细胞的黏附特性等方面没有明显的差别。因此，ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，具有不可多得的优势和前景。

作为临床应用，构建组织工程软骨往往需要大量的种子细胞，有研究表明当细胞数量少于1×107/ml时就不能形成软骨或生成很少［6］。传统的培养方式不仅扩增速度慢，而且不容易维持干细胞诱导后的表现；在三维培养条件下则有利于ADSCs向软骨方向分化，并促进细胞外基质的合成［7］；而动态三维立体培养则进一步提高了组织工程软骨的生物化学功能和生物力学功能。

微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术，现已广泛应用于组织工程领域。在动态培养过程中，外部流体力学刺激能够明显增加细胞增殖，促进细胞DNA的合成，利用生物反应器和微载体进行细胞扩增，细胞浓度最高可达到1×108/ml［8，9］。这在常规培养条件下是很难达到的。这首先是由于微载体有较大的表面积(Cytodex 3 110 g提供约4600 cm2的表面积)［2，5］，相同容积的生物反应器和普通培养瓶相比，前者可比后者多培养数10倍甚至100倍的细胞，可以满足较大体积组织构建对种子细胞数量的需求；其次因为整个培养容器由电机驱动沿水平轴旋转，培养基以及细胞颗粒随容器一起旋转，细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，使细胞所受到的重力、浮力及剪切力达到平衡，这就构成了一种微重力培养环境，利于细胞聚集，并在微载体表面各个方向上均衡扩增生长；最后一点在这种动态环境中，细胞与营养物质易于均质分布，显著改善微环境中的营养物质及代谢产物的交换，保持培养环境的均一性和稳定性，有效促进了细胞的增殖。

组织构建的另一个难题是怎样保持其诱导表型，不发生去分化。生物反应器和微载体介导的动态三维培养，不但为细胞增殖提供了良好的环境，而且周期性的力学刺激作为一种必要的物理信号在细胞的分化过程中起到了重要的作用。在动态环境中细胞活性增强，加之诱导因子的作用，使得大量蛋白合成分泌，形成特异的细胞外基质，促进了细胞的分化和成熟。总之，这种动态培养微环境提供了细胞聚集、快速三维生长和分化的条件，为工程化组织构建提供了更为有效的手段［10］。本实验的结果也证实了这一点，实验中ADSCs在微载体上能够迅速贴附、伸展并快速增殖。第7 d细胞已将微载体表面完全覆盖，并凸出微载体表面生长，微载体间相互连接，呈团状生长。微载体培养在1周的时间内细胞数量增长了近20倍，而静态培养则仅为6倍，组织化学及免疫组织化学均显示微载体培养的细胞有较好的表型及细胞外基质。本研究为以ADCSs作为种子细胞构建组织工程软骨提供了实验依据，为进行更加深入的研究奠定了基础。

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第3篇：干细胞培养技术范文

【关键词】 牙周膜干细胞；炎症

【中图分类号】R781.4 【文献标识码】A 【文章编号】1004-4949（2013）06-11-03

牙周炎导致牙周支持组织破坏，是成人失牙的主要原因[1]。牙周治疗的主要目的是控制牙周组织炎症，维护牙周组织健康，并使包括牙槽骨、牙骨质、牙周膜、牙龈在内的牙周组织达到形态和功能上的再生与重建，这也是牙周病治疗的终极目标[2-4]。近年发展起来的组织工程技术为牙周组织再生治疗开辟了新途径，种子细胞、信号分子和支架是牙周组织工程技术的三大要素，因此合理选择种子细胞是牙周组织工程技术获得成功的关键[5-6]，目前已确认可用于牙周组织工程技术的种子细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和牙周膜干细胞等[7-9]，其来源多为健康的人体组织，通常存在取材有创、来源有限等弊端，在一定程度上限制了临床治疗的可行性。许多研究表明在牙周炎时期也存在着组织的再生，而组织的再生离不开干细胞的迁移，只有适当类型的干细胞附着于根面，增殖并分化为功能性附着结构（牙骨质-牙周膜-牙槽骨）的各种细胞组分，配合适宜的刺激因子和基质成分，才可能形成再生组织，否则可能仅产生修复[10]。Lin 等[11]对3名重度牙周炎（Ⅲ度根分叉病变）患者需要拔除的患牙行 GTR 手术，术后6周，切取其中2名患者患牙周围的再生组织，进行免疫组化检测，发现了STRO-1、CD146 和CD44 阳性的细胞，同时拔除余下1名患者的患牙，取其再生组织进行细胞体外培养并传代，用流式细胞仪分析得到 STRO-1、CD146 和 CD44 阳性的细胞百分比分别为78.3%、94.9%和100%，所得细胞经矿化和成脂诱导 4周后可分别形成矿化结节及脂滴，但其分化能力低于PDLSCs 和BMSCs。该实验证明了牙周炎症再生组织中应该存在具有干细胞特性的细胞。Chen 等[6]将临床上因重度牙周炎而拔除的患牙制成组织切片，使用免疫组化染色观察发现，在牙周炎患牙的牙周组织中，STRO-1、CD146 和CD44 阳性细胞分布情况与健康牙周组织近似，而牙周膜干细胞表面的阳性标记物是STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、阴性标记物是CD31 CD45，所以本实验利用STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、和CD31 CD45对牙周膜干细胞和炎症牙周膜干细胞（i-PDLSCs）进行鉴定。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

1.2 主要器械： 眼科剪、眼科镊、刀柄、11 号刀片、平底培养皿、25cm2培养瓶、10ml离心管、平底 6 孔板（Corning，美国）、金属滤器。

1.3 主要实验仪器

1.4 实验方法

1.4.1 原代细胞的培养： 1）炎症牙周膜干细胞的培养（iPDLSCs）：取材：选取临床上年龄在 30-45 岁之间的慢性牙周炎患者，收集其因重度牙周炎需要拔除的患牙，患牙无牙根吸收、根尖周炎和根尖囊肿等牙髓和根尖周疾病，刮取其炎症牙周膜组织；漂洗组织：将获得组织用 8 万 U 庆大霉素浸泡 3-5min，用 PBS 反复漂洗 3 遍，将其剪成约 2mm×2mm×2mm 大小的组织块；消化与接种：把漂洗后的组织块收集到离心管中，然后加入1-2ml胶原酶，置于含有5% CO2、37℃二氧化碳培养箱中消化，每15min 摇动离心管一次，40min后拿出，然后吹打均匀，以800rpm 离心 6min，弃去上清液，加入2ml培养液（含10%胎牛血清、200U/ml 庆大霉素和 100U/ml 青霉素的α-MEM，下同）再次吹打均匀，接种于 6孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养（5% CO2，37℃），每3d换液一次。2）健康牙周膜干细胞的培养（PDLSCs）：取材：选取临床上年龄在 20-35 岁之间的非牙周炎患者，收集其因正畸需要所拔牙齿或拔除的无炎症的阻生第三磨牙，刮取其根中部 1/3 牙周膜；消化与接种：将获得组织用 PBS 漂洗 3 遍，余步骤同上。

1.4.2 细胞的纯化： 本次试验使用有限稀释法对iPDLSCs和PDLSCs进行纯化，显微镜下观察原代细胞铺满6孔板底达 80%汇合时，弃去原培养液，用PBS 冲洗2遍，然后加入胰蛋白酶2ml消化2-3min，镜下见细胞团漂浮在液体之上时加入等量的培养液终止消化，反复吹打数次后将细胞悬液转移到离心管中，以800rpm 离心6min，弃上清，加入适量培养液进行倍比稀释，调整细胞密度至 10-20个/ml，以 1-2 个/孔的密度接种于96孔板，每孔加入培养液100μl，次日挑选出单个细胞孔，将培养液加至200μl继续培养，每3d 换液1次，待细胞长满孔底 1/3-1/2时消化并接种培养瓶，常规培养传代。

1.5 流式细胞仪表面分子鉴定： 取筛选培养的人牙周膜干细胞和炎症牙周膜干细胞，弃原培养液，PBS冲洗两遍，用胰蛋白酶2ml消化1min，α-MEN中和消化，1000r/min离心6min，弃上清，用含30%胎牛血清的PBS缓冲液将牙周膜细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度4.0x105/L，每个Eppendof管加400ul的细胞悬液，室温下分别避光加入CD45-PE、CD31-PE、CD90-PE、STRO-1-FITC、CD29-FITC、CD105-PE小鼠抗人单克隆抗体2ul，4℃冰箱避光孵育2h，用含30%胎牛血清PBS缓冲液清洗细胞两到三遍，1000r/min离心5min，将细胞重悬于含30%胎牛血清PBS中，使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，用流式细胞仪分析荧光细胞，专用配套软件计算细胞表面抗原阳性率，单位用%表示。

2 结果

2.1 原代细胞生长情况： 使用酶消化组织块法原代培养iPDLSCs 和 PDLSCs，接种3-7d后可以看到有细胞从组织块周围爬出，在远离组织块的地方也有数个细胞爬出，大部分细胞大小均一，为成纤维细胞样，呈长梭形，少数细胞体积较小，呈多角形或椭圆形，胞浆丰满，两种细胞形态无明显差异，PDLSCs接种2w 左右达80%汇合，iPDLSCs 接种 3w 左右达80%汇合。（图1、2）

2.2 细胞纯化情况： 炎症牙周膜干细胞接种 96孔板后25d左右，约20%的单细胞孔细胞形成克隆并增殖铺满孔底 1/3-1/2，细胞排列密度大，细胞体积略小，呈梭形，9d左右可传代一次。

健康牙周膜干细胞接种96孔板后15d左右，约30%的单细胞孔细胞形成克隆并增殖铺满孔底 1/3-1/2，细胞形态与炎症牙周膜干细胞无明显差异，7d左右可传代一次。

2.3 流式细胞仪表面分子鉴定： 分离得到的PDLSCs和iPDLSCs具有干细胞的分子表型和较高的纯度（图3），即均表达间充质干细胞分子阳性（STRO-1、CD29、CD105、CD90），（CD31、CD45）为阴性，其中PDLSCs表面分子CD105的阳性表达率为26.6%（图A-1）、CD29的阳性表达率为96.1%（图A-2）、STRO-1的阳性表达率为5.4%（图A-3）、CD90的阳性表达率为85.2%（图A-4），iPDLSCs表面分子CD105的阳性表达率为50.2%（图B-1）、CD29的阳性表达率为95.3%（图B-2）、STRO-1的阳性表达率为7.0%（图B-3）、CD90的阳性表达率为85.8%（图B-4）

3 讨论

牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）是来源于牙周膜的成体干细胞，具有自我更新能力，能够被诱导形成多种组织细胞，能够维持牙周膜功能的稳定，发挥生理性细胞更新和修复组织损伤的作用[12-13]。近年来许多学者利用PDLSC体外培养模型，在牙周组织疾病的发病机制及治疗研究等方面取得了一定进展，如何获取大量的人牙周膜干细胞，是建立体外研究模型的关键之一。目前牙周膜细胞的分离培养主要有酶消化法和组织块法，其中组织块法被广泛采用，但是它的培养成功率较低，近年来有些研究表明利用酶消化组织块法来培养牙周膜干细胞，可以提高原代细胞培养的成功率[14]，采用该法我们成功培养出人炎症牙周膜干细胞的原代，原代培养成功率达到了50%。

为了获得更多的干细胞，我们采用传统方法对原代炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞进行了纯化，即对炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞进行有限稀释法，挑选单细胞克隆，继而扩大培养，克隆化生长的能力至少满足了干细胞应具有克隆形成能力这一条件，为我们的鉴定工作奠定了一定的基础，同时我们采用流式细胞技术来鉴定炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞的表面分子，结果表明STRO-1、CD29、CD105、CD90为阳性表达，CD31、CD45为阴性表达，并且两种细胞的表面分子表达率并没有明显的不同。

4 结论

用酶消化组织块培养牙周膜干细胞，能提高牙周膜干细胞的培养成功率；炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞的细胞形态基本相同；流式细胞仪鉴定结果表明本实验培养、分离的PDLSCs和iPDLSCs具有干细胞的特性，并且两种细胞的表面分子表达率并没有明显的不同。

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[12]Slack JM.Science，2000，287（5457）：1431-1433.

第4篇：干细胞培养技术范文

【关键词】 软骨组织工程种子细胞源

多种原因造成的关节软骨病变比较常见，软骨损伤后缺乏自愈能力，软骨缺损的修复一直是临床的难题。随着细胞生物学和材料科学的迅速发展，应用组织工程学技术修复软骨病损已成为可能，而优化种子细胞源是应用这一技术的前提和关键［1］。本文就有关软骨组织工程种子细胞源的优化获取、存在的问题及其解决等研究进展作一综述。

1 软骨组织工程对种子细胞源的要求

组织工程软骨的种子细胞应符合下列要求：来源丰富，取材方便；有较强的增殖传代能力；与载体材料接种后能保持增殖能力和较高的黏附率，植入受区后能保持修复组织的表型；对机体或供区损伤小，临床应用的生物安全性和无明显的免疫排斥和其他潜在危险［2］。

2 软骨组织工程的种子细胞源

2.1 自体软骨细胞

理论上讲自体软骨细胞是软骨组织工程最理想的种子细胞源，不仅功能相同，不存在免疫排斥反应，而且不需要诱导分化培养。但研究表明种子细胞浓度为(5～6)×107/ml时，形成的新生软骨形态最佳，但是自体软骨组织取材受限，软骨细胞增殖能力低，难以达到应有的细胞数量，体外培养扩增容易发生去分化而失去原有的表型［3］，因此直接源于自体软骨组织的种子细胞，体外单层培养难以获取大量的细胞以满足组织工程对种子细胞的需求。

为解决上述难题，使用生物反应器三维培养可使软骨细胞快速扩增，建立能够长期培养、表型稳定的永生化软骨细胞。生物反应器能控制pH、机械能力、营养供给条件等，为细胞的生长、分化提供最适宜的环境。根据自体软骨细胞培养所需的条件，仿生性地设计接近体内环境的软骨生物反应器，模拟了体内的细胞外基质微环境。相同容积的生物反应器比普通培养方式，多出数10倍甚至上100倍的细胞。可减少细胞去分化现象，有利于细胞表型的维持，提高种子细胞的质量。有利于软骨细胞的培养、扩增及表型维持。

2.2 同种异体软骨细胞

与体内其他组织相比，软骨有其独特的结构和免疫学特点。软骨无血管、淋巴管和神经，细胞包埋在由软骨基质形成的软骨囊内，可阻挡免疫细胞直接与其接触，不易被机体免疫系统攻击，软骨基质抗原性低，一般不引起或仅有轻微的免疫反应，获取种子细胞时要经过消化分离和体外培养等一系列处理，软骨细胞表面抗原可被进一步消弱。同种异体软骨来源广，易获取，一次可获取大量软骨细胞，所以同种异体软骨是值得研究的种子细胞来源［5］。应用同种异体软骨细胞作种子细胞，在具有免疫力动物体内形成同种异体工程化软骨，并用于软骨缺损修复的实验报道，未发现明显的免疫排斥反应［6］。研究表明胚胎来源的软骨细胞较成体软骨细胞引起的异体排斥反应微弱，提示在同种异体软骨组织工程中，胚胎来源的软骨细胞作为种子细胞是最佳选择［7］。对同种异体软骨细胞生物学特性和相关免疫反应问题的进一步研究，将为建立软骨组织工程种子细胞库奠定基础。

2.3 骨髓间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs)

骨髓中存在具有向多种细胞系分化潜能的BMSCs。Friedenstein发现骨髓中存在少量可以贴壁繁殖的BMSCs，条件培养液诱导可分化成为软骨细胞。Cancedda等［8］对BMSCs和骨膜细胞修复兔股骨髁软骨全层缺损进行了比较，发现两者均能形成软骨和软骨下骨。

ButnariuEphrat等［9］用BMSCs复合聚合物支架，自体和异体移植修复股骨负重区软骨缺损，结果自体BMSCs早期形成类透明软骨，异体BMSCs的免疫反应导致后期纤维化和骨关节炎改变。Gao等［10］分别用成骨和成软骨条件培养液诱导培养大鼠BMSCs，复合不同材料的双层支架植入裸鼠背部皮下，术后1周检测新生组织中含有Ⅰ、Ⅱ型胶原，认为BMSCs在不同生物活性因子的作用下，结合相应的生物材料可以构建出工程化的骨软骨复合体，因此，目前认为BMSCs是一种比较理想的种子细胞源。尽管BMSCs只有较强的增殖能力和多向分化潜能性，但其数量在全骨髓中仅占1／105～1/104，并且随传代次数的增加，其软骨分化潜能逐渐降低，必须通过适当的控制条件和诱导因素，使BMSCs保持增殖并分化为软骨细胞，也有研究表明重症骨关节炎病人BMSCs的成软骨能力明显降低［11］，并且最近研究证实当BMSCs培养传代90次后细胞发生癌变，声称这符合肿瘤细胞源于干细胞的假说，因此对BMSCs应用的生物安全性必须引起高度重视和深入研究［12］。

2.4 BMSCs与软骨细胞共培养

基于BMSCs和软骨细胞均不能完全满足组织工程对种子细胞的要求，那么将2种细胞优势互补，进行共培养来优化和扩大软骨组织工程的种子细胞源就成为可供选择的方式。Tsuchiya等［13］用不同比例的人BMSCs和牛软骨细胞共培养发现，BMSCs数量比例愈高软骨细胞表达的Ⅱ型胶原和糖胺多糖愈高，并且能保持共培养前的细胞比例，因此BMSCs能促进软骨细胞的增殖和基质形成，其原因是共培养系统中BMSCs分泌的活性生长因子(TGF)，通过软骨细胞介导自分泌或旁分泌上调了软骨细胞基质的合成。Goldberg等［14］用添加TGF β的培养基培养去分化的软骨细胞，结果表明添加TGFβ能使去分化的软骨细胞重新分化，从而维持了软骨细胞的表型。在构建工程化软骨组织中，利用BMSCs增殖能力强的特点，少量软骨细胞的微环境能诱导BMSCs分化为软骨细胞，比单纯软骨细胞构建的软骨组织更为成熟，也避免了软骨细胞长期培养传代而导致的老化和去分化，并且节省了软骨细胞的用量。因此BMSCs和软骨细胞共培养对优化和扩大种子细胞源可能是一种实用的策略。

2.5 软骨膜细胞或骨膜细胞

骨膜和软骨膜生发层含未分化的间充质细胞，在低氧张力、无血供的关节腔内分化为软骨细胞、关节滑液和使用CPM是促使间充质细胞向软骨细胞分化的有利因素。Wakitani等［15］培养兔胫骨膜细胞，修复兔股骨髁全层软骨缺损，24周时软骨下骨完全形成，新生软骨组织无骨化现象。Chu等［16］用异体肋软骨膜细胞和PLA支架修复兔股骨髁软骨缺损，96％的缺损6周时为软骨填充，Ⅱ型胶原比例随时间延长而升高，说明关节内环境刺激新生组织向透明软骨方向发展，黏多糖含量12个月时降低，软骨下骨厚度为正常的50％，认为异体移植的免疫反应和PLA降解产物的酸性环境影响了软骨下骨结构的形成，导致新生软骨生物力学性能下降和纤维化。

2.6 肌肉源性基质干细胞(musclederived stromal cells)

Pate等［17］使用冻融方法和地塞米松诱导培养兔肌源性基质干细胞，形成了软骨结节和含有硫酸黏多糖的细胞外基质。青年和老年人的肌细胞经诱导培养出现同样的结果［18］。Adachi等［19］用关节软骨细胞或肌源性干细胞复合II型胶原凝胶修复兔股骨髁软骨缺损区，24周后可见缺损区呈软骨样修复，优于不含细胞的I型胶原凝胶对照组，认为肌源性干细胞取材方便，细胞倍增时间短，可以作为修复软骨损伤的种子细胞源和基因治疗的靶细胞。

2.7 脂肪源性基质干细胞(adipose tissuederived stromal cells，ADSC)

为提供更多间充质细胞的自体组织，Erickson等［20］用Ⅰ型胶原酶消化人吸脂术中的皮下脂肪，经梯度密度离心获取基质干细胞，使用普通和软骨诱导培养液(含TGFβ1和地塞米松)三维培养2周后植入裸鼠背部皮下4～12周取材，免疫组织化学和RTPCR检测表明：软骨诱导培养液体外培养1周和植入裸鼠体内的标本均有明确的成软骨特征，而使用普通培养液的对照组则阴性，类似结果亦见于大鼠脂肪来源的干细胞［21］。源于脂肪组织的基质干细胞，因脂肪组织在体内广泛存在，取材方便，对人体造成的创伤相对较小，是目前获取种子细胞的新途径，也是研究的热点，其细胞表型与BMSCs非常相似，均表达CD29、CD44、CD90、CD105，且缺少HLADR及Ckit表型，同时其增殖能力优于BMSCs［22］。然而Hui等［23］在修复软骨缺损的研究发现，在相同的实验条件下其修复效果不如BMSCs。由于该细胞为诱导性干细胞，体外培养时必须在持续诱导条件下才能分化为软骨细胞，培养难度相对较大并且其成软骨机制尚不完全清楚。如能掌握脂肪组织基质干细胞的成软骨机制和性能，在体外培养持续向软骨细胞分化，则不失为一种优秀的种子细胞源［24］。

2.8 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)

胚胎干细胞来自早期胚胎的内细胞团或尿生殖嵴，胚胎干细胞是全能干细胞，可分化为3个胚层的细胞，种植于体内可形成包含三胚层细胞的畸胎瘤。改变体外培养条件，可使胚胎干细胞向不同的细胞系分化，文献报道胚胎干细胞在BMP2和BMP4的作用下可分化为软骨细胞［25］，胚胎干细胞与已分化的成熟软骨细胞相比，除具有更强的增殖能力外，还具有再生潜能，可维持整个生命过程中细胞的更新和正常的功能，因而胚胎干细胞作为种子细胞可能更为优势。但使用胚胎干细胞作为组织工程的种子细胞，体外培养要求严格，自发分化难以控制，分化多具致瘤性，安全性难于把握，临床使用尚存在伦理学问题。

3 基因修饰的种子细胞

多种细胞因子有促进软骨修复的作用。通过基因重组技术，将细胞因子基因导入软骨细胞或相关细胞，使之在病损部位分泌生长因子并维持所需的浓度和时间，有效促进软骨的修复，这就是基因修饰的组织工程技术(gene modified technology)。如TGF、IGF、EGF、GF等均可刺激软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原与蛋白多糖的合成。绿色荧光蛋白基因转染软骨细胞可标记软骨细胞的示踪。研究表明，在骨形态发生蛋白-2和BMP-4的调控下，可在体外诱导ES细胞向软骨细胞分化，同时保留其分泌Ⅱ型胶原等的特性。Sellers等［26］用含rhBMP2的I型胶原海绵修复兔膝关节软骨缺损，24周时新生软骨厚度达到正常软骨的70％和潮线形成，rhBMP2组与单纯胶原海绵和旷置组间的差异只有统计学意义，但是外源性生长因子半衰期短，需较大剂量或连续给药才能发挥作用，增加了治疗成本。Baragi等［27］以腺病毒携带lacZ作为报告基因，人白介素-1受体拮抗物(hIL-1ra)cDNA作为治疗基因，用骨关节炎软骨标本体外培养软骨细胞和小软骨薄片，结果表明转染hIL-1ra基因可抑制IL-1引起的软骨基质变性，认为基因修饰后的软骨细胞表现出更强的生物学功能，在一定程度上弥补了自体软骨细胞供量不足的缺陷，缩短体外培养时间，更好地维持其表型。

多项研究表明以腺病毒、逆转录病毒或脂质体等作为载体，转染软骨细胞、骨膜细胞或直接注入病变部位是可行的，基因工程技术应用于组织工程领域可以使转染的细胞持续、稳定表达促进软骨修复的生长因子，但病毒类载体潜在的致畸性、免疫源性以及脂质体对种子细胞的毒性和转染率低等尚需进一步改进。

4 展望

种子细胞是构建组织工程化软骨和应用研究中的首要环节和基本要求，也是保证软骨组织工程学持续性深入研究的前提。影响优化软骨种子细胞源的因素众多，目前研究的种子细胞各具优缺点，尚没有一种细胞能够完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求，今后需要开发和挖掘更多的种子细胞源，并在模拟体内的微环境中进行培养，建立种子细胞的评价系统，优化出理想的种子细胞，为软骨组织工程的研究和临床应用提供可靠保证。BMSCs相关研究和技术比较成熟，今后的研究重点是如何保证细胞能在特定的时间内定向扩增到临床治疗所需的数量，并避免致瘤性的产生。BMSCs和软骨细胞共培养可能为解决上述问题提供了一种实用的策略，但两种细胞间的相互作用机制尚需进行深入研究。目前脂肪基质细胞和胚胎干细胞的临床应用研究相对滞后，但随着科学技术的不断发展，对其成软骨机制和性能也会不断了解，优势会逐渐显现。当然，种子细胞的优化只是软骨组织工程学研究的第一步，今后还要解决细胞所需载体及细胞与载体相容性及相互作用等问题，当最终运用到临床尚需考虑免疫排斥性问题。 参考文献

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第5篇：干细胞培养技术范文

【关键词】 脂肪源干细胞 海藻酸钙 软骨

Abstract: ［Objective］To evaluate the effect of not induced adipose derived stem cells(ADSCs)with calcium alginate healing full-thickness cartilage defects of rabbit knee after the model was made in center of femoral facies patellaris artificially， in order to find a simple and working way of articular cartilage defect restoration. ［Method］Twenty-seven New Zealand white rabbits were pided in to A， B， C groups randomly. Calcium alginate was transplanted to cartilage defect position of rabbits of group A， nothing for group B and calcium alginate with not induced ADSCs for group C. The animals were killed in 4th， 8th and 12th week later.Restored tissue was evaluated using naked eyes， histological section and transmission electron microscopy， score was given according to modified Wakitani grade standard. The total score was analyzed with statistic software SPSS 11.5. ［Result］Articular cartilage defects of the animal of groups A and B were filled with fibrous tissue which contains protofiber when it was checked using histological section and microscopy.The defect was filed with chondrocyte-like tissue .Chondrocyte-like cells surrounded with lacunes were observed in histological section. Plenty of collagen fibers around cells could be seen under transmission electron microscopy. Group C had a significant statistical difference compared with groups A and B (P

Key words：ADSCs; calcium alginate; cartilage

关节软骨的自身修复能力有限，其损伤后的修复一直是骨科界的难题之一。随着干细胞培养技术和组织工程技术的不断进步，多种组织工程方法被应用来探索软骨缺损治疗的可行性。2001年Zuk PA和Zhu Min［1］等从人脂肪组织悬液中第一次分离获得了多向分化干细胞。目前已证实脂肪组织来源干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导分化［2］。本实验将单纯脂肪源干细胞复合藻酸钙凝胶载体填充修复兔膝关节全层软骨缺损，对实验结果进行观察分析，以探讨单纯脂肪源干细胞应用于关节软骨缺损修复的可行性，为关节软骨缺损修复探索简单有效的途径。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器

(1)超净工作台(JHT-DDC型，济南康宝净化设备有限公司)；(2)恒温孵育箱(Heraeus公司，德国)；(3)倒置相差显微镜(Nikon TE2000，日本)；(4)50 ml培养瓶(Corning公司，美国)；（5）低温高速离心机（Heraeus公司，德国）。

1.1.2 主要试剂

(1)DMEM培养基(Gibco公司，美国)；(2) Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，美国)；(3)胰蛋白酶(上海华美公司，中国)；(4)胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；(5)D-Hank’s平衡盐（Sigma公司，美国）；（6）海藻酸钠（上海化学试剂站分装厂）；（7）氯化钙（上海生工生物工程有限公司）。

2 实验方法

2.1 脂肪源干细胞的获取、培养和鉴定

将新西兰大白兔致死，无菌取双侧髂窝处脂肪组织约10 ml，用2倍体积D-Hank’s平衡盐液漂洗3遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.2%Ⅰ型胶原酶5 ml置于37℃温箱内消化0.5 h，低温高速离心机内1 000 r/min离心10 min弃上清，加入160 mmol/L NH4Cl约5 ml裂解红细胞10 min，筛网过滤，按8 000个/cm2种植于50 ml培养瓶中。培养瓶置于37℃体积分数为5%的CO2恒温孵育箱内。24 h后首次换液，去除残余红细胞及未贴壁细胞，后每隔2～3 d换液一次，融合达80%以上时传代，动物实验用细胞传至第4代。取部分2代细胞采用含10%FBS，0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L维生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素的DMEM诱导培养基向成骨细胞方向诱导。

2.2 动物实验

选择健康成年新西兰大白兔27只（购自山东鲁抗实验动物中心），体重2.5～3.5 kg，雌雄不限。编号后随机分成A、B、C 3组，每组9只，双膝均用于实验。10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，取双侧膝关节内侧切口，将髌骨推向外侧，进入关节腔。分别于左右两侧用直径3.5 mm的钻头在髌股关节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约2.5 mm。A组：（18膝）缺损处单纯置入海藻酸钙凝胶。B组：（18膝），空白对照，缺损处不作任何处理。C组：（18膝），置入培养的脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物，细胞最终浓度不低于2.0×106 ／ml。术毕兔清醒后，放置笼内自由活动，青霉素肌注连续5 d。

2.3 检测方法

2.3.1 细胞学检测

生物学特性观察：观察细胞生长情况；取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色；另取部分向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色观察矿化结节，以证实所培养细胞有无干细胞特性。

2.3.2 修复组织检测

分别于术后4、8、12周处死动物，取材行大体、光镜组织学检查及电子显微镜下观察。(1)大体观察：膝关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无粘连及修复组织的平整度、光泽度；(2)组织学检测：将标本脱钙、梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺兰染色，进行光镜下组织学观察；（3）透射电镜观察：取12周修复组织，包埋后超薄切片，观察细胞及基质情况。

2.4 统计学分析

根据改良的Wakitani评分标准(见表1)采用盲法对各标本进行组织学评分。每一标本均有3人进行评分，取均数，所得评分结果应用SPSS 11.5统计软件进行多因素方差分析，与对照组比较采用Dunnett检验。表1 软骨缺损修复的组织学评分标准指标组织学表现评分

3 结果

3.1 脂肪源干细胞培养及诱导

细胞于接种后24 h左右开始贴壁，细胞形态呈长梭形、三角形或多角形（图1）。细胞生长旺盛，3～4 d即可传代。取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红O着色（图2），可见胞质中不含脂质，与脂肪谱系细胞无相关性。细胞培养7代后仍然增殖旺盛。向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色，可观察到形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色（见图3），说明所培养的脂肪源干细胞有向成骨细胞分化的能力，有潜在的分化特性，具有干细胞特征。

3.2 大体观察

术后3～4 d动物轻度跛行，1周左右恢复正常。膝关节无红、肿、热等炎症现象。处死动物后见关节液清亮，关节囊无挛缩、粘连和新生物形成，滑膜无充血水肿，软骨无侵蚀，关节边缘无骨赘形成。

术后4周，A、B组缺损处修复组织基本相同，缺损处未完全填充，修复组织为灰白色，基底部呈深红色，未见明显的炎性肉芽组织；C组缺损处亦未完全填充，但修复组织呈黄白色外观，表面粗糙；呈连绵的小丘状，与周围关节软骨分界清楚。

术后8周，A、B组缺损处修复组织仍基本相同，缺损处未完全填充，但较前为多，修复组织仍为灰白色，表面粗糙，C组缺损处未完全填充，修复组织亦较以前为多，淡黄白色，表面变的光滑，有一定弹性，与周围正常软骨分界仍能辨认。

术后第12周，A、B组缺损多完全填充，基本为纤维组织状物覆盖，表面与正常软骨齐平，深灰白色，质软，与周围正常软骨组织分界清楚，易剥离；C组缺损区修复组织色泽、质地同正常关节软骨，表面光滑，与周围软骨组织界面平齐并完全整合，结合紧密，不易剥离，与周围正常软骨组织界限模糊（图4）。

3.3 组织学观察

术后4周，A、B组见缺损区凹陷，有血凝块，被覆纤维组织，甲苯胺兰染色呈无异染性着色的纤维组织；C组见少量增殖的类似幼稚软骨细胞的细胞和较少的基质，细胞排列稍紊乱、不规则，细胞形态较小，周围无典型的陷窝样结构，甲苯胺兰染色异染性不明显，未见明显的多核炎性细胞。

术后第8周，组织学与第4周相似，A、B组缺损区有纤维组织覆盖，有原纤维形成，呈波纹状走行，修复组织异染，少而不均匀；C组修复组织中可见到较多的类幼稚软骨细胞和基质，类软骨陷窝多见，细胞分布不均，呈明显的甲苯胺兰异染性着色。

术后12周，A、B组修复组织多为较厚的原纤维，少数未曾完全填充，原纤维呈波纹状排列，未见软骨陷窝形成，甲苯胺兰染色少而不均匀；C组修复的类软骨组织和周围的正常软骨基本连成一片，类软骨细胞的形态似正常软骨细胞，但排列非柱状，较正常软骨细胞不规则，类软骨细胞周围可见类软骨陷窝（见图5），未见炎性细胞浸润，甲苯胺兰着色较前均匀。

3.4 透射电镜观察

透射电镜下可见藻酸钙凝胶孔径大，交联较紧密、壁厚。A、B组4周可见到缺损处有较多的红细胞，8、12周缺损由纤维组织充填，多为层状排列的纤维组织，4周海藻酸钙部分降解，8周大部分降解；C组8、12周，修复组织中可见类幼稚软骨细胞，细胞呈圆或椭圆形，表面有不规则的突起，胞质中可见丰富扩张的粗面内质网和小而圆的线粒体，周围有较多的基质，周围基质内有纤细的纵横排列的胶原纤维(图6)。4周海藻酸钙部分降解，8周大部分降解。

3.5 统计软件分析结果

脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物移植组得分与其他两组相比各时期有显著性差异(P0.01)。（见表2） 表2 组织学评分时间

4讨论

关节软骨是一种高分化的组织，其自行修复后一般为纤维组织或纤维软骨组织，形成透明软骨组织的能力有限。软骨细胞移植可形成透明软骨修复［3］，但缺点是软骨细胞本身是高分化细胞，体外培养增殖能力有限，自体移植其取材过程也会对受损的关节产生额外的损伤并需要二次手术，过程繁琐且费用昂贵［4］。

组织工程技术为软骨缺损的修复带来了希望。骨髓基质干细胞的发现及其相关软骨组织工程应用研究较早，但骨髓基质干细胞取材、培养、诱导及移植相对较为麻烦，经济效果和临床效果也不理想。在体外培养条件下，脂肪源干细胞表现出与骨髓基质干细胞相类似的分化能力，而且具有易获得性、可迅速扩增及多向分化潜能等特点。本实验中，所培养的脂肪源干细胞，取材容易，培养、扩增效率较高，具有分化潜能，是优势较大的种子细胞。

当脂肪源干细胞在体外用软骨培养基培养时，能够被诱导成软骨系，组织学和组织化学明显显示软骨细胞的表型。在软骨源分化过程中有特征性分子如II型胶原、软骨寡聚蛋白和软骨蛋白聚糖表达，体外诱导和体内形成的软骨低水平表达X型胶原和I型胶原［5］。12周左右，C组修复组织为类软骨组织，透射电镜照片可见大量基质，也观察到了类似组织学结果。

Dragoo JL等［6］将脂肪源干细胞向软骨方向诱导后复合纤维凝胶移植到兔股骨髁全层软骨缺损处，结果显示修复效果较为满意。本实验的主旨是，由于不能判定诱导后植入，体内的真实生理环境是否会再次对经过诱导的细胞发生作用，与其通过人工的方法诱导后移植，增加了支出和过程的繁琐，不如省却人工模拟诱导的过程，将单纯细胞直接植入关节软骨缺损处，在转归过程利用真正的生理环境诱导分化，或许更能接近真实的修复。如果修复效果满意，将为软骨组织工程修复软骨缺损提供较为简单的方法。本实验中，脂肪源干细胞在植入前特意未进行软骨方向分化的诱导，而仅在证明其具有干细胞特性后，与藻酸钙凝胶混合后直接植入缺损处，最终所得的结果与Dragoo JL等的大体一致，这就提示，真实的生理环境诱导同人工诱导后植入差别不大。但因两种实验方法如造模及评价方法有些差别，是否的确如此，有待后继大规模动物对照实验进一步验证。 图1培养的脂肪源干细胞24 h后贴壁，态呈长梭形、三角形或多角形。倒置相差显微镜×200 图2培养的脂肪源干细胞爬片做油红0染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红0着色。右上角为阳性对照。苏木素油红0染色×200 图3成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色，形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色。Von Kossa染色×100 图4术后12周大体观察，A、B组缺损多完全填充，为纤维组织状物基本覆盖，C组修复组织类正常关节软骨，与周围正常软骨组织界限模糊 图5术后12周，A、B组修复组织多为较厚的原纤维，少数未曾完全填充，C组修复的类软骨组织和周围的正常软骨基本连成一片，类软骨细胞的形态似正常软骨细胞。图中箭头示为原缺损处。 HE染色×200 图6术后12周，C组修复组织中可见类幼稚软骨细胞，周围有较多的基质，周围基质内有纤细的纵横排列的胶原纤维。透射电镜×4 200

藻酸钠是从海藻中提取的线状多糖成分，与软骨基质中的蛋白多糖结构相似［7］ 。藻酸盐与钙离子等二价阳离子交联后可形成网格状结构的多孔材料，常呈胶冻样凝胶，作为可注射性支架材料常用于填补组织缺损，并作为细胞载体运用于组织工程。藻酸钙凝胶在生物体内通过酶解生成葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸单体，对机体无毒性，无免疫源性，具有良好的生物相容性。有实验结果表明，脂肪源干细胞在藻酸盐支架中向软骨方向诱导后，其与脂肪源干细胞表现出良好的兼容性［8］。在本实验中，6周左右，藻酸钙凝胶即完全降解，组织切片未见明显炎性细胞浸润，藻酸钙植入后，4～6周左右时已大部分分解，提示其作为组织工程载体具有良好的应用前景。同时实验中也观察到，并非所有C组的动物软骨缺损处都达到完全修复，原因有待进一步探究。

总之，脂肪组织在体内含量大，取材简单，利于脂肪源干细胞收集，又兼该细胞易于扩增，故脂肪源干细胞对于软骨缺损修复相关的软骨组织工程来说，是一种非常有希望的种子细胞。从脂肪源干细胞被发现并证明其具有多向分化潜能以来，随着时间的发展和相关研究的不断深入，脂肪源干细胞向软骨方向诱导技术已经成熟，其相关软骨组织工程研究的体内、体外实验效果都较为理想［6、8］，为软骨缺损的治疗提供了新的途径。但现有文献记载的相关动物实验中，其体内观察时间较短，远期修复效果有待进一步研究。本实验结果最终提示，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植修复关节全层软骨缺损近期效果也较为理想，对于关节软骨缺损修复是一种很有希望的简单有效的组织工程方法。

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第6篇：干细胞培养技术范文

李云涛Patrick Lee

著名美妆护肤专家，意大利KOEFIA国际学院教授。出版《美容QA大讲堂》《美妆秘技》《美丽认证》《我的第一本美颜彩妆金典》等美容图书。 新浪微博地址：http：///liyuntao

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扭转青春的干细胞美容

干细胞是一种具有自我更新和产生分化能力的细胞，尤其是在早期胚胎发育过程中，它可以产生构成身体器官各种类型的组织，生物学家将它们称为“全能性细胞”。到了个体发育的一定阶段，甚至成体，仍有一部分细胞负责组织的更新和修复，诸如血液、肠道黏膜上皮、皮肤表皮等。简单说，她不仅让肌肤恢复青春，甚至让你的身体恢复了青春！

那它是如何发挥作用的？细胞因子生物学效应的相互作用，可以是拮抗效应，或相加效应，或协同效应。细胞因子基因表达调控之间具有复杂的生物学活性，调节靶细胞的生长、增殖和分化；增强抗感染和细胞的杀伤效应；促进或抑制其他细胞因子和膜表面分子基因的表达，促进炎症过程；影响细胞的功能和代谢；参与和决定许多疾病过程的发生发展过程等。这样我们可以根据细胞网络多靶点、多环节地调节机体功能态平衡，从而达到“恢复青春”的效果。随着干细胞技术的日渐成熟，更多地被运用到我们微美丽的战争中，逆转时间的刻钟！

干细胞在美容美体方面的主要应用

自体干细胞隆胸是从身体腰、腹、臀、腿等部位提取脂肪组织，在体外分离扩增干细胞后，混合自身的脂肪颗粒，移植到胸部的一种隆胸术。

干细胞抗衰老

提取脂肪组织在体外分离扩增干细胞后，通过静脉点滴的方式输入到人体，通过干细胞的自我复制、归巢功能，从而到达对自身受损部位的修复、调理。

干细胞除皱同样是提取脂肪组织，分离扩增干细胞后，注射到人体真皮浅层从而达到对皱纹的填充以及对自身皮肤的改善。

干细胞能否在美容产品中起作用

随着科技物理提纯技术的不断进步，科学家采用纯物理提取方法从在深海鱼的鱼卵中提取了三个分子量的活性肽――鱼子多肽原液。在体外培养人体的上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞及角膜细胞的培养基中加入鱼子多肽原液，可显著加速这些细胞的分裂和增殖。发现鱼子多肽原液有非常明显的改善不健康的皮肤状态，如皮肤皱纹、松弛、色斑、暗痘、肤色灰暗等，并且是极其安全的。将鱼子多肽原液添加到美容化妆品中，可以有效地与皮肤细胞发生作用，发挥其突出的美容护肤功效，对于护肤品功能提高具有重要意义。

干细胞美容术的现状和潜在问题

所谓的干细胞美容术，大多都是直接注射所谓的干细胞针剂。所谓针剂，这是一种概念炒作。而国家药监局此前也曾表示，目前尚未批准过任何干细胞美容针剂产品。

第7篇：干细胞培养技术范文

1.1主要试剂和仪器设备PLGA支架（山东省医疗器械研究所），DMEM培养液（Gibco公司，美国），rhBMP-2（Peprotech公司美国），VEGF（Prospec公司，以色列），温度反应性培养皿（Nunc公司，丹麦），倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），JSM-840扫描电子显微镜（JEOL公司，日本）。

1.2实验动物选取由青岛大学医学院附属医院实验动物中心提供的健康杂种犬16只为研究对象，12～14个月龄体重18～23kg，雌雄不限。由青岛大学医学院附属医院实验动物中心在相同条件下饲养。

1.3方法

1.3.1BMSCs的获取、分离和培养将实验犬麻醉后抽取骨髓血10mL，密度梯度离心法分离BMSCs将BMSCs用培养液稀释到密度为每毫升1×107个后接种到50mL培养瓶中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。倒置相差显微镜下观察，达到80％汇合状态时，采用0.25%胰蛋白酶（含0.02%乙二胺四乙酸）消化，以1∶2比例传代。

1.3.2BMSCs成骨诱导将传代培养的第二代细胞加入6mL含10%胎牛血清、成骨诱导液[（4]50mg•L-1维生素C、10mmol•L-1β-甘油磷酸钠、1×10-4mmol•L-1地塞米松）的DMEM高糖培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，将BMSCs向成骨细胞诱导培养。1.3.3BMSCs细胞片层的制备采用胰蛋白酶消化经成骨诱导的BMSCs，在细胞计数后以每毫升1×10个的密度接种到温度反应性培养皿中，放置于37℃5%CO2饱和湿度培养箱中，每3d换液。10d后BMSC铺满培养皿底部，然后将培养皿放入20℃恒温箱中30min，BMSCs与温度反应性培养皿底部分离形成细胞片层。

1.3.4PLGA支架制备将PLGA支架修整为上底长3cm、宽1cm；下底长2.5cm、宽1cm；高1cm的多边体，并在背侧做一30mm×3mm×5mm凹槽，以备嵌入下牙槽神经血管束。利用冷冻真空干燥法将0.1μg•mL-1rhBMP-2和5μg•mL-1VEGF复合到PLGA支架中，低温消毒后，4℃冰箱保存备用。

1.3.5BMSCs接种和细胞片层包裹支架将诱导后的BMSCs用0.25%胰酶消化，加入培养液终止消化后，1000r•min-1离心5min，调整细胞密度，以细胞密度为每毫升1×107个植入到PLGA支架中，使支架完全浸湿，分为A、B组。A组在支架表面包裹2层BMSCs细胞片层，作为实验组；B组不包裹BMSCs细胞片层，作为对照组。置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养3d，取部分扫描电镜观察。

1.3.6动物体内植入将16只犬分为4组，每组4只，静脉麻醉成功后，在两侧下颌骨体下缘各做5cm切口，切开皮肤、筋膜及肌肉，暴露下颌骨体，在两侧下颌骨体中部各做一与支架相对应的上宽下窄全层梯形缺损，以防植入体脱出，注意保留下牙槽神经血管束。左侧（实验侧）植入支架A，右侧（对照侧）植入支架B。将下颌神经血管束嵌入支架凹槽中，严密缝合软组织，对支架进一步固定。术后每只实验犬每天肌注青霉素400万U，持续7d。

1.3.7大体观察、影像学检查和组织学检查术后4、8、12、16周分别处死1组实验动物，取出双侧下颌骨作大体观察。在同样投照条件下（电压：51kV，电流：4.13mA，时间：0.04s，投照距离：1m）拍摄标本X线片，用imageproplus6.0软件分析测量光密度值。实验侧与对照侧在相同部位分别切取部分标本组织，常规脱矿，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，制作组织切片，倒置相差显微镜下观察。

1.4统计学分析采用SPSS17.0软件对实验数据进行分析，对不同组同一时间点光密度值采用配对t检验，对同一组不同时间点光密度值采用单因素方差分析。

2结果

2.1细胞培养BMSCs接种后4h可观察到少量细胞贴壁；接种后24h，细胞呈不规则三角形。接种后10d，细胞达到100％汇合状态，并呈长梭形或旋涡状排列（图1）。向成骨方向诱导后，细胞逐渐变圆，排列紧密，部分细胞重叠（图2）。

2.2BMSCs细胞片层收获将诱导后的BMSCs接种到温度反应性培养皿中，7～10d后可见细胞铺满培养皿底部，细胞排列紧密，部分区域可见细胞层叠现象。将培养皿放置20℃环境中60min，可见贴壁细胞从培养皿边缘处开始脱离，逐渐收缩，最终整个从培养皿底部脱离形成完整的细胞片层（图3）。

2.3BMSCs细胞片层复合PLGA支架扫描电镜观察电镜下观察PLGA支架呈多孔网状三维立体结构，孔径为100～300μm。BMSCs植入及细胞片层包裹支架后3d，可见细胞伸出多个伪足黏附在支架材料表面及孔隙中（图4）。细胞片层及分泌的细胞外基质覆盖于支架表面（图5）。

2.4大体观察结果16只犬全部成活并进入结果分析。术后4周，支架材料被软组织包绕，可见明显支架结构，支架与周围骨断端分界明显，触之较软。实验侧与对照侧差别不明显。术后8周，双侧仍可见部分支架轮廓，骨断端与支架结合紧密，分界不清，支架下方有少量吸收，实验侧支架吸收量少于对照侧。术后12周，实验侧骨缺损大部分被新生骨组织修复，新生骨与正常下颌骨组织之间呈骨性愈合，骨断端处未见外骨痂；对照侧下颌骨下缘处骨缺损大于实验侧。术后16周，实验侧骨缺损大部分被新生骨替代，舌侧形成与正常骨相似的密质骨，与正常骨断端骨性愈合，硬度与周围骨组织相似（图6上）；对照侧成骨量小于实验侧，下颌骨下缘处仍可见骨缺损（图6下）。

2.5影像学观察结果术后标本X线片光密度值见表1。由表1可见，实验侧与对照侧标本X线片光密度值随术后时间延长逐渐增加，不同时间点之间差异有统计学意义（P<0.05）。术后同一时间点实验侧光密度值大于对照侧，两者差异有统计学意义（P<0.05）。术后16周，实验组光密度值最高，但仍低于周围正常骨组织（0.677±0.095）。植入材料8～16周可见不规则的骨小梁影，随时间增长，骨小梁增多、密集。骨断端处可见高密度骨折线（图7）。

2.6组织学观察植入后4、8、12、16周，两侧的组织学观察结果见图8。术后4周，实验侧可见少量新生骨组织，骨小梁纤细，可见纤维性骨痂、多核巨细胞；骨断端处纤维母细胞及新生血管较多。对照侧新生骨较实验侧少，骨小梁纤细，不规则，可见肉芽组织。术后8周，实验侧新生骨组织增多，骨小梁增粗，成骨活跃；髓腔周围见多个骨母细胞；骨断端处骨小梁排列紊乱，可见类骨质。对照侧成骨较实验侧少，骨小梁较细。术后12周，实验侧骨小梁较粗，增多，排列不规则，可见红骨髓，髓腔内血管丰富，周围骨母细胞多。对照侧骨小梁增多，较细，骨母细胞较实验侧少，血管较丰富。术后16周，实验侧骨小梁粗大，哈弗氏小管较丰富，周围有同心圆排列的板层样骨，骨细胞多且状态良好，可见红骨髓。骨髓腔中血管丰富，有较多钙盐沉积。对照侧骨小梁较粗，可见哈弗氏系统，但较实验侧少。

第8篇：干细胞培养技术范文

【关键词】胚胎干细胞;临床医学;应用

【中图分类号】R817.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）10-0123-01

一、引言

胚胎干细胞是一种存在于囊胚内的原始细胞团或存在于早期胚胎中的原始生殖细胞，在适当的条件下，它能够在体外进行无限次的扩增并保持未分化的状态。可以说，这是一种未分化的全能行细胞，它具有无限增殖性、多向分化性和可塑性等多种优良品质。人体正常的胚胎干细胞含有23对染色体，呈现出胞核大、胞浆小的形态特点，在体外培养时，它们会紧聚在一起，呈一个集落且没有明显的界线，通过适当的引导它可分化成人体所需各种细胞类型。上个世纪末期，美国科学家从早期的胚胎中取出原始生殖细胞，建立了最早的人类胚胎干细胞体系，这成为了人类继“人类基因组计划”之后的又一个热门话题，极大的轰动了国际学术界，目前，胚胎学已经成为了一门基础的医学课程。

从表面看去胚胎学与临床医学之间关系不大，但研究发展，许多疾病都发生在细胞层面、组织层面和分子层面，也就是说胚胎干细胞与临床医学息息相关。随着科学技术的进步，人类的认知能力会越来越强，胚胎学也将发挥越来越重要的作用。那么胚胎干细胞是怎么发展起来的呢，它到底又有什么样的发展前景呢，为此，本文在前人工作的基础上总结了胚胎干细胞的发展过程和临床应用研究。

二、胚胎干细胞的研究进展

人们对胚胎干细胞的研究开始于胚胎癌细胞或者说畸形胎瘤干细胞。1958年，有人把胚胎干细胞移植到小鼠精巢或肾脏的被膜下，能够得到小鼠的相应细胞。1974年，科学家把胚胎干细胞注射到正在发育的胚泡腔后，胚胎干细胞能够发育成胚胎嵌合体。到了70年代末期，人们已经形成了用正常的胚胎干细胞作为遗传物质载体来研究基因对胚胎发育影响的思想。

1981年哺乳动物胚胎干细胞研究进入了它的新纪元时代，这年科学家利用小白鼠胚胎，在体外培养分离出了其干细胞并建立了类胚胎干细胞。在随后的7~8年里，科学家相继用延迟着床的办法建立了仓鼠、兔、羊、猪、牛以及水貂的类胚胎干细胞。1994年，美国科学家分离得到了人类的传2代胚胎干细胞。1998年，科学家用类似的方法分离并克隆出了可以传32代的人类胚胎干细胞，在这研究过程中科学家成功完成了人类胚胎干细胞的冷冻和解冻实验，该项研究成果被美国时代杂志评为上世纪九十年代“世界十大科技进展”之首。

本世纪初，美国科学家卡茨和赫德里克研究培养出了成体干细胞。这种细胞是由从人的大腿或臀部抽取少量脂肪和液体培养而来，它们能够在适当的引导条件下发育成健康的肌肉、骨细胞和软骨，保持了胚胎干细胞发育成各种组织和器官的全能性。这一成果有可能使脂肪组织成为干细胞的主要来源，解决了科学家必须从骨髓或胚胎组织中提取干细胞的难题。

三、胚胎干细胞的临床应用

胚胎干细胞具有良好的自我更新功能，在给予合适的信号诱导或在适当的外界条件下，它可以分化成构建人体的不同细胞，用这类细胞分化成的特定器官进行移植时，排除了免疫排斥过程。所以说，胚胎干细胞作为一种“种子细胞”一定会在临床应用中有重要的应用，目前，应用最多最成熟的还是自体干细胞移植。

有了自体干细胞移植，在病床上躺了三个月的35岁的李先生又重新站了起来。今年上半年，李先生因交通事故，造成第四、第五胸椎粉碎性骨折，神经中枢受损，导致双侧以下失去感觉，大小便失禁，肌肉萎缩，下肢瘫痪。检查表明脊髓呈横贯性损害，医生决定为李先生进行自体骨髓干细胞移植。手术一月后患者的身体感觉平面已经恢复到了膝关节，三个月后下肢肢体触觉全部恢复，在搀扶下可站立10多分钟，并能借助轮椅自理生活。

3.1用于治疗遗传病、癌症等疾病

癌症、遗传病是人类目前最严重的医学难题，发生这些疾病是因为细胞在转化和分化的过程中出现异常。胚胎干细胞技术的出现为弄清细胞分化、发育过程，更深刻的了解细胞分化的奥秘提供了方法，为治疗上述疾病提供了崭新的手段和可能性。科学家已利用胚胎干细胞制造出许多小鼠的疾病模型，并使人的致病基因在小鼠体内表达，为下一步治疗人类疾病奠定了坚实的基础。美国国家神经病研究所分子学实验室用小鼠胚胎干细胞诱导神经上皮细胞，植入脑内得到大量的小突状细胞和神经胶质细胞，设想可用来治疗多发性硬化症。

3.2用于器官组织移植

作为一种被称之为种子细胞的胚胎干细胞，为临床的组织，器官移植提供大量材料。胚胎干细胞经过免疫排斥基因剔除后，再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥。这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。美国ACT公司将人皮肤细胞核移植到去除所有遗传信息的牛卵母细胞中，培育出具全能性的胚胎干细胞。如果能将其成功地应用于临床，将来许多疑难疾病都将得到根治，对其他若干疾病也有理想的治疗效果。

3.3用于新药研制和开发

应用胚胎干细胞研究可以大大改变研发药品及其安全性检验。因为从理论上讲胚胎干细胞可以在体外培养出人体的210种不同类型的细胞。故可以对不同药物进行不同细胞类型的细胞水平的致畸形实验和药物筛选，使药品研制过程更趋合理有效并避免消耗大量实验动物。如应用胚胎干细胞培养成大量心肌细胞，将有助于心脏病药物的开发等。此外，胚胎干细胞还将用于出生缺陷、不孕、流产的控制与检测等方面。

四、结语

展望本世纪，生物医学工程将是一个被高度发展的世纪，现在人们意识不到的许多事件都将会出现在人们的面前，如生物经济将取代目前的网络经济。胚胎干细胞技术的应用价值不可估量，目前，其已成为了各国研究焦点之一。不过，从胚胎干细胞研究到实际临床应用之间还会有很长的一段路要走。

胚胎干细胞研究不是一个潮头，它将是一个巨大的推动力，推动着生物医学深刻革命，给人类带来更多的福音!到那时，如人们的某组织器官失灵了，完全可以像更换机器零件那样，用自身的成体干细胞定向诱导分化形成的组织器官替代失灵器官，而不担心供体不足的问题，更不用担惊受怕移植排斥的问题。

参考文献

第9篇：干细胞培养技术范文

【关键词】胚胎干细胞；临床医学；应用

【中图分类号】R817.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）10-0123-01

作者：李响

一、引言

胚胎干细胞是一种存在于囊胚内的原始细胞团或存在于早期胚胎中的原始生殖细胞，在适当的条件下，它能够在体外进行无限次的扩增并保持未分化的状态。可以说，这是一种未分化的全能行细胞，它具有无限增殖性、多向分化性和可塑性等多种优良品质。人体正常的胚胎干细胞含有23对染色体，呈现出胞核大、胞浆小的形态特点，在体外培养时，它们会紧聚在一起，呈一个集落且没有明显的界线，通过适当的引导它可分化成人体所需各种细胞类型。上个世纪末期，美国科学家从早期的胚胎中取出原始生殖细胞，建立了最早的人类胚胎干细胞体系，这成为了人类继“人类基因组计划”之后的又一个热门话题，极大的轰动了国际学术界，目前，胚胎学已经成为了一门基础的医学课程。

从表面看去胚胎学与临床医学之间关系不大，但研究发展，许多疾病都发生在细胞层面、组织层面和分子层面，也就是说胚胎干细胞与临床医学息息相关。随着科学技术的进步，人类的认知能力会越来越强，胚胎学也将发挥越来越重要的作用。那么胚胎干细胞是怎么发展起来的呢，它到底又有什么样的发展前景呢，为此，本文在前人工作的基础上总结了胚胎干细胞的发展过程和临床应用研究。

二、胚胎干细胞的研究进展

人们对胚胎干细胞的研究开始于胚胎癌细胞或者说畸形胎瘤干细胞。1958年，有人把胚胎干细胞移植到小鼠精巢或肾脏的被膜下，能够得到小鼠的相应细胞。1974年，科学家把胚胎干细胞注射到正在发育的胚泡腔后，胚胎干细胞能够发育成胚胎嵌合体。到了70年代末期，人们已经形成了用正常的胚胎干细胞作为遗传物质载体来研究基因对胚胎发育影响的思想。

1981年哺乳动物胚胎干细胞研究进入了它的新纪元时代，这年科学家利用小白鼠胚胎，在体外培养分离出了其干细胞并建立了类胚胎干细胞。在随后的7~8年里，科学家相继用延迟着床的办法建立了仓鼠、兔、羊、猪、牛以及水貂的类胚胎干细胞。1994年，美国科学家分离得到了人类的传2代胚胎干细胞。1998年，科学家用类似的方法分离并克隆出了可以传32代的人类胚胎干细胞，在这研究过程中科学家成功完成了人类胚胎干细胞的冷冻和解冻实验，该项研究成果被美国时代杂志评为上世纪九十年代“世界十大科技进展”之首。

本世纪初，美国科学家卡茨和赫德里克研究培养出了成体干细胞。这种细胞是由从人的大腿或臀部抽取少量脂肪和液体培养而来，它们能够在适当的引导条件下发育成健康的肌肉、骨细胞和软骨，保持了胚胎干细胞发育成各种组织和器官的全能性。这一成果有可能使脂肪组织成为干细胞的主要来源，解决了科学家必须从骨髓或胚胎组织中提取干细胞的难题。

三、胚胎干细胞的临床应用

胚胎干细胞具有良好的自我更新功能，在给予合适的信号诱导或在适当的外界条件下，它可以分化成构建人体的不同细胞，用这类细胞分化成的特定器官进行移植时，排除了免疫排斥过程。所以说，胚胎干细胞作为一种“种子细胞”一定会在临床应用中有重要的应用，目前，应用最多最成熟的还是自体干细胞移植。

有了自体干细胞移植，在病床上躺了三个月的35岁的李先生又重新站了起来。今年上半年，李先生因交通事故，造成第四、第五胸椎粉碎性骨折，神经中枢受损，导致双侧乳头以下失去感觉，大小便失禁，肌肉萎缩，下肢瘫痪。检查表明脊髓呈横贯性损害，医生决定为李先生进行自体骨髓干细胞移植。手术一月后患者的身体感觉平面已经恢复到了膝关节，三个月后下肢肢体触觉全部恢复，在搀扶下可站立10多分钟，并能借助轮椅自理生活。

3.1用于治疗遗传病、癌症等疾病

癌症、遗传病是人类目前最严重的医学难题，发生这些疾病是因为细胞在转化和分化的过程中出现异常。胚胎干细胞技术的出现为弄清细胞分化、发育过程，更深刻的了解细胞分化的奥秘提供了方法，为治疗上述疾病提供了崭新的手段和可能性。科学家已利用胚胎干细胞制造出许多小鼠的疾病模型，并使人的致病基因在小鼠体内表达，为下一步治疗人类疾病奠定了坚实的基础。美国国家神经病研究所分子学实验室用小鼠胚胎干细胞诱导神经上皮细胞，植入脑内得到大量的小突状细胞和神经胶质细胞，设想可用来治疗多发性硬化症。

3.2用于器官组织移植

作为一种被称之为种子细胞的胚胎干细胞，为临床的组织，器官移植提供大量材料。胚胎干细胞经过免疫排斥基因剔除后，再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥。这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。美国ACT公司将人皮肤细胞核移植到去除所有遗传信息的牛卵母细胞中，培育出具全能性的胚胎干细胞。如果能将其成功地应用于临床，将来许多疑难疾病都将得到根治，对其他若干疾病也有理想的治疗效果。

3.3用于新药研制和开发

应用胚胎干细胞研究可以大大改变研发药品及其安全性检验。因为从理论上讲胚胎干细胞可以在体外培养出人体的210种不同类型的细胞。故可以对不同药物进行不同细胞类型的细胞水平的致畸形实验和药物筛选，使药品研制过程更趋合理有效并避免消耗大量实验动物。如应用胚胎干细胞培养成大量心肌细胞，将有助于心脏病药物的开发等。此外，胚胎干细胞还将用于出生缺陷、不孕、流产的控制与检测等方面。

四、结语