硬组织工程材料评析

1生物学评价

1．1组织学评价

硬组织切片技术的应用始于Donath等［16］1982年报道，该技术改变了传统组织切片需先脱钙才能切片的方法，使附着有软组织的骨组织不经脱钙即可切成5～15μm薄片，以供组织学染色检查，这种效果是常规石腊切片或树脂切片观察所不能代替的。硬组织切片技术可使植入物－组织界面及周围软组织结构保持完整。界面骨组织的量和特性，可用相应的组织形态测量工具来测定。该技术的主要特点是可以测量分析关节假体和螺钉等金属植入物材料的骨整合。至于材料的生物相容性、材料表面结构形态的生物学效应以及材料负荷前后的具体组织学变化，均可在细胞学水平上得到满意分析［17，18］。相比而言，常规组织学切片需要标本脱钙和脱金属，因此无法得到上述数据。应用硬组织切片技术也能研究到硬组织工程材料被多核巨噬细胞吞噬的积极吸收过程，界面组织的巨噬细胞胞质内有时可观察到植入材料颗粒。随着技术改良，硬组织切片逐渐克服了界面裂隙和材料脱片等问题［19］，已经成为评价植入物材料骨整合的金标准。常规染色，包括苏木精－伊红（HE）染色、甲苯胺蓝染色及Masson染色等。HE染色主要用于观察植入材料周围淋巴细胞、巨噬细胞浸润情况，材料与周围软组织的关系及材料对骨膜成骨的影响；甲苯胺蓝染色后成骨细胞、破骨细胞、骨细胞呈蓝色；Masson染色后骨小梁呈蓝色，成骨细胞、破骨细胞呈粉红色，类骨质为大红色［20］。这些成熟的染色技术，是目前骨整合组织学评价中常用的组织显色方法。免疫组织化学染色，是目前骨整合分子机制研究中的一个重要方法。它应用免疫学基本原理———抗原抗体反应（即抗原与抗体特异性结合），通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，以确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质等）并对其进行定位、定性及定量研究，故称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。目前研究已知，骨整合过程中存在一些重要的小分子“信使”，通过特定的信号转导途径介导骨整合形成；一些骨组织中的局部生长因子，如转化生长因子（TGF）－β、骨形态发生蛋白（BMP）、胰岛素样生长因子（IGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等，通常以自分泌和（或）旁分泌形式调节细胞增殖分化，促进界面骨组织修复愈合。免疫组织化学染色方法可以将这些小分子显现出来，进而对其分布、密度等参数进行分析［21］。亲骨荧光素染色法，在界面新骨形态计量研究中占据重要地位。四环素与新生骨组织中的钙螯合后，在紫外线激发下可发出强烈的黄绿色荧光，因此在荧光显微镜下很容易观察界面新生骨质。荧光双标记技术则可评估骨形成速度，通常分2个时间点给实验动物注射四环素（或者第一次使用四环素标记，第二个时间点采用钙黄绿素标记，以达到不同荧光显色的效果），处死动物后制作硬组织切片，并通过测定2条荧光带之间的宽度等参数来计算骨质沉积速度（骨矿沉积率＝2条荧光标记线之间距离／标记间隔时间）［22］。此外，茜素红染色也适用于对材料生物活性的体外研究，其原理是利用茜素红与钙发生反应可产生深红色的化合物，使在材料表面接触培养的成熟成骨细胞分泌沉积的钙结节被明显染色，并通过计算钙结节大小和密度等参数来判定材料促进成骨的能力。

1．2细胞与分子生物学评价

材料植入体内时存在成骨细胞与其他细胞（如成纤维细胞等）的表面竞争贴附，因此在评估种植材料的生物活性时观察材料是否能够促进成骨细胞在其表面早期大量附着，并形成良好的细胞形态和功能，是一个重要指标［23］。在众多材料－骨界面体外实验模型研究中，都将成骨细胞在种植材料表面的增殖能力和功能表达，视作评价材料生物活性的一项重要参数［24］。扫描电镜可以清晰直观地观察研究体外培养的成骨细胞在材料试样表面的接触、黏附、伸展、分裂增殖、分泌细胞外基质和凋亡过程。但是，扫描电镜仅能对体外标本进行观察，无法对植入物的体内骨整合进行评价，而目前体外实验还难以模拟出复杂的体内微环境，因此目前扫描电镜观察仅可作为一种材料骨整合的辅助评价手段［25］。四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法和新型四甲基偶氮唑盐（MTS）比色法的原理相似，即活细胞中的线粒体脱氢酶可将3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐还原而产生紫色结晶物，其结晶量与活细胞数量成正比。MTT溶解液萃取紫色结晶物后用酶标仪测定490nm处的光密度（OD）值，可反映活细胞数目。MTT法不足之处是产生的还原产物不溶于水，添加溶解液萃取的同时也使活细胞裂解死亡，不利于对材料－细胞相互作用的动态研究。经改良，MTS法的还原产物可溶于细胞培养液，提取简便，不损害实验细胞［26］。骨钙素是由分化成熟的成骨细胞分泌的一种非胶原骨基质蛋白，是骨形成的决定因素，能够调节矿物质形成速率和方向。碱性磷酸酶（ALP）是参与骨组织再生、代谢的一种重要物质。利用试剂盒测定在材料表面接触培养的成骨细胞外骨钙素水平，以及在细胞内的ALP活性变化，可以了解成骨细胞分化成熟程度和细胞成骨矿化能力，从而反映材料的生物活性。ALP高表达可以启动细胞外基质矿化和钙磷沉积过程，它的作用可能是通过促进机体局部形成高浓度PO43－，从而为骨组织内羟基磷灰石（HA）的成核、结晶提供条件。逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）技术，是将RNA的反转录和互补DNA（cDNA）的聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术，可用于检测细胞中基因表达水平。骨组织中成骨细胞的分化和增殖受到多种细胞因子的调节，因此对骨组织细胞因子的研究显得尤为重要，RT－PCR技术可以对BMP、纤维粘连蛋白、血管内皮生长因子、骨保护素等多种骨组织细胞因子的mRNA进行定量分析［27］。Kodama等［28］报道对钛基进行表面改性，并利用RT－PCR技术检测其表面成骨细胞中骨粘连蛋白和骨钙素mRNA水平，以评价其表面的骨形成能力。

2医学影像学评价

医学影像学技术在过去10多年发展迅猛。双能X线吸收法（DXA）、外周骨定量CT（pQCT）和显微CT（micro－CT）等已广泛运用于临床和基础骨形态计量学研究，可提供骨（面、体）密度和微观结构的重要数据。纳米CT（nano－CT）已在实验室得到应用，主要用于骨陷窝数量、大小和形态的定量研究。MRI技术有了很大发展，不仅可描述关节软骨形态，还可定量软骨体积和生化成分的变化，其扩散张量成像（DTI）技术更可定量评价胶原纤维网络的连接性和方向排列；MRI分辨率也不断提高，目前临床使用的3TMRI和试验使用的7T显微MRI（micro－MRI）均已达到微米级别［29］。因此，医学影像学技术已成为骨关节疾病临床早期诊断和预后判断的希望所在。随着计算机软硬件水平的提高和有限元技术在生物力学中不断深入应用，近年关于骨与关节生物力学研究已从传统的对骨性结构的简单线性模拟，逐渐提高到对骨与关节及其附属韧带与肌肉组织的非线性仿真计算上。利用影像学技术（主要为CT和MRI）数据采集模式获取原始数据，通过高仿真度非线性三维有限元分析与先进的生物力学离体标本测试手段探讨骨与关节非线性力学特征，可为骨与关节稳定性评估、骨与关节功能重建、骨科植入物研制、关节假体设计、脊柱畸形矫正等临床重点难点问题提供理论指导。

2．1X线检查

通过廉价简便的X线摄片可随时观察植入物位置，并对植入物在体内情况进行评分，通常参考Lane－SandhuX线片评分标准［30］。Tiedeman等［31］研究认为，这一评分标准与评价骨缺损愈合情况之骨密度、骨刚度、骨干重及抗扭曲强度等常用客观指标有高度相关性，因此仍在一些实验研究中应用。但是，普通X线检查对骨组织与生物材料界面的评估既缺乏敏感性也缺乏特异性，故目前仅用于对植入物置入位置及植入情况作简单筛查。有研究将X线与组织切片技术相结合，得到高分辨率图像，并应用此技术对生物材料与骨组织界面上的相互作用进行评价。

2．2micro－CT

常规CT检查由于分辨率偏低、金属伪影较大等限制因素，一直无法广泛应用于生物材料与骨组织界面的分析研究，但是随着micro－CT的产生，CT分辨率得到极大提高，扫描协议的改进也显著减少了伪影干扰。近年来，有相关研究探讨了含有金属植入物骨组织标本的界面分析，如在关节假体松动模型中对金属植入物－骨界面的评价，micro－CT扫描较传统的硬组织切片方法具有更高的分辨率（最小可达2μm），同时通过三维重建可精确测量骨标本内部骨小梁三维结构参数与密度参数［32，33］，并可获得三维立体的植入物－骨界面信息，对骨整合的评价更加客观和全面。然而由于目前仍存在技术上的缺陷及缺乏有效的评价方法，micro－CT对骨整合的评价受到限制。一方面金属物均会产生较强伪影，可干扰金属与骨组织界面接触的观察和定量分析［34］；另一方面，由于软件分析方面的限制，对骨整合界面的分析仍然停留在对金属物内骨长入量、骨小梁结构、骨密度等方面的简单评价，而这些指标并不能客观、有效地评价植入物与骨组织之间的相互作用及结合强度，对骨整合及假体松动等的评价仍然缺乏说服力。但不可否认，随着扫描协议的改进及图像分析技术的提高，micro－CT对骨整合的评价仍然是今后的一个热点。

2．3micro－MRI

近年来，MRI对于骨组织的显像开始受到关注并取得了一些进展，定量MRI显像为骨小梁的结构和功能研究提供了新的手段。它可以为一些疾病的进展和转归提供不同于CT的结构信息。此外，MRI技术为骨丢失机制研究提供了完全无创的途径，在一定程度上可补充甚至取代骨活检功能。然而，目前在图像的获取与处理方面仍然有许多技术问题。受目前技术限制，MRI分辨率仍然不能够满意地评价骨小梁结构，而且这种对于骨小梁结构的有限分析仍主要局限于四肢骨骼，而临床最为常见的骨折多发生于股骨近端和椎体。通过场强提高、脉冲技术改进以及参数矫正技术，一些不足正在得以改进。与CT和X线相比，micro－MRI不仅能够区别出骨与非金属类植入材料，而且可以将不同类型的软组织区分开来。目前的研究显示，micro－MRI图像上的信号强度与组织学切片上组织结构有明确关联。有研究［29］认为，micro－MRI可用于分析脊椎融合过程中非金属类植入物材料的骨整合过程，同时也可用于监控可生物降解的网笼材料的降解过程；micro－MRI在评价与分析生物可降解性材料和非金属类材料骨整合中将起到重要作用。随着MRI分辨率不断进步，临床上运用MRI对这些材料的骨整合进行评价和分析将为之不远。总之，micro－MRI有望成为评价早期骨整合的重要方法之一，在科研和临床上发挥更大作用。

2．4核医学显像

临床上，核医学显像在鉴别硬组织工程材料在人体内骨组织界面发生的是无菌性抑或感染性松动方面，具有独特优势。单纯X线平片在两者鉴别上既不灵敏也不特异，而CT断层显像及MRI因受到伪影的干扰而作用也十分有限，核医学显像反映的主要是病变的生理变化而不是解剖结构，因而不受假体伪影的干扰，是目前比较公认的首选方法。单纯99锝－亚甲基二膦酸盐（99Tc－MDP）静态显像具有良好的阴性预测值，且可明确指出松动的具体部位，对术前评价病情有重要意义，可作为一项初步检查。以往比较经典的99Tc－MDP静态显像判断假体无菌性松动或感染性松动的标准是将沿着假体周围呈弥漫性分布的异常放射性浓聚判断为伴发感染，而认为假体远端或两端骨组织放射性增高多为单纯假体松动所致。可是有研究报道，99Tc－MDP静态显像对鉴别假体无菌性与感染性松动的准确率并不高。因此，有学者试用骨三相显像来鉴别假体无菌性和感染性假体松动［35，36］，并显示较高的特异度和敏感度。近年通过与CT技术相结合，核医学显像技术得到新发展。单光子发射CT（SPECT）与正电子发射断层显像（PET）同样是功能性评价技术，它们与CT相结合后即产生SPECT／CT和PET／CT技术，相比一般核医学成像，多了CT利于定位的优势［37，38］。近年这种技术开始应用于对金属植入物骨整合的评价［36］，其中对植入物相关性骨髓炎的诊断就很有价值［39］，其原理是基于对注射到患者体内的一种放射性物质产生的正电子进行检测，而PET和CT联合成像将使感染的诊断更加准确、及时。但是PET／CT对金属植入物界面的评价也存在明显缺陷，即PET／CT图像中金属伪影仍然比较明显［40］。目前可通过多种方法减轻金属植入物对PET／CT成像的影响，其最为彻底的办法还有赖于CT重建算法的发展。针对消除金属伪影的各种CT重建算法的效果已得到一定证实，但部分成果还未完全应用于临床，还需要经过更多模拟和临床试验对这些方法的可靠性进行评估。

3生物力学分析

3．1传统分析方法

近年有学者提出假体生物力学相容性的概念，认为良好的应力分布是人工关节取得理想效果的前提条件。常用研究植入物生物力学性能的指标，包括顶出实验、牵拉实验、扭转实验等［41，42］。植入物的拆卸扭力常作为反映骨整合的生物力学尺度，因而植入物拆卸扭力增大，能反映种植体骨整合强度的增加［43］。对于植入物－骨界面形成骨整合后的力学分析实验或模型的研究很多［41－44］，总体上传统生物力学分析方法仍是目前评价植入物骨整合中生物力学参数的金标准，然而由于其为有创性等缺点，目前主要应用于体外研究，并且难以对骨整合的生物力学参数进行动态分析。

3．2有限元分析方法

由于标本来源受限、实验条件控制困难等原因，实验生物力学的研究受到一定限制。计算机有限元分析法应运而生。有限元这一概念最早出现于20世纪40年代，有限元分析法是一种用于结构分析的矩阵方法，其在机械工程学的成功应用促进了其在生物学领域的应用研究。有限元分析法应用于骨生物力学研究已有30余年，并在人工关节、假肢等领域取得广泛成功［45－47］。在人工关节领域［46］，有限元分析法主要应用于对关节假体松动的力学分析，其中包括应力分析、摩擦界面磨损分析、固定界面微动分析、关节活动度及稳定性分析、骨整合和改建过程模拟等方面。假肢残端与接受腔形成的人机界面［47］，是生物力学分析的另一个重要方面，也是有限元分析的另一个重要应用领域，但是与其他力学问题不同的是，建立人机界面有限元模型，需要人体组织力学性能，而且更深入的问题是外力作用对人体组织的影响。Belytschko等［48］于1974年首次将有限元分析法用于脊柱生物力学研究，近几十年来有限元分析法在脊柱生物力学研究中的应用日益广泛与深入［49－51］。由于植入物骨整合的复杂性，以往的实验方法如电测法、光弹法等，难以获得全域性信息。有限元分析法具有无创性、全息性的独特优势，尽管目前仍然存在数学模型建立困难、难以建立合理的复杂问题简化模型等问题，但今后仍可能成为生物力学分析的主要方法，具有广阔前景。

4结语

近年骨科临床和医疗器械制造业对于硬组织工程材料骨整合评价的需求均急剧增加，传统生物学分析方法、新兴医学影像学及生物力学分析法由此得到重要改良和发展。一方面，传统分析方法对生物材料骨整合的评价更趋于完善，并规避了一些常见问题，对骨整合的评价也越来越全面、深入，在分子和基因水平评价分析骨整合、探究机制方面取得了很多新成果；另一方面，新兴医学影像学及生物力学则为界面骨整合的分析提供了一种活体、无创、立体直观、动态的分析方法，在很多方面弥补了传统分析方法的不足，成为传统分析方法对骨整合评价的重要补充。可以预见，上述评价方法将继续发展和改进，尤其是免疫组化技术、转基因技术、micro－MRI／micro－CT以及有限元分析法等，有望为硬组织工程材料骨整合机制研究与应用评价作出更大贡献，最终助力于研发出性能更加优异的医用材料。