细胞生物学的研究精选(九篇)

第1篇：细胞生物学的研究范文

研究性学习 细胞生物学 实践教学

教学模式不是固定不变的公式。任何教师组织研究性学习都不能机械地套用它；同时，任何学生都没有一成不变的学习方式。细胞生物学作为一门理论性与实践性较强的学科，其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域。面向21世纪，为了跻身世界先进行列，为了完成我国高等教育“培养具有创新精神和实践能力的专门人才”的光荣任务，深化高等教育改革势在必行。深化高等教育改革的关键在于探索以培养学生创新能力为重点的新型教学模式。为了能在有限的课时内，让学生在理论与实验技能方面有一个全面的提升，笔者将研究性学习模式引入细胞生物学实践教学。

一、中国高校实践教学的困境

过去很长一段时间，实践教学由于受到主、客观因素的束缚，从总体上说不很令人满意。主要表现在门类众多、内容单一、重复严重、学时不够、方式呆板、考核不力等诸多方面。

1.课时减少，内容滞后。实践教学课时减少，是近几年新教学计划的特点之一。课时的减少与加强实验课、扩充实验内容的普遍趋势形成尖锐的矛盾。由于学科的高速发展，使得实践教学满足不了与理论接轨，往往实验内容滞后于理论发展，存在着很多缺陷。而随着教学形势和任务的改变，这些弊端显得更加突出，影响了该学科教学质量的提高。

2.教学方法单一陈旧。不少教师观念保守，满足于完成既定教学任务，只教书，不育人。集中表现在因循知识的“注入”而不重视思维的启迪；固守教师在课堂上信息的单向传递，而不重视学生的主动参与；局限于基本教材的知识面而不重视引导学生涉猎更广泛的知识领域。“让学生成为学习的主体”、“让学生学会学习”还未能得到落实。因而，我国大学生的独立性、批判性、创造性、应用性等能力与国外大学生相比显得较差。

3.考核方法片面。一般是根据学生的实验报告来直接打分，但是这样做的弊端是教师的主观性较大，同时对学生实际的实验操作掌握水平很难有一个正确的评价，较难客观的反映实践教学的效果。

二、研究性学习模式引入细胞生物学实践教学

1.统筹课程安排，改进实验方案。不开设验证性的实验，只开综合性、系统性强的实验，将学术研究比较成熟的研究结果改造成符合实验教学要求和特点的综合性实验。系统教授完理论课程后，利用集中的几周时间进行实验教学，使理论课和实验课有一个有效的衔接，使学生能够系统掌握细胞生物学的基本实验技能。

2.自编实验教材，重新设置内容。在实验教学过程中，根据精选的教学内容，编写了《生物学实验教程》实验指导书；在教学过程中，以自编教材为主，并参考其他辅助教材。教师只讲解基本的操作方法和技术，既不是严格的实验顺序，也不是标准的操作程序，学生可根据自己的实验方案参考使用。

为学生创设实际情境，以便提出高质量问题，并以“课题研究”作为载体，激励学生寻找问题的答案。这些问题应该是：

（1）新的，即呈现的是不熟悉的情境；（2）在学生的能力范畴之内，即在先前学会的知识和技能的范围之内时。学生自主组队，根据提出的问题，选用合适的实验方法，解决问题。

3.全面开放实验室，以科研带动教学。实验室开放是实验教学方式、手段的革新，我们要树立教学与科研相结合的思想，“以科研促教学，以教学带科研”，在教学中研究，在研究中教学。实验室的开放包含两个方面：实验设备资源的开放和教学方式的开放。实验设备资源的开放，即学生可以合理选择、使用适合的实验仪器设备，完成实验项目。教学方式的开放，也就是教与学的开放。主要表现在学生对实验内容、实验方法等的选择，实验运行的环节，完成实验的形式，以及指导教师指导方法的开放，强调学生的主体地位。

4.利用网络，实时指导。由于现代教学手段的广泛应用，基于校园网的Black Board网络平台已经成为传统教室的延伸。教师和学生可以通过网络随时进行交流和答疑。充分利用计算机辅助教学实验软件和多媒体教学课件。网络的充分利用可以实现教师与学生之间的实时互动，大大提高实验教学的效率。这种教学方式不受时间和空间的限制，充分利用了师生的空闲时间。

5.建立合理的考核机制。实践教学的效果不应该由原有单一的考试或实验报告成绩老考核。我们的教学目标直接指向学生多方面的发展变化，因此评价的指标也应该以学生多方面的发展变化为依据。以现代的教学质量观来指导学生学习效果的评价，必须以是否有利于学生的进步与发展作为考核指标。如可由实验态度（10%）、基本理论（15%）、操作技能（50%）、实验结果（25%）综合评定产生。实验考核以学生实际操作技能和分析解决问题的能力为主。

三、结束语

总之，在当前高校课程实践教学中，改革的目的是改变传统教学中的一些不合理的教学方法和手段，提高教学质量，激发学生的创新思维，促进学生学习的自觉性和主动性，使培养的学生更能适应现代社会发展对生物类专业专门人才的需求。

细胞生物学实验是一门重要的实验课程，把握好理论课程和实验课程的有效衔接，才能真正提高实验教学的质量和效果。在本科生中开设细胞生物学实验这样的综合性实验课的改革是一个系统工程，除了在教学实践中不断改进教学方法外，我们教师自身也要为人师表，不断提高自己，以科研工作充分带动教学，应在教学过程中对应学生自身的特点，根据自己的学科特点和学生未来发展的不同要求对他们进行因材施教，培养更多高素质的人才。

参考文献：

[1]刘慧莲.细胞生物学实验教学改革探索[J].潍坊学院学报，2008，8(2)：154-156.

第2篇：细胞生物学的研究范文

关键词： 细胞生物学 考试方法 改革策略

细胞生物学作为生物学相关专业的基础课程，其考核环节一直为我国高校相关专业所重视。传统细胞生物学课程的考试环节主要以闭卷检测作为考核方式，以考试分数作为标准对学生的学习能力及学习成绩进行评定。这种考核方法难以有效地反映学生的综合素质，因此对细胞生物学课程考试方法进行改革具有一定的必要性。

一、细胞生物学课程考试改革的原则与思路

（一）考试方法改革原则

由于细胞生物学课程专业性及理论性较强，对该课程考试的改革应以培养学生的自主创新能力及动手实践能力作为切入点，根据学生的实际专业需求及个人能力的差异性对学生能力进行评价[1]。对专业成绩的评述不应单纯地以闭卷理论试卷成绩为最终成绩，应当综合评价学生日常课堂表现、实验课表现及课堂讨论等环节表现出的能力，并对成绩比例进行合理分配，具体考试方案由各专业教研部门自行确定。通过引入综述论文、课堂发言、实验课表现等环节的成绩评定，可以有效提高学生的学习兴趣。

（二）考试方法改革思路

对细胞生物学课程考试方法的改革，主要将考试成绩合理地划分为“闭卷理论考试（60%）+论文综述（10%）+实验课表现（20%）+日常课堂表现（10%）”四个部分。

1.对学生日常课堂表现进行评价

学生的学习活动以课堂学习为主，因此对学生日常课堂表现进行客观评价可以有效地反映学生细胞生物学课程的知识水平及能力基础。因此，将细胞生物学课程考试成绩中的10%作为日常课堂表现的分值，主要对学生课堂参与程度、讨论问题积极性、师生互动与沟通、课堂出勤率等方面进行考察，从而有效地提高细胞生物学课程教学质量。

2.对学生实验课表现进行考核

细胞生物学课程主要由理论课及实践课构成，实践课教学可以有效地对理论进行验证，是学生深化理论、接触生物学领域的重要途径。传统细胞生物学课程的考试主要侧重期末闭卷考试的考试成绩，对实验课考核重视程度不足，导致绝大多数生物教师在教学过程中缺乏相应的重视。将细胞生物学课程考试成绩中的20%作为实验课表现的分值，可以有效地提升学生实验操作的积极性。

3.设计论文综述环节进行考评

为了提升细胞生物学课程的考评的合理性，可以设计相应的论文综述环节，对学生整体知识结构的掌握能力进行考核。论文综述环节可以在考试周前一周至两周进行，由教师提前布置相应的论文论述主题，给予学生充足的时间撰写论文、制作幻灯片，在考核过程中由学生自主上台进行论文汇报，再由其他学生进行自主提问。在评分过程中，可以将细胞生物学课程考试成绩中的10%作为论文综述环节的分值。

二、细胞生物学课程考试改革应注意的问题

（一）加强相关教师的素质培训

随着新课程改革的深化，虽然学生成为课堂教学活动的主体，但教师仍然处于主导者地位，教师的职业素质及教学观念直接影响细胞生物学课程考试方法改革的贯彻效果。因此，为了保证细胞生物学课程考试改革的有效性，我国高校相关专业应当开展周期性培训，培养生物教师相应的职业素养，相关专业教研室应根据教学活动的推进对教师进行跟踪性的培训，积极开展教学前期培训、教学中期检测及教学末期总结，保证生物教师可以明确细胞生物学考试方法改革的必要性，并从考试改革入手提高课堂教学质量。

（二）贯彻落实相应的考核操作

在明确了细胞生物学课程考试方法改革的原则与思路之后，应当将相应的方案与思路落实到实践中，用实践检验理想化的方案，提高细胞生物学课程考试方法改革的合理性[2]。在实际考核操作过程中，教师应当制定相应的规章制度明确相应的考核流程，并对学生课堂表现、课堂出勤情况等评价因素进行了解。在实际考核过程中，可以打破传统单一性由教师评价学生的教学模式，引入相应的学生互评、学生自评评价机制，尊重学生实际能力的差异性，对学生成绩进行合理的评估。

（三）在考核过程中加强教师的协作

由于细胞生物学课程考核具有较强的专业性及理论性，且考试改革涵盖面与考察面较为广泛，学生成绩考核工作难以由一个教师单独完成，因此应当以过程性目光看待细胞生物学课程考核工作，加强各环节教师的协作与沟通。在学生成绩评价过程中，由不同的教师负责学生日常表现统计、学生论文综述情况、学生试卷批阅等环节。在过程性评价中教师之间进行合理化分工，可以有效提升学生成绩考核的合理性。

（四）引导学生注重日常学习过程

细胞生物学课程考核不仅具有检测教学成果的功能，还具备评价功及引导功能[3]。传统侧重期末考试成绩的考核模式对教学成果的评价较单一，很容易导致学生陷入学习时仅注重考点的学习误区。对细胞生物学课程考试方法的改革对学生日常表现、实验课表现等方面进行综合考核，因此教师应当注重引导学生的日常学习课程，尽可能地消除功利性的学习目的。

总而言之，细胞生物学不仅是一门集理论性、创造性为一体的学科，而且是临床医学及生物学的学科基础。在教学考核过程中，相关教师应当明确考试的评价功能及引导功能，树立素质教育理念，利用多种形式的综合性考核内容对学生学习情况进行考评。

参考文献：

[1]窦晓兵，高佳，范春雷，胡林峰，钱颖，沃兴德.细胞生物学课程考试方法改革的研究与实践[J].经营管理者，2009，23：327.

[2]肖明珠，毛建文，李红枝.医学细胞生物学考试方法的改革与实践[J].中国现代教育装备，2010，15：172-173.

[3]杨丽，张君，谢菁，徐文静，王岩.医学细胞生物学考试方法改革的探讨与实践[J].教育教学论坛，2014，31：69-70.

第3篇：细胞生物学的研究范文

虽然近年来对大肠癌治疗的研究已经取得了很大进展，但始终不能改变其发病率和死亡率高的特点，对患者预后亦无明显改善。因此，本研究探讨δnp73基因的高表达对大肠癌细胞生物学行为的影响，为临床防治大肠癌提供较可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

lovo细胞株及真核表达质粒pcdna3?δnp73均由第三军医大学大坪医院肿瘤科惠赠。rpmi?1640培养基、小牛血清购自hycolone公司。胰蛋白酶购自sigma公司。millicell chamber购自millipore公司。四甲基偶氮唑蓝(mtt)、青霉素、链霉素均购自gibco试剂公司。vegf试剂盒购自r&d公司。

1.2 lovo?δnp73细胞株的建立

以人类大肠癌细胞株lovo细胞为研究对象，将构建于真核表达质粒pcdna3?δnp73基因用脂质体法转染lovo细胞，用g418沉筛选出过表达δnp73基因的细胞株，命名为lovo?δnp73细胞株；同时以空载体pcdna3转染细胞，命名为lovo?pcdna3。

1.3 台盼兰活细胞记数测定细胞的增殖能力与细胞活力

胰酶消化收获细胞（含悬浮及贴壁细胞）制备单细胞悬液，以冷pbs悬浮，细胞浓度为1×105/ml。取9滴细胞悬液移入小试管内，加1滴0.4%台盼兰工作液，混匀，在3min内用血球记数板分别记数活细胞和死细胞。

1.4 细胞增殖曲线mtt测定

取对数生长期细胞悬液200μl/孔（含2×103个细胞）接种至96孔板，于37℃、5% co2、饱和湿度培养箱，每组每天取3个复孔，每孔加入20μlmtt（5g/l）培养4h后弃培养液，每孔加入二甲基亚砜(dmso)200μl，振荡10min溶解结晶紫。酶联免疫检测仪测定490nm波长各孔光吸收值（a490值）。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

将lovo细胞制备成单细胞悬液，收集到5ml离心管中，离心，2 000g，5min，室温，冷pbs洗涤2次，离心，2 000g，5min，弃上清。再以冷pbs悬浮，细胞浓度为1×106ml。加5ml annexin v?fitc溶液和2.5μl pi到100μl细胞悬液中，混匀后室温避光反应30min。加入反应缓冲液400μl，流式细胞术对凋亡细胞进行定量检测。

1.6 boyden小室体外侵袭实验

用改良的boyden小室法[1]：用人工基质覆盖millicell chamber滤膜上的微孔，向小室内加入1×105/ml的细胞悬液, 培养 12h 后取出滤膜, 将下室面的细胞刮下，将膜固定，结晶紫染色细胞，高倍镜下随机取5个视野,计数细胞,取平均值。

1.7 western?blot检测vegf蛋白表达

按照ripa蛋白提取步骤提取细胞总蛋白,采用bradford法测定总蛋白浓度。取总蛋白40μg行sds?page,电泳结束后电转印17h至pvdf膜,膜封闭液内封闭室温1h,4℃过夜,pbs洗膜5min×4,加入兔抗人vegf单克隆抗体(1∶350),37℃孵育1h,pbs洗膜5min×4,再加入羊抗兔igg(1∶2 000),37℃孵育1h,pbs洗膜5min×4,化学发光试剂与pvdf膜共同孵育1min,将pvdf膜与x光片共同放暗盒曝光4min,显影3min,定影10min。以gel?proanalyzer凝胶定量分析软件分析western?blot检测结果,得出各条带的灰度值,以平均灰度值代表vegf蛋白表达水平。

1.8 统计学方法

数据结果以±s表示,采用t检验, spss10.0统计学软件进行分析。

2 结果

2.1 台盼兰拒染实验

台盼兰拒染实验中活细胞不染色，而死细胞染蓝色。结果显示δnp73转染后lovo细胞的死细胞比例为（4.6+1.1）%,较lovo?pcdna3组（7.5+0.8）％明显减少，差异有统计学意义（p<0.01）。

2.2 mtt法测定细胞生长曲线

mtt结果显示，转染δnp73的lovo细胞较转染空载体pcdna3的lovo细胞组和空白对照组细胞生长明显增快，差异有统计学意义（p<0.01），见图1。

图1 mtt法测定细胞生长曲线

2.3 基因转染对大肠癌细胞凋亡率的影响

fitc?pi流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示转染空载体pcdna3的lovo细胞组凋亡率为（5.8＋1.2）％，而转染δnp73的lovo细胞组的凋亡率为（2.4＋0.8）％，与lovo/pcdna3组对比凋亡率明显降低（p<0.01），见图2。

图2 δnp73转染对lovo细胞凋亡的影响

2.4 boyden 小室体外侵袭实验

lovo、lovo?pcdna3 和 lovo?δnp73细胞穿过人工基底膜的细胞数分别为（21.4±0.1）、（22.8±0.4） 和（39.5±0.6）, lovo?δnp73 细胞与lovo 细胞和 lovo?pcdna3细胞比较, 穿膜数量明显增加, 两者间差异具有统计学意义(p<0.01) 。而lovo细胞和 lovo?pcdna3细胞穿膜数的差异无统计学意义(p>0.05) 。

2.5 vegf蛋白表达western?blot检测结果

vegf蛋白表达western?blot检测结果见图3。转染pcdna3后lovo细胞中vegf蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05),而转染δnp73能使vegf蛋白表达水平升高,灰度值上升，与未转染p73基因的细胞相比上升了44.2％，差异有统计学意义 (p<0.05)，见表2。表2 转染δnp73前后lovo细胞中vegf蛋白含量

3 讨论

研究表明δnp73因为n末端转录活化区缺失导致转录活化功能完全丧失,对p53和全长型p73的转录活化和促凋亡活性有明显的负调节作用[2,3], δnp73除与大肠癌的发生、发展关系密切外，对神经母细胞瘤也是一个预示较差预后的分子标志[4]。但在某些肿瘤中，如甲状腺肿瘤，δnp73却有着抑制增殖的作用[5,6]。由于δnp73基因在不同的肿瘤中对细胞凋亡和血管生成的影响不同，因此本实验以δnp73基因在对大肠癌细胞的生长、凋亡率、体外侵袭性以及对血管调节因子的表达调节作为主要切入点进行了研究。

本实验采用台盼兰拒染、mtt测定对转染后细胞的体外生长情况进行了分析。台盼兰拒染、mtt测定均可反映细胞的增殖情况，但作用的机制与侧重点不同。台盼兰是一种有机染料，当细胞损伤或死亡时，可透过细胞膜与解体的dna结合，使其着色，而活细胞阻止其进入，借此可鉴别活细胞和死细胞。本实验用该方法测定细胞的总数与存活率。mtt是一种淡黄色的化合物，它参与活细胞线粒体的能量代谢。在活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将mtt还原成难溶性的紫兰色结晶物formazan并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。在一定的细胞范围内，mtt结晶物形成的量与活细胞数成正比。dmso能溶解细胞中蓝紫色的结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可以间接反映活细胞数量。我们认为，台盼兰拒染实验操作简单，方便快捷，但结果受人为因素影响较多。mtt法较客观准确，是一种较好的判断细胞增殖的指标，而boyden 小室体外侵袭实验，则为检测大肠癌细胞转染δnp73基因后的侵袭力改变提供了直接证据。本实验将3种实验方法的结果相结合分析更具准确性和说服力。进一步流式细胞分析提示δnp73基因转染lovo后细胞凋亡比例明显减少。这一结果提示δnp73基因过表达可以促进大肠癌细胞的恶性增殖，其可能的机制是δnp73的过表达通过影响p73的反式激活而导致其启动子活性的减弱,抑制p73诱导的凋亡[2]。

除了上述指标，目前，对大肠癌的细胞生物学行为的研究中还有一个研究热点就是肿瘤血管生成 [7]。vegf是迄今鉴定出来的最重要的促血管生成因子之一,vegf能特异地与血管内皮细胞上vegf受体结合,刺激内皮细胞增殖并促进血管形成。因此,vegf是反映大肠癌细胞生物学行为的良好指标。在本研究中, 采用western?blot法检测高表达δnp73的细胞中的vegf蛋白表达水平,发现过表达δnp73大肠癌细胞株中vegf蛋白的表达较对照组明显增高,表明δnp73的高表达打破了血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡,从而促进了血管生成。其可能的机制是当大肠癌发生时,抑制因子表达下调、刺激因子上调,并伴随着癌基因激活和抑癌基因失活从而促使病理性血管生成[8,9]。本实验结果提示δnp73的高表达能促进大肠癌血管生成，增强了其侵袭和转移的能力，这也给我们今后对大肠癌临床治疗研究提出了一个思路和课题：有效的抑制δnp73的过度表达，可以在基因水平上抑制大肠癌血管的生成，从而对癌肿的生长和侵袭起到有效的抑制作用。

综上所述，δnp73以高表达的方式参与大肠癌的发生发展，抑制大肠癌细胞凋亡，上调血管生成因子vegf的表达，促进了大肠癌血管增生，增强了大肠癌细胞的侵袭性。鉴于δnp73基因对大肠癌细胞的这些影响,我们认为，对δnp73进行检测，有利于从基因水平了解大肠癌的发生机制和生物学行为，从而对大肠癌作前瞻性估计，为临床上对大肠癌的诊断、鉴别诊断、治疗及预后判断提供重要的参考指标，同时，还可将δnp73作为新的肿瘤治疗靶点进一步深入研究。

【参考文献】

[1]彭海霞，关明，周林法，等. p73对结肠癌细胞侵袭性的影响及其机制研究[j].中华消化杂志, 2004, 24（7）: 439?441.

[2]nakagawa t, takahashi m,ozaki t,et al.autoinhibitory regu?lation of p73 by deltanp73 to modulate cell survival and death through a p73?specific target element within the deltanp73 promoter [j]. mol cel biol,2002,22(8):2575?2585.

[3]vossio s, palescandolo e,pediconi n,et al. dn?p73 is activated after dna damage in a p53?dependent manner to regulate p53?induced cell cyclear rest [j]. oncogene, 2002, 21(23):3796?3803.

[4]casciano i, mazzocco k, boni l,et al. expression of deltanp73 is a molecular marker for adverse outcome in neuroblastoma patients [j]. cell death differ, 2002, 9(3):246?251.

[5]goldschneider d, blanc e, raguenez g, et al. differential response of p53 targe genes to p73 overexpression in sh?sy5y neuroblastoma cellline [j]. cell sci, 2004,117(pt2): 293?301.

[6]frasc f, vella v, aloisi a, et al. p73 tumor?suppressor activity is impaired in human thyroid cancer [j]. cancer res, 2003,63(18): 5829?5837.

第4篇：细胞生物学的研究范文

【摘要】

目的: 探索甘露聚糖结合凝集素（MBL）基因GGA57GAA点突变引起免疫缺损的机制。方法: 采用PCR从质粒pMBLm57中扩增含GGA57GAA点突变的MBL基因， 构建重组真核表达载体， 电转染CHO细胞， 以Zeocin筛选并克隆化培养， 用mAb-Sepharose 4B和Ni2+-NTA agarose层析纯化目的蛋白， 以SDS-PAGE、 Western blot、 ELISA、 配体结合试验、 C4d沉积试验等鉴定目的蛋白。结果: 重组真核表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞后获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株; 37Glu突变型MBL蛋白主要以双链（Mr约60000）存在， 不能形成高聚体; 其配体结合能力低下， 与MASP-2N端蛋白的结合能力也降低， 不能通过凝集素途径激活补体系统。结论: GGA57GAA点突变产生结构有缺陷的MBL蛋白， 进而影响其识别功能和效应功能。

【关键词】 甘露聚糖结合凝集素 GGA57GAA突变体 37Glu突变型蛋白 识别功能 效应功能

甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin， MBL）是肝细胞分泌的血浆蛋白， 为C型凝集素超家族中胶凝素家族成员［1］。MBL的糖识别域（carbohydrate-recognition domain， CRD）是其识别功能区， 可选择性识别多种病原体表面以Man、 ManNAc、 GlcNAc等为末端糖基的糖结构; 胶原样区（collagen-like region， CLR）为其效应功能区， 通过与MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBL associated serine protease， MASP）相互作用， 激活补体凝集素途径， 发挥溶菌和调理功能， 还能与吞噬细胞胶凝素受体结合而发挥直接调理作用［1， 2］。已发现3个可引起调理吞噬缺损的MBL结构基因点突变， 分别位于外显子1 的第54、 57和52位密码: GGC54GAC和GGA57GAA， 其编码产物Gly为Asp或Glu取代; CGT52TGT的编码产物Arg变为Cys。这些点突变为常染色体显性遗传， 其基因频率GGC54GAC在欧亚人群中较高（≥0.11）， GGA57GAA在次撒哈拉非洲人群中很高（达0.29）， 而CGT52TGT在所研究过的人群中较低（≤0.06）［3， 4］。我们对中国十余个民族的群体研究发现， 其MBL基因点突变的频率多在0.1以上。显然， MBL缺损是迄今所发现的最常见的免疫缺损病。因此， 阐明MBL基因突变引起免疫缺损的机制具有极其重要的意义。本课题组将人3种突变型MBL基因在COS7细胞中瞬时表达， 证明MBL这些点突变不影响MBL蛋白的合成与分泌［5］; 将CGT52TGT、 GGC54GAC突变体基因在CHO细胞中稳定表达， 发现32Cys和34Asp突变型MBL蛋白的寡聚化程度大大低于重组野生型和天然MBL蛋白［6， 7］。那么， GGA57GAA突变的影响是否同52、 54位密码突变一样？ 本研究中， 我们将GGA57GAA突变体基因在CHO细胞中稳定表达， 并对37Glu突变MBL蛋白进行初步的结构和生物学活性研究。

1 材料和方法

1.1 材料 含人GGA57GAA MBL突变体全长编码区基因的质粒pMBLm57［8］、 重组野生型MBL蛋白［9］、 人血浆天然MBL蛋白［10］、 重组人MASP2-N端蛋白以及抗人MBL CRD单克隆抗体（monoclonal antibody， mAb）、 MBL缺陷型人血清（基因型为LYPB/LYPB）、 质粒pcDNA4/HisMax C和大肠杆菌TOP10F`为南方医科大学免疫学教研室构建、 制备和保存。限制性内切酶、 Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶、 DNA marker和逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。高相对分子量（Mr）和低Mr蛋白marker购自晶美公司。HRP-羊抗鼠IgG抗体购自鼎国公司。质粒小量快速抽提试剂盒和DNA小量快速纯化试剂盒购自申能生物公司。RPMI1640培养基、 新生牛血清和Zeocin购自Invitrogen公司。Ni2+-NTA Agarose购自Qiagen公司。抗人C4d单克隆抗体(mAb)购自Quedel公司。抗人MBL mAb ［HYP 131-11］购自Abcam公司。CNBr活化的Sepharose 4B购自Amersham Biotech公司。抗His mAb购自TIANGENE公司。Centricon Plus-20超滤膜（Mr cut-off 10000）购自Millipore公司。甘露聚糖购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体的构建与鉴定 上游引物5′-CGGGATCCATGTCCCTGTTTCCATCA-3′， 含BamH Ⅰ酶切位点; 下游引物5′-CGGAATTCACTCACAGACCCTTCAGATAGGGAACT-3′， 含EcoR I酶切位点。引物由上海博亚公司合成。以pMBLm57质粒为模板， 以上述引物进行PCR扩增带有GGA57GAA点突变的MBL cDNA片段， 回收、 纯化PCR产物。将cDNA片段与pcDNA4/HisMax C质粒分别经BamH I和EcoR I双酶切后， 以T4 DNA连接酶于16℃连接8 h， 将目的基因片段插入pcDNA4/HisMax C质粒中， 转化大肠杆菌TOP10F′， 以25 mg/L Zeocin筛选阳性克隆。小量提取质粒， 用BamH I和EcoR I双酶切鉴定， 经双向测序（由上海博亚公司进行）确证后， 大量扩增。鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA4/HisMax C-MBLm57。

1.2.2 CHO细胞的转染、 筛选及克隆化 于0℃在950 μF、 250 V电击下， 将重组表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞。具体操作参照Bio-Rad公司电穿孔仪操作手册。将转染后的CHO细胞置12孔板内培养24 h后， 以800 mg/L Zeocin加压筛选。1周后， 挑取单克隆细胞以相同浓度Zeocin继续加压筛选20 d。随后的1个月中， 每隔3~5 d换液1次， 维持Zeocin的浓度为200 mg/L。稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株命名为CHO-MBLm57。

1.2.3 外源基因表达的RT-PCR分析 以1 mL TRIzol试剂提取1×107个CHO-MBLm57细胞总RNA后， 采用逆转录试剂盒获取cDNA产物。以cDNA产物为模板， 上述1对特异性引物进行PCR， 用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

1.2.4 MBL-CRD mAb亲和层析柱的制备 参照文献［11］方法， 将MBL-CRD mAb与活化Sepharose 4B偶联， 制备MBL-CRD mAb-Sepharose 4B层析柱。

1.2.5 重组蛋白的纯化 (1)收集CHO-MBLm57细胞培养上清， 缓慢加入饱和 (NH4)2SO4溶液至终浓度为60%， 于4℃搅拌2 h沉淀蛋白， 以8000 r/min于4℃离心30 min。将沉淀溶于0.01 mol/L PBS (pH7.4， 含0.5 mol/L NaCl)中， 装透析袋， 在PBS中于4℃透析24 h， 每4~6 h换液1次。(2)以0.45 μm微孔滤膜过滤， 以1 mL/min速度上样MBL-CRD mAb-Sepharose 4B柱， 重复3次后于4℃反应2 h。以10倍柱床体积PBS淋洗， 至A280

1.2.6 SDS-PAGE和Western blot检测 将37Glu突变型和重组野生型MBL蛋白上样进行SDS-PAGE， 部分胶进行常规染色; 另一部分用于Western blot检测: 电转移后， 将硝酸纤维素膜膜置于30 g/L脱脂奶粉中于4℃封闭过夜; 加1∶3000稀释抗His mAb于室温反应1 h， 洗膜5次; 加1∶4000稀释HRP-羊抗鼠IgG， 室温反应1 h， 洗涤后以DAB/NiCl2底物液显色。

1.2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA） 将37Glu突变MBL蛋白从20 mg/L倍比稀释至0.6 mg/L， 加入酶联板中， 100 μL/孔， 以天然MBL蛋白和重组野生型MBL蛋白为阳性对照，稀释液为阴性对照， 4℃包被过夜; 加入50 g/L脱脂奶粉， 37℃封闭2 h; 洗涤后， 分别加入1∶5000抗人MBL mAb［HYP 131-11］、 1∶1000抗人MBL-CRD mAb或1∶5000抗His mAb， 37℃反应1 h; 洗涤后加入1∶5000 HRP-羊抗鼠IgG， 37℃反应30 min; 洗涤后， 加TMB底物液显色， 以2 mol/L H2SO4终止反应， 在酶联仪上测A450值。

1.2.8 配体结合试验 将10 mg/L甘露聚糖加入酶联板中， 100 μL/孔， 4℃包被过夜; 加入50 g/L脱脂奶粉， 37℃封闭2 h; TBS-T（含10 mmol/L Ca2+）洗涤后， 分别加入不同浓度（0.6 ~10 mg/L）的天然MBL、 重组野生型MBL和37Glu突变MBL蛋白， 100 μL/孔， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加入1∶5000抗人MBL mAb， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加入1∶5000 HRP-羊抗鼠IgG， 37℃反应30 min; 洗涤后， 加TMB底物液显色， 以2 mol/L H2SO4终止反应， 在酶联仪上测A450 值。

1.2.9 重组蛋白与MASP2-N端蛋白结合试验 将10 mg/L纯化重组人MASP2-N端蛋白加入酶联板， 100 μL/孔， 4℃包被过夜; 加入50 g/L脱脂奶粉， 37℃封闭2 h; TBS-T(含10 mmol/L Ca2+) 洗涤后， 加入不同浓度（0.03~1 mg/L）人血浆来源天然MBL、 重组人野生型MBL和37Glu突变型MBL蛋白， 37℃反应1 h， 对照组稀释液中含10 mmol/L EDTA; 洗涤后， 加入1∶1000鼠抗人MBL-CRD mAb， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加入1∶5000 HRP-羊抗鼠IgG， 37℃反应30 min; 洗涤后， 加TMB底物液显色， 以2 mol/L H2SO4终止反应， 在自动酶联仪上测定A450值。

1.2.10 C4d沉积试验 将100 mg/L甘露聚糖加入酶联板， 100μL/孔， 4℃包被过夜; 加50g/L脱脂奶粉， 37℃封闭2h; TBS-T（含10mmol/L Ca2+）洗涤后， 加不同浓度（0.6~10mg/L）重组野生型和37Glu突变型MBL蛋白， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加1∶50稀释MBL缺陷型人血清， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加1∶5000鼠抗人C4d mAb， 37℃反应1 h; 洗涤后， 加1∶5000 HRP-羊抗鼠IgG， 37℃反应30 min; 洗涤后， 加TMB底物液显色， 以2 mol/L H2SO4终止反应， 在酶联仪上测A450值。

2 结果

2.1 真核表达载体的构建 采用PCR获得长约750 bp的cDNA片段， 将其定向插入真核表达载体中， 构建重组真核表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm54。经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切， 可见2条带， 其中约750 bp带为目的片段。以特异性引物进行PCR， 亦获得长约750 bp的片段（图1）。通过DNA测序， 确认插入DNA片段的序列与预期结果完全一致， 带有GGA57GAA点突变。

图1 重组质粒的鉴定（略）

1: λEcoT14Ⅰ DNA marker; 2: 重组质粒pcDNA4/HisMax C-MBLm57的EcoR I酶切产物; 3: 质粒pcDNA4/HisMax C的EcoR I酶切产物; 4: 重组质粒pcDNA4/HisMax C-MBLm57的EcoR I和BamH I双酶切产物; 5: 重组质粒pcDNA4/HisMax C-MBLm57的PCR产物.

2.2 CHO-MBLm57细胞的筛选与克隆化培养 采用电穿孔法， 将重组表达载体pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞， 经长达近2个月的Zeocin加压筛选和维持培养， 获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株， 分别命名为B4-CHO-MBLm57、 C7-CHO-MBLm57、 F6-CHO-MBLm57、 G5-CHO-MBLm57和G9-CHO-MBLm57。

2.3 CHO-MBLm57细胞内目的基因mRNA的表达 提取1×107个CHO-MBLm57细胞的总RNA， 经RT-PCR扩增， 得到长约750 bp的片段， 与预期结果一致（图2）。

图2 RT-PCR鉴定目的基因mRNA（略）

1: DL 2000 DNA marker; 2: 质粒pcDNA4/HisMax C转染CHO细胞的RT-PCR产物; 3: 重组质粒pcDNA4/HisMax C-MBLm57转染CHO细胞的RT-PCR产物.

2.4 37Glu突变型MBL蛋白的分子质量与抗原性 经硫酸铵粗沉淀及两步亲和层析， 从1 L细胞培养上清中可得到约1 mg蛋白。SDS-PAGE分析发现， 在非还原状态下， 37Glu突变MBL蛋白在Mr 60000处有1条明显的带， 在Mr 200000处见1条很弱的带， 而重组野生型MBL蛋白则在Mr>200000处可见多条明显条带， 在60000处只有非常微弱的条带。Western blot结果显示， 37Glu突变型MBL蛋白在Mr 60000处呈现1条能与抗His抗体反应的条带， 而重组野生型MBL蛋白的染色带则主要在Mr>200000处（图3）。ELISA表明， 重组37Glu突变MBL蛋白能为抗His、 MBL-CRD或MBL的mAb所识别（图4）。

图3 SDS-PAGE和Western blot分析纯化的重组表达产物（略）

1: 蛋白marker; 2: 重组野生型MBL; 3: 重组37Glu突变型MBL; 4: 重组野生型MBL的Western blot图; 5: 重组37Glu突变型MBL的Western blot图.

2.5 37Glu突变型MBL蛋白的配体结合能力 配体结合试验结果显示， 37Glu突变MBL蛋白无糖结合能力， 而天然MBL和重组野生型MBL蛋白与甘露聚糖有良好的结合活性（图5）。

图4 37Glu突变型MBL蛋白与抗体的结合(n=3)（略）

图5 37Glu突变型MBL蛋白与甘露聚糖的结合(n=3)（略）

2.6 37Glu突变型MBL蛋白与MASP2-N端蛋白的结合能力 结合试验显示， 人天然MBL和重组野生型MBL蛋白对MASP2-N端蛋白有良好的结合活性， 但37Glu突变MBL蛋白则否（图6）。

图6 37Glu突变型MBL蛋白与甘MASP2-N端蛋白的结合(n=3)（略）

2.7 37Glu突变型MBL蛋白激活补体的活性 重组野生型MBL蛋白能通过凝集素途径激活补体， 裂解C4产生C4d， 而37Glu突变型MBL蛋白激活补体的活性几乎完全消失（图7）。

图7 37Glu突变型MBL蛋白激活补体的作用(n=3)（略）

3 讨论

人MBL肽链Mr为27000~32000， 3条肽链构成结构单位， 完整的MBL分子是这种结构单位的寡聚体， 多至六聚体［1， 2］。MBL的结构如此复杂， 在原核系统是无法表达的。因此， 我们选用真核表达载体和哺乳动物细胞进行研究， 以期模拟MBL基因在人类细胞中表达的情况。本实验选择真核表达载体pcDNA4/HisMax C和CHO细胞作为研究系统， 构建的重组表达载体经DNA测序确证MBL基因中含GGA57GAA点突变， 然后将其转染CHO细胞中表达。真核表达的关键之一在于能否筛选到稳定高效的表达细胞株。由于pcDNA4/HisMax C含有Zeocin抗性基因， 我们用Zeocin持续加压转染细胞近2个月， 最终筛选到5株稳定表达株。采用mAb-Sepharose 4B和Ni2+-NTA agarose层析法纯化37Glu突变型MBL蛋白， 效果比较满意， 获得了较高纯度的目的蛋白。

已发现3个可引起免疫缺损的MBL结构基因点突变， 但对其引起调理吞噬缺损的机制了解不多。我们先前的研究证明， MBL 结构基因的3个点突变均不影响MBL蛋白的合成与分泌［5］， 本实验成功地获得分泌性表达37Glu突变MBL分子的CHO细胞株和重组37Glu突变MBL蛋白， 亦表明GGA57GAA点突变并不影响其产物的表达及向胞外分泌的过程。应用SDS-PAGE和Western blot分析， 发现37Glu突变MBL蛋白主要是Mr 60000的分子， 这应该是MBL肽链的双体， 其寡聚化程度大大低于重组野生型MBL， 高寡聚化的MBL分子极少。这与我们对32Arg［6］和34Asp［7］突变蛋白的研究结果相似。功能实验发现， 37Glu突变型MBL蛋白不能与配体甘露聚糖结合， 亦缺乏与MASP-2N端蛋白结合的能力， 从而导致其激活补体凝集素途径的活性几乎完全消失。MBL分子的寡聚化程度与其CLR密切相关， 而寡聚化程度直接影响其功能， 只有四聚体以上的多聚体才具生物学活性［12］。因此有理由推论， 因GGA57GAA点突变产生的带有巨大侧链和电荷的Glu代替了无侧链且电中性的Gly， 影响了3条肽链CLR α-螺旋的形成， 从而妨碍了MBL结构单位和/或寡聚体的装配， 即产生了结构有缺陷的MBL分子， 并进而影响其功能活性。同时亦表明， MBL肽链第57位Gly残基对于维持完整MBL分子的结构和功能是必需的。

参考文献

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第5篇：细胞生物学的研究范文

【关键词】 异体移植

摘 要：［目的］研究神经长度是否影响化学去细胞神经的质量及化学去细胞异体神经修复犬神经缺损的适当长度范围。［方法］切取犬的坐骨神经全长，截取直径近似段长度12 cm，去除神经外膜的脂肪组织及血管，在50％Triton X100和50％脱氧胆酸钠中重复消化得到化学去细胞神经；部分神经用于组织学评价，将12 cm神经按顺序切割为6段，石蜡包埋制备切片，厚度5 μm。HE染色和Fastblue染色，观察去细胞程度、神经细胞外基质结构完整性、髓鞘染色强度，观察每段神经的差异。在体内实验中，用化学去细胞异体神经桥接犬的坐骨神经缺损，缺损长度分别为8、10 cm组，每组各有6条成年犬，随访时间12个月。观察动物肢体功能恢复、肌电图变化及再生神经组织学表现，包括HE染色、S100免疫组织化学染色、乙酰胆碱酯酶染色。［结果］去细胞神经全长各段在去细胞程度、结构完整性及残余髓鞘染色综合评价中无差异。体内移植实验结果显示8 cm去细胞异体神经移植组的犬在术后12个月踝关节可直立行走，而10 cm去细胞异体神经移植组犬12个月时踝关节不能直立行走。肌电图检查结果显示，两组动物的手术肢体均可记录到诱发的运动和感觉电位。肌电图波幅、时限及运动神经传导速度结果显示，8 cm移植组明显高于10 cm移植组(P

关键词：去细胞神经； 异体移植； 再生

Abstract：［Objective］The purpose of this paper is to demonstrate whether the nerve length could affect the quality of acellular nerve and investigate the properly repairable distance of nerve defects with acellular nerve allografts. ［Method］Fresh sciatic nerves were obtained from adult dogs and pided into 12 cm long segments. The nerve segments were decellularized via an improved chemical decelluarization treatment as following: Nerve segments were rinsed with cold sterile Ringer's solution and submergedin 5% Triton100 solution 12h ，and then soaked the nerve segments into 5% sodium deoxycholate for 12h. The treated nerve segments were washed in distilled water for 3h. This procedures were repeated once again. In vitro， the degrees of decellularization ， demyelination and integrity of nerve fiber tubal of chemically extracted acellular nerves were observed with microscope and assessed by a score system. In vivo，the sciatic nerve of dogs on the right was exposed.In 8 cm grafted group (n=6)，a 7 cm segment of sciatic nerve was removed from the midthigh level. In 10 cm grafted group (n=6) ， a 9 cm segment of sciatic nerve was removed at the same level. The gaps were bridged with acellular nerve allografts by 8 cm and 10　cm long segments respectively. The followup period was 12 month postoperatively. Motor functional recovery of the right hind following allografting was examined by neurobehavioral， electrophysiological， histological and immunohistochemical assessment. ［Result］There was no difference on the degrees of decellularization， demyelination and integrity of nerve fiber tubal among every fraction of the acellular nerve from the two ends to the central portion. In 8 cm grafted group ， all survival dogs(n=5) were held upright with the affected hindlimb extended so that the body's weight was supported by the distal metatarsus and toes. In 10 cm grafted group， animals were failed to held upright with the affected hindlimb. Electrophysiological studies showed that elctromyographic activity was observed in both groups.After 12 month the conduction velocity was 321+51 m/s in 8 cm grafted animals and 183+6.0m/s in 10 cm grafted group. In normal animals， the conduction velocity was 1066+164 m/s. The conduction velocity in 10 cm grafted group was lower than 8 cm grafted(P

Key words: Acellular nerve; Allograft; Regeneration

创伤、理化因素及肿瘤等原因可导致周围神经的损伤，造成长距离的神经缺损。为恢复肢体的神经支配通常需要应用移植物桥接神经缺损。该类移植物的功能是引导神经纤维通过缺损区并长入支配的器官和组织。由于新鲜异体神经移植的免疫学反应，在临床实践中自体神经移植一直被认为是“金标准手术”。但是由于切取自体神经带来的诸多并发症及供区所限，自体神经替代物修复神经缺损成为研究的重点。人工合成的替代物主要是由具有良好生物相容性和生物可降解材料制备，如PLA(polylacticacid)［1，2］，PLGA［poly(lacticcoglycolic)］［3］等。合成材料虽然可避免切取自体神经的并发症及异体神经的免疫反应，但在内部结构上不具备天然神经细胞外基质的三维空间结构，而这种结构对引导神经轴突的生长至关重要。异体神经的MHC(major histocompatibility complex)主要存在于神经的雪旺细胞和髓鞘成份中，近期研究显示经化学处理的去细胞异体神经可有效降低移植后的免疫反应并促进神经轴突向远端生长［4，5］，从而修复周围神经的节段性缺损。因此，化学去细胞异体神经已成为一种具有应用前景的自体神经替代物，并对其神经移植物的保存方法进行了研究［6］。然而，在实验研究中，对下述两个问题尚未进行深入研究：(1)较长节段神经的化学去细胞处理是否会造成神经断端与神经中段质量的差异；(2)在大型动物神经缺损修复中有效的长度范围为多少。上述问题的研究对制备较长的去细胞神经移植物和选择修复神经缺损的长度具有重要意义。

1 材料与方法

11 仪器及试剂

Medtronic Keypoint肌电图仪(丹麦)，恒温振荡器(回旋式，上海)，Triton X100(Sigma，美国)，脱氧胆酸钠(Sigma，美国) 。

12 犬化学去细胞神经的制备

已行钴―铬―钼人工假体体内植入实验并准备取材的实验犬6条，体重在24～26 kg，用速眠新100 mg肌注后全麻安乐死，取双侧全长的坐骨神经干，每条坐骨神经长约12 cm。将切取的全长犬坐骨神经标记远近端后，按下述顺序进行化学处理：(1)蒸馏水浸浴12 h；(2)50％Triton X100消化12 h;(3)蒸馏水浸浴3h；(4)50％脱氧胆酸钠消化12 h；(5)重复前述步骤；(6)蒸馏水浸浴3 h；(7)萃取神经在4℃、 pH 72无菌磷酸盐缓冲液(PBS)暂时保存；(8)将处理好的去细胞神经组织和Hank’s液一起用双层无毒塑料袋进行分装，在250 KGy的γ射线下进行辐照灭菌，放置在4℃冰箱中备用。

13 去细胞神经的组织学评价

去细胞处理后的神经组织，将每一神经段按等比例分为6小段，每小段长为20 mm，石蜡包埋，做5 μm厚横向和纵向组织学切片，进行HE染色观察去细胞程度及纤维管道结构完整性、Fast blue染色观察髓鞘成分。按照表1的标准进行去细胞神经的质量评价。每段随机取3张切片进行观察，取其均值单项计分。

14 去细胞异体神经移植试验

健康杂种犬12只，雌雄不分，体重243～266 kg，随机分成2组，8 cm移植组和10 cm移植组，每组 6只。用25％戊巴比妥钠(10 mg／kg体重)静脉注射进行麻醉。在无菌条件下右股后切口显露坐骨神经干。在坐骨神经干中段分别锐性切除7、9 cm长的神经节段，自然回缩造成8、10 cm长的神经缺损。分别用8、10 cm长的化学去细胞同种异体神经进行移植桥接神经缺损，用8-0无创尼龙线行神经外膜缝合，环形缝合6针。术后分笼饲养，观察期12个月。

15 体内移植实验观察

151 一般观察 观察移植后切口愈合及肢体功能恢复。

152 神经电生理观察 用丹麦产Medtronic Keypoint便携式肌电图仪进行运动和感觉诱发电位的检测。随机选取左侧非手术侧肢体5例作为正常值对照。在全麻下手术切开显露待测神经。

在进行运动诱发电位检查时，将刺激电极放置在移植段神经近侧2 cm的正常神经上，记录电极放置在小腿三头肌上，通过给予相同剂量的方波刺激比较两组实验动物在运动诱发电位波幅和时限上的区别。左侧肢体电极放置在相应位置，刺激参数为：10～20 mA，01 ms，10 Hz。

在进行感觉诱发电位观察时，刺激电极放置在踝关节部的胫神经上，记录电极放置在移植段近侧的正常神经上。刺激参数为50～100 mA，02 ms，19 Hz。

运动神经传导速度检查时，在移植侧，近端刺激电极位于移植段近端吻合口近侧2 cm处，远端记录电极位于移植段远端吻合口远侧2 cm处，两实验组距离分别为12、14 cm。在对照侧，两点位于与右侧相应部位的坐骨神经干上，间距10 cm。刺激参数为10～20 mA，02 ms，10 Hz，肌电图仪自动记录并计算运动传导速度。

153 再生神经的组织学观察 在过量麻醉药物的作用下处死实验犬并即刻观察取材。对实验组全部动物的移植段神经的近侧吻接口、移植段中央、远侧吻接口、移植段远侧神经和神经支配区域的靶肌肉进行神经再生的组织学观察。

1531 HE染色 将切取的移植神经及两端各1 cm正常神经取出后浸于4％多聚甲醛水溶液中固定24 h，经脱水处理后分段用石蜡进行包埋，连续组织学切片，切片厚度为5 μm，苏木素-伊红染色后观察组织结构形态，再生神经纤维和细胞浸润情况。

1532 S-100免疫组化染色 标本为石蜡包埋，切片厚度5 μm。Ⅰ抗为兔抗S-100蛋白抗体，Ⅱ抗为生物素标记的羊抗兔IgG抗体。用于观察再生神经中的许旺细胞的分布情况，特别是移植段神经中许旺细胞的分布。

1533 美蓝复红染色 在移植段中央和移植段远侧的神经中各取2 mm×1 mm×1 mm大小的组织块用05％戊二醛固定24 h，树脂包埋后用于半薄切片美蓝复红染色，切片厚度2 μm，染色后观察有髓神经纤维。

1534 透射电镜观察 将经05％戊二醛固定后树脂包埋的神经组织行超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。在SEM透射电镜下观察再生神经的超微结构。

1535 靶肌肉运动终板染色 在胫神经进入小腿三头肌肌腹部位切取3 mm厚的肌肉块，在含1％氯化钙的 10％福尔马林水溶液中固定24 h，取出后放置在蔗糖-凝胶溶液中，行冰冻切片，切片厚度为30 μm。用胆碱酯酶法进行运动终板染色，观察靶肌肉中再生的运动终板的形态。每张切片随意选3个视野计数运动终板数量，取其平均数。

16 统计学分析

用SPSS 115统计分析软件进行数据处理，组间对比用成对资料的t检验，P

2 结 果

21 去细胞神经各段间组织学观察结果

神经全长从近端到远端去细胞完全，评分均为0分；在结构观察中，除第2段为0分外，其余5段均为1分，存在轻度的结构破坏：观察髓鞘染色强度，神经全长均为1分，仍残留少部分髓鞘成分。综合评分第1段为2分，第2段1分，第3段到第6段均为2分，神经全长各段经去细胞处理后综合评分相似（见表1）。 表1 化学去细胞神经评分标准

22 移植动物一般情况和功能观察

8 cm组有1犬在移植后3个月并发肺部感染死亡。10 cm组有1犬在4个半月腹泻死亡。其余动物均存活至观察期满。 在8 cm组实验犬在移植术后3个月时均有不同程度运动功能的恢复，至6个月时恢复了较好的行走功能，但是外观上仍有轻微的跛行，12个月时在行走过程中踝关节可以完全直立和有较好的背屈。10 cm组在6个月时也有不同程度的下肢功能恢复，但是进展较慢，移植后12个月踝关节仍不能直立或爪背着地。

23 神经电生理观察

在移植段近侧的正常神经上给予电刺激时，8 cm组和10 cm组均在小腿三头肌上记录到诱发的运动神经传导电位。如表2所示移植术后12个月记录到的运动诱发电位时限和波幅的区别，8 cm组的波幅高于10 cm组(t=3286，P

24 再生神经组织学观察

大体上观察，8 cm组在局部切开检查时，移植段神经与周围组织有轻微的短缩，可见移植段神经有良好的连续性，无明显变细变硬。神经与周围组织有少量的粘连，再血管化良好。近侧和远侧吻接口无神经瘤形成。神经支配区的肌肉组织有轻度萎缩。10 cm组在切开检查时，可见移植段神经的远侧段明显变细变硬，但是仍然保持连续性，神经与周围组织有粘连，神经支配区肌肉萎缩明显。 表2 去细胞异体神经移植术后12个月肌电图结果光镜下，在两组移植段神经内均有S-100表达阳性的雪旺细胞，沿神经纤维方向呈带状排列(图1)，8 cm组的数量多于10 cm组。移植段以远的神经内亦可见到雪旺细胞增殖成带，神经横切面显示有再生的神经纤维，8 cm组优于10 cm组，在10 cm组可见较多神经束呈脱髓鞘改变。

运动终板染色显示在神经支配区的小腿三头肌中可以见到重新形成的运动终板结构，两组实验犬在运动终板数量上有较明显的差别，8 cm组再生的运动终板数量多于10 cm组，终板的形态也优于10 cm组(图2)。每个高倍视野下的运动终板的数量在8 cm组明显多于10 cm组，有显著统计学差异(P10 cm组。但是两组终板和正常的终板结构相比不管是在终板的数量还是在终板的纵横径上均有差别(P

电镜下8 cm组移植段神经内可见由雪旺细胞形成的髓鞘和有髓神经纤维，同时可见大量的无髓神经纤维呈束状分布(图3)；10 cm组移植段神经内也有少量有髓神经纤维形成。表3 去细胞异体神经移植术后小腿三头肌运动终板测量

3 讨 论

在异体神经移植的研究中，虽然经冻融处理、放射处理和化学处理后的异体神经均具有促进神经再生的功能，但由于冻融处理及放射处理的神经细胞碎片仍残存在神经的基底板层管内，妨碍神经轴突向远端的延伸，因此修复神经缺损的距离一般较短。而化学处理后的异体神经在降低免疫原性的同时，保留了神经纤维管道的结构完整性，其内部细胞碎片已被清除，去除了轴突生长的障碍，因此可用于修复较长距离的神经缺损。但在化学去细胞处理过程中，当为修复较长距离的神经缺损而处理较长神经段时，神经的两端与中央部位是否存在质量差异，对修复神经缺损有较大的影响。化学浸提液是从神经的两端还是透过神经外膜对神经进行去细胞处理存在争议。实验中从去细胞程度、髓鞘提取的程度及神经纤维管道的完整程度进行评价。结果显示在长12 cm的神经段中，经化学去细胞处理后，神经的中央部分与两端的各段间在上述三个方面的综合评价中无差异，说明对同等粗细的神经其长度并不影响其神经移植物的质量，由此可以推断化学浸提液并非从神经的两端而是从神经的外膜开始进行去细胞处理。故在用相同的浸提液及处理程序进行去细胞处理时，神经的长度对神经移植物质量无影响。

虽然在理论上可以应用化学去细胞的方法处理任意长度的神经，但在实验及临床应用中移植长度仍然影响肢体功能康复的结果。在早期的研究中应用化学去细胞异体神经较满意修复了犬5 cm长的坐骨神经缺损［7］。在应用相同方法处理的犬的化学去细胞异体神经移植实验中，对犬的8、10 cm 长的坐骨神经缺损用化学去细胞同种异体神经进行移植修复。结果发现在8 cm长的坐骨神经缺损修复组，无论是肢体功能的大体观察还是电生理的观察，均恢复较好。运动神经的波幅已达正常神经的50％，神经传导速度达到正常神经的30％；而在10 cm长的神经移植组，功能恢复较差，肌电图波幅及运动神经传导速度均未达到正常神经的20％。再生神经的组织学观察显示8 cm长的去细胞神经移植组在雪旺细胞、有髓神经纤维的分布及运动终板的数量和形态方面均明显优于10 cm移植组。

在8、10 cm神经移植组，其移植物本身的质量无差异，但最终结果具有明显的差异。产生这种差异的原因不在移植物本身，而与神经缺损的距离有关。Haase等［8］用去细胞异体神经桥接大鼠腓神经缺损，研究显示去细胞异体神经可以修复2 cm的周围神经缺损，当缺损>4 cm时未出现功能恢复，并认为生长因子可能有助于修复较长的神经缺损。但在随后的实验中应用血管内皮生长因子与去细胞异体神经复合后移植修复神经缺损，仅表现出促进近端吻合口轴突的生长，并未显出促使神经轴突延长的作用［9］。出现这种现象的原因可能是生长因子虽有促神经再生的作用，但在修复区内未能呈现生理环境下的浓度梯度变化，故轴突的生长方向受到干扰。在周围神经损伤后，靶器官通过神经远端释放不同的生物因子，发挥化学趋化作用，促使神经轴突向远端生长。生物因子的浓度呈现明显的梯度改变趋势，随距离的增加，生物因子的浓度发生明显的变化，从而影响神经的再生速度及肢体功能康复。因此，在使用生长因子促使神经向远端生长时应考虑其作用环节及浓度梯度变化。

本研究证实神经的长度并不影响化学去细胞神经制备的质量，在应用去细胞异体神经修复周围神经缺损中，8 cm或许是目前单独使用化学去细胞异体神经移植取得较好结果的最大范围。为修复更大范围的神经缺损，应探讨神经远端的生物因子表达分布规律，利用化学趋化原理促进神经的快速生长。

参考文献

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第6篇：细胞生物学的研究范文

细胞衰老是细胞不可逆的失去增殖能力的过程，被认为是机体抑制肿瘤发生的重要屏障[2]。但是也有研究表明衰老细胞可以通过分泌表型促进肿瘤发生。因此，细胞衰老与肿瘤之间的关系还需要进一步的研究。而对细胞衰老发生的分子机理的理解，有助于我们开发新的肿瘤治疗策略。目前已经发现多种基因毒性刺激都能诱发细胞发生早熟性细胞衰老，如端粒缩短、原癌基因激活、辐射损伤、活性氧损伤等，这些刺激都能引发DNA 损伤[3]。

细胞衰老存在于多学科中，属于交叉学科，它自产生就与抽象、深奥的哲学紧密联系、相互促进。

一、细胞衰老学说的研究，离不开哲学思维的发展

哲学的发展来源于人类在探索世界时候的不断反省，通过对生命的意义的思索，促进着自然科学的发展。20世纪60年代，Hayflick和Moorhead 等人[4]在体外培养人正常成纤维细胞时发现：多株体外培养的正常人成纤维细胞，在经历多次细胞分裂之后，并没有无限制的增殖，而是发生了增殖失败现象。当排除了因细胞体外培养和营养需求改变等因素的影响后，他们确定这是细胞固有的一种生理状态。而与此现象相佐证的是：胚胎来源的成纤维细胞的增殖能力要比成体来源的成纤维细胞的增殖能力更强。这种现象使得他们提出了细胞衰老（Cell senescence）的概念，并认为这种细胞增殖失败的现象与器官的老化是相关联的[5]。西方医学的很多发展都源于哲学的进步，他们观察自然和人类生活的变化，产生哲学思辩，从而研究物质存在的机制。西方的哲学发展较快，较为进步，正式哲学的发展促进了其他学科的发展，哲学思维给予了医学正确看待生命与健康的理论指导。医学家在哲学世界观与方法论的指导下，从事基础医学研究，推动着医学进步发，促进了基础医学的进步。

二、细胞衰老学说研究要靠实践的唯物主义哲学思想

细胞衰老机制研究是一门医学基础的研究，归从于细胞生物学研究，必须通过反复的实验进行验证。而细胞衰老对于机体器官的衰老，机体本身的衰老都是其研究的基础，是其理论基础，哲学思想充斥在科学实践与理论思维之中。细胞衰老机制研究是一个基础认识过程，由感性认识到理性认识，从机体自然界的生老病死的现象，使人类产生研究其基本结构单位细胞的想法，对细胞衰老的机制研究，进一步解开人类机体衰老的奥秘，从认识到实践，实践再进一步指导认识，实现科研造福于人类的意义。

三、细胞衰老学说研究依靠哲学思维发挥出社会效应，实现价值

哲学对医学的发展具有世界观的理论指导意义，细胞衰老学说的发展也不例外。列文虎克发明第一台显微镜,初步认识了微生物，人类就开始了细胞学说的研究。从细胞的大体结构，细胞壁、细胞器、细胞核的研究，到微细的细胞结构中细胞各组织结构的功能，细胞内信号的传导、物质的代谢，再到细胞生长、增殖、衰老、凋亡机制的研究，所有这些都离不开哲学的指导需要哲学思维价值观来指导任一学科的发展，同时细胞衰老学说的研究，必然伴随社会价值的体现，人类向往永生，向往肌肤的永生，甚至生命的永生，所以哲学承担起揭示医学科学社会效应的责任，指导细胞衰老的研究来充分发挥出其社会效应，这涉及人的出现，生存、发展等一系列哲学问题。离开了哲学，科学的理论基础就将崩塌。物理学家玻恩曾经说“每个现代科学家，都深刻地意识到自己的工作是同哲学思维错综地交织在一起，要是没有对哲学文献的充分认识，他们的工作会是无效的”[6]。细胞衰老学说的研究不是独立的个体，它是普遍联系的，将之与环境问题，经济问题，社会人文问题、法律问题等等综合研究才能真正实现社会价值，为社会的发展，社会的前进起到应有的作用。

四、细胞衰老学说离不开哲学思维的唯物辩证法

科学研究中的哲学思维是与一般科研思维融入一体，真正的唯物主义哲学并不认为假说是唯心的，需要通过不断地提岀新的假说或假设，然后通过构建科学技术，进不去证明。假说或假设是科学无法存在的基础，是科学向前发展的动力。这就是科学的理性主义态度或方法论。用胡适先生说科学的态度或方法就是“大胆地假设，小心地求证”[7]。假设-验证是医学科学家常常使用的思维方式。细胞衰老学说就是首先通过假设，然后通过实验的不断证实进行的，只有不断的假设，不断的通过基础实验去验证，才能使衰老学说的机制得到很好的验证，才能不断的进步，不断的探究，更好的使用在机体衰老机制的研究。

五、正确认识事物的逻辑方法

第7篇：细胞生物学的研究范文

近年来人们对干细胞的认识逐渐增加，当知道干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，甚至可以使人返老还童，让青春永驻时，人们便开始企盼着干细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。

【关键词】 干细胞 生物特性 应用

近年来人们对干细胞的认识逐渐增加，当知道干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，甚至可以使人返老还童，让青春永驻时，人们便开始企盼着于细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。

1 干细胞的概念

干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞，医学界称之为“万用细胞”。 按照干细胞的分化潜能，分化层次及其所具有的功能，大致可分为三种类型：胚胎干细胞、组织干细胞和专能干细胞。胚胎干细胞又称全能干细胞，是从哺乳动物包括人的早期胚胎分离培养出来的。其分化潜能大、增殖能力强，既是胚胎发育的基础，又是机体各种细胞最早的祖先，由它可形成完整的生物个体，如早期的卵裂球细胞、胚泡中的内细胞群中的细胞、早期生殖嵴的胚芽细胞等。 从某种意义上说受精卵也可视为特殊的全能干细胞。胚胎干细胞在进一步的分化中，可形成各种组织干细胞，又称多能干细胞，它具有分化出多种细胞组织的潜能，但不能发育成完整的个体，如多能造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞等均属于此类。这些多能干细胞在一定条件下可分化成定向发育的、多系列的专能干细胞。专能干细胞只能分化成某一类型的细胞．专能干细胞的分裂是不对称性的，即在其所形成的2个子代细胞中，1个仍保留原来干细胞的全部特征，以维持机体内干细胞在数量上和质量上的稳定；而另一子细胞却开始分化，发育，最终形成新的具有特定形态和功能的体细胞，以对正常相应组织细胞加以补充，维持细胞器官生长与衰亡之间的动态平衡。由于全能干细胞分化发育成体细胞的过程，是一个连续的过程，也是细胞数量上由少到多，功能上由幼稚到成熟的增殖、放大的过程。

2 干细胞的生物学特性

干细胞具有多种生物学特性，最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能力。干细胞本身不是处于分化途径的终端，它可连续分裂几代，也可在较长时间保持静止状态；干细胞通过两种方式生长，一种是分裂形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂，一个子细胞最终分化为功能细胞，另一个分裂成为干细胞保留下来；干细胞表现出很强的可塑性，其调控机制目前尚未清楚。

2.1 胚胎干细胞(ESC)的生物学特性 ESC细胞具有早期胚胎细胞相似的结构特征，有较高的核质比和正常的整倍体核型。胚胎细胞在发育的不同阶段，其细胞表面出现不同的抗原。未分化的人ESC细胞表面SSEA3、SSEA4、TI160、TRA181等呈阳性。而未分化的小鼠ES细胞表面仅SSEA1抗原阳性Ⅱ［1］未分化的ESC细胞表达高水平的端粒酶活性和转录因子Oct4，碱性磷酸酶染色呈阳性。胚胎干细胞的表面抗原是指在胚胎干细胞未分化状态下高度表达，一旦分化，基因迅速降调甚至关闭。这些标记物加上干细胞时期细胞内碱性磷酸酶、端粒酶的特异性高表达，可成为鉴定胚胎干细胞的依据［2］。

2.2 成体干细胞的生物学特性 成体干细胞(ASC)是一类具有自我更新，高度增殖和多分化潜能的细胞群，有横向分化能力。目前国内外学者研究热点是其横向分化能力。其机制还不清楚，目前被大家接受的观点主要有以下几种：（1）异质干细胞的存在；（2）原始多能干细胞的持续存在。美国的学者Jiang Y等［3］提出成体骨髓中确实存在一类被称为多潜能的成体干细胞(MAPC)，MAPC表达Oct4、Rex1，虽然较ES细胞表达低，但一般的成体干细胞不表达；（3）细胞融合，移植的1细胞与不同谱系的宿主细胞自发融合，导致遗传信息的转移，形成的杂合细胞遗传了两个亲代细胞的特征，如TeradaN等［4］研究证实骨髓基质细胞通过细胞融合表现出其他细胞的表型。ASC的鉴定识别主要通过三种途径［5］：分离培养和形态学观察；免疫表型鉴定；分化功能检测。分离培养和形态学观察是最直接简单的鉴别方法：如利用问充质干细胞(MSC)在培养瓶中可贴壁生长的特点，弃去未贴壁细胞，得到MSC集落，用显微镜观察细胞形态来辨别细胞。免疫表型鉴定是目前研究最多的，虽然其特异性比较高，但所需的实验条件较高，表面抗原试剂价格昂贵，且由于大多数成体细胞没有独特的免疫标记物，只能通过排除其他细胞来确定是否为目的细胞来识别鉴定：只有造血干细胞具有特异性的表面抗原CD34，而MSC就没有特异性表面抗原，它不表达CD34、CD14、CD45，只表达SH2、SH3、CD29、CD106、CD166。分化功能检测法主要是通过观察ASC诱导分化是否能生成预期的细胞类型来反证是否该种类型的干细胞：如MSC可诱导生成成骨细胞及软骨细胞，只要通过染色等方法证实诱导生成的细胞是成骨细胞或软骨细胞即可证明是MSC细胞，此法在目前的研究中用到比较多。

3 干细胞的应用

3.1 移植治疗 移植治疗目前已经成为治疗疾病的一个重要手段，如器官移植、细胞移植等。干细胞移植是一个尤其重要而意义重大的手段。从20世纪80年代起，造血干细胞移植已经成为治疗癌症、造血系统疾病、自身免疫系统疾病的重要手段。之后，外周血干细胞移植并辅以化疗及细胞因子CG-CSF、GM-CSF等，可使更多的干细胞进入外周血。1989首例脐血治疗Fanconi贫血成功后，许多国家纷纷建立了规模不等的脐血血库。因脐血富含造血干／祖细胞、其免疫细胞的抗原性较弱、C，IL祖细胞较少、移植相关GVHD的发生相对骨髓的外周血少而轻，采集容易、对供者无任何伤害。故被认为是极具潜力的新造血干细胞的来源［6，7］。神经干细胞的研究为神经系统疾病的治疗提供了广阔的应用前景。啮齿类中枢神经细胞系包括中枢神经干细胞已被用于许多鼠的疾病模型，如鼠遗传性神经退化症，包括脱髓鞘症、脑神经节苷脂沉积症和其它神经退化紊乱(包括多巴胺能神经．如肾上腺髓质．胚胎腹侧中脑和畸胎瘤组织的移植)治疗研究中［8］。神经干细胞的临床价值已在治疗帕金森病中得到证明。

3.2 克隆动物及转基因动物的生产 自绵羊“多莉”问世至今，体细胞克隆动物多有成功的报道。但体细胞克隆动物有着无法克服的弊端，即成功率低和容易早衰，“多莉”羊在它存活的第5个年头也终难逃一劫。而Wakayama等用长期传代(30代以上)的小鼠Es细胞克隆出31只小鼠，14只存活，可见存活率大大提高。因此KS细胞克隆动物具有光明前景。转基因动物是利用受精卵或ES细胞作为载体，通过注射目的基因，从而生产带有目的基因的动物。转基因ES细胞系将为大量同系转基因动物的生产奠定基础。应用干细胞进行动物克隆，可以有效地提高稀有动物的繁殖和高效畜产品的生产，以及高效生物活性物质的生产［9，10］。

3.3 转基因干细胞基因治疗 现有的基因治疗有2类：（1）转基因细胞治疗。（2） 核酸治疗。前者常用的基因转移靶细胞多为淋巴细胞、成纤维细胞等。其缺陷为细胞存活时间有限，在治疗过程中需要反复输注，治疗繁琐。转基因干细胞技术解决了转基因细胞存活问题，成为转基因细胞治疗重要的方向。近年来，人类基因组测序为认识生命现象以及疾病发生的物质基础提供和建立了完整的信息库，DNA芯片技术就是在此信息库基础上对疾病诊断的方法学革命。与此同时，“分子治疗”技术也倍受关注。但是，由于蛋白质分子量巨大难以进入细胞，只能作用于细胞表面分子而发生作用，而且基因治疗有依赖病毒序列作为基因载体的弊病，因此限制了“分子治疗”的应用。(11)如何克服这些弊病，改进技术，是分子治疗领域的主要课题之一。干细胞生物工程正是改造“分子治疗”的。(1)干细胞具有自我扩增和分化功能，因此导入的“外源基因”可以有效地得以扩散；(2)干细胞可以在体外进行操作，对基因的改造和修饰可以在体外完成并经筛选后再导人体内，避免由于基因插入而导致的细胞失常；(3)干细胞是人体细胞，作为载体其毒性最小，而且作为生命的最小单元，是导入组织的最佳形式。

3.4 ES细胞为发育生物学研究的理想体外模型 KS细胞具有全能性和无限增殖能力，并能在体外培养。因此，可以作为微环境改变对细胞分化影响的理想研究材料。随着现代生物技术的发展，研究不同生长调节因子在ES细胞分化中的作用，已成为可能。尤其是基因芯片技术的完善，通过mRNA差异显示，为ES细胞分化和不同分化阶段细胞的基因转录和表达的研究奠定基础，成为揭示发育和分化的分子机制的重要手段。

4 存在的问题

干细胞研究虽然有很大的进展，但仍需解决许多难题：（1）干细胞的分离、纯化、增殖、鉴定的问题。这是所有问题的起点，如果没有扎实可靠的分离培养技术，也就没法进行后续实验研究。没有有效的增殖技术，就达不到细胞移植等治疗所需要的细胞数量。干细胞的纯化及鉴定目前虽然研究很多，但由于许多干细胞没有独特的表面抗原，所以其鉴定问题将是一大难题，需要各国科学家们进一步研究。（2）干细胞诱导分化的问题：每种组织细胞产生的诱导条件不同，这就需要研究者们后续摸索前进。（3）移植后免疫排斥反应：干细胞治疗虽然有广阔的应用前景，但利用ES细胞移植或异体干细胞移植治疗疾病过程中免疫相容性问题必须解决。一种解决ES细胞移植排斥反应，方法是从病人自身细胞的核移植分离hES细胞，这个概念称为“治疗性克隆”(12)；还可以通过暂时服用免疫抑制剂，然后逐渐停止服药；也可使用微胶囊法来阻止移植物与受体免疫系统间的相互作用等方法。（4）干细胞治疗中生物安全问题：干细胞在移植到体内后是否会分化成其他意料外的组织或引发其他疾病，这些都需要进一步的实验证实。其他的如伦理学和社会问题等等，需要学术界与政府机构共同协作，为干细胞的研究更上一层楼而努力。

5 展望

基因组、后基因组计划和干细胞研究是20世纪与21世纪交替之际中生命科学中的两股强大的潮流，基因研究正在全力构筑起生命科学的基石，干细胞的基础研究及开发应用则将打开疾病治疗的突破口，它将成为21世纪生物产业的核心内容之一。美国《科学》杂志1999年和《时代》周刊和2000年相继将干细胞生物工程学评为世界十大科技成果之首，这项研究具有重要意义和诱人的应用前景，各国科学家都在关注和进行这一领域的研究，并吸引各种资本投入巨资投入这一领域，几乎所有的发达国家均成立了干细胞公司，开展干细胞生物学研究及提供干细胞应用服务。国内天津、北京、上海、广州等高校及科研单位也相继成立干细胞研究中心及干细胞技术公司。据最新报道，中国医学科学院天津血液研究所于2001年I1月4日通过了亚洲脐带血干细胞库的验收，该库从2001年4月18日接受第一例储存脐带血干至今，已收到近3 000例脐血。南京市第一医院也将于近期用造血干细胞移植治疗严重的冠心病，使疤痕累累的心脏生长出新的心肌细胞。从目前发展的趋势看，干细胞的研究在不久的将来(3～5年)将会取得惊人的突破。如利用于细胞(特别是胚胎干细胞)培养产生人体各种组织器官，产生克隆器官，供人体移植使用，修补及替换损伤的组织器官，治疗各种疾病。但是在干细胞的研究中也存在着诸多困难有待于解决，目前急需解决的是各类干细胞分离纯化、鉴定、繁殖，它们之间定向分化的关系，临床实验应用中存在的问题等。应建立一系列可靠的技术方法，完善于细胞的建系。而且国际和国内应制定相应的法律法规，保证干细胞研究的合法化、规范化。

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第8篇：细胞生物学的研究范文

【关键词】 治疗性克隆；细胞核;移植；胚胎干细胞

1治疗性克隆概述

治疗性克隆（therapeutic cloning）是体细胞核移植技术和最新的人胚胎干细胞技术结合的产物，将成为人类医疗历史上革命性的技术. 该技术首先应用患者体细胞，如皮肤细胞、骨髓间充质干细胞，作为核供体，移植入去核的人卵母细胞，获得克隆胚胎；然后从克隆胚胎分离建立胚胎干细胞系；并将这些胚胎干细胞在一定条件下，诱导分化成所需要的各种类型的细胞用于治疗目的［1，2］. 目前已报道，将产生多巴胺的神经元细胞用于治疗帕金森症［3］，将产生胰岛素的胰岛细胞治疗糖尿病患者［4］. 从理论上来说由于使用的是患者自身的细胞生产出来的治疗用细胞，移植这些细胞到患者体内将不会产生免疫排斥反应. 另一方面，每年都有数以百万计的患者需要细胞、组织的修复或者器官移植，由于胚胎干细胞可以无限传代，在数量上可以保证治疗的需要，从而解决可供移植的细胞、组织和器官来源严重不足的瓶颈问题［5］，为人类健康和长寿提供了新的希望.

近年来，利用核移植技术和胚胎干细胞技术相继建立了人核移植胚胎干（nuclear transfer embryonic stem cell，ntES）细胞系和人兔异种间ntES细胞. 这2项阶段性研究成果的取得，标志着治疗性克隆研究的巨大进步. 韩国科学家Hwang等［6］通过核移植技术获得了人人ntES细胞. 他们以健康女性志愿者的体细胞为核供体，以其自身卵母细胞为受体. 在30枚核移植囊胚中，得到20个内细胞团（ICMs），建成1株人 ntES细胞系，可传代培养70 代以上. 上海第二医科大学盛惠珍研究小组［7］在国际上首次构建了人兔核移植重构胚. 分别将5，42，52和60岁4个年龄组的人皮肤成纤维细胞核移入去核兔卵母细胞内，获得ntES细胞，通过原位杂交、免疫组化、核型和同源基因分析等证实 ntES细胞具有人源性，并且保持干细胞的未分化特性，能形成类胚体，在一定诱导条件下可以分化为神经、肌肉等3个胚层的细胞群. 200506，汉城国立大学的研究者［8］以患者的皮肤细胞为供体，以志愿者捐赠的卵母细胞为受体，利用体细胞核移植技术成功建立11株人核移植胚胎干细胞，这些细胞具有多能性，染色体正常，与供核患者的DNA一致、组织相容性抗原一致.

2治疗性克隆的应用前景

ES细胞在生物医学的各个领域均有广阔的应用前景，ntES细胞也有着同样广阔的前景，为临床治疗学、细胞生物学、生物发育学、比较动物学等研究提供研究材料和方法.

2.1临床疾病的治疗ntES细胞与普通的细胞移植治疗相比，具有革命性的进步. 它以患者的体细胞为核供体，通过核移植技术获得的ntES细胞，与患者的遗传物质相同，可以消除受体对供体的免疫排斥反应，为目前多种退形性疾病，如心脏病、脊髓损伤、帕金森病、1型糖尿病等的治疗带来了新的希望. 特别是一些目前还没有找出致病基因的遗传病，如脊髓侧索硬化症，ntES细胞移植是最有希望的治疗方法. 目前已经应用ntES细胞在体内外分化成多种细胞，包括神经细胞和生殖细胞［9，10］. 尤其Barberi等［9］建立了一套方法，能使 ntES细胞向中枢神经系统细胞特定分化，能产生高效率的神经胶质细胞、寡突细胞、神经元细胞，包括多巴胺能神经元、γ氨基丁酸能神经元等，将分化的多巴胺能神经元移植到 Parkinson病模型后，能改善其症状. 细胞治疗的途径有两种：其一，ntES细胞定向分化后移植. 细胞扩增后，体外定向分化，对分化细胞进行纯化，将获得的目的细胞移植到病变部位，替代丧失功能的部分细胞；其二，ntES细胞原位移植. 与定向分化后相比，ntES细胞原位移植有以下缺点：①没有经过纯化，可能将污染的异源饲养层细胞带进移植部位；②ntES细胞没有转入经选择基因，无法控制植入细胞的命运，可能发生癌变；③ntES细胞分化成分复杂，目的细胞分化成分少，可能出现大量非必须细胞的分化.

2.2细胞生物学通过研究ntES细胞的体外分化特性，可以识别某些靶基因，对人类新基因的发现，功能基因的研究，以及基因治疗的研究均有重要意义. 通过探讨ntES细胞体外增殖和分化的机制，了解各种生长和分化因子的作用，为组织再生和修复的研究提供了新的工具；通过诱导ntES细胞癌变，可分析肿瘤细胞发生的分子机制. ntES细胞作为一种得天独厚的研究材料，对于阐明细胞增殖、分化、凋亡、迁徙、恶变等机制有着重要意义. 自发现ES细胞以来，人们已经利用ES细胞建立了多种细胞类型的体外分化系统，体外分化的多种细胞类型都曾被成功的植入胎鼠或成体鼠，在受体鼠体内形成有功能的细胞群.

2.3发育生物学由于哺乳动物在母体内受胚胎发育的个体大小和内环境条件的限制，很难系统地研究其早期的发育进展、细胞分化及调控机制等. 比较动物卵母细胞质对同种或异种细胞核发育的影响，在细胞和分子水平上为研究哺乳动物胚胎早期发育的调控机制提供了良好的材料和方法，也为研究胚胎发育的影响因素提供了便利条件. 建立在ES细胞和基因打靶技术基础上的复杂的转基因系，使人们可以建立有效的分析系统，从而在分子水平上研究不同的生物学问题. 它不仅可以将一些在发育过程中对动物体非必需或可被替代的特定基因进行敲除(gene knockout)，在体内进行功能缺失研究，而且还可以研究基因在不同发育时期中的作用. ntES细胞作为一种体外细胞系，提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系. 因此，就有可能人为地产生一些基因突变，如对胚胎致死性基因的研究等，也可利用这些突变的基因来克隆产生转基因小鼠，从而建立基因突变的模型.

3治疗性克隆面临的问题

3.1亟待解决的问题①体细胞克隆效率与ntES细胞建系效率普遍较低：核移植胚发育至囊胚的几率为19%～25％，与牛、猪的核移植囊胚发育率相当分别约为25％和26％；从克隆囊胚获得ntES细胞的效率仅有4%~16％，平均8.2%［11］. ②卵母细胞来源问题：ntES细胞用于人治疗性克隆，卵母细胞的需求量是非常大的，目前尽管已有许多措施来改进核移植技术，但仍没有明显提高. 要得到一个ntES细胞系平均需要12 个囊胚，而所需要的卵母细胞数就更多了，一个ntES细胞系平均需要666个. 如果ntES细胞系用于人类疾病的治疗，这样的代价是非常大的，即使目前报道的最高效率的建系，也是30个卵母细胞，才能得到一个ntES细胞系. 另外一种替代策略就是利用非灵长类异种哺乳动物的卵母细胞，例如兔、山羊等. ③伦理问题：胚胎生物技术涉及使用早期未着床的胚胎，特别是治疗性克隆技术还将无法避免的使用通过体细胞克隆获得的人的早期克隆胚胎. 世界各国尤其是西方国家对此争论很大［12，13］. 迫于社会公众与宗教的压力，大多数西方国家对治疗性克隆技术应用于人类，持反对态度，不允许国家科研经费支持治疗性克隆的研究. ④临床应用问题：如ES细胞系可能在培养过程中出现染色体非整倍性问题，ES细胞定向分化能力及分化细胞的稳定性问题；其次，异种核移植产生的人动物重构胚还存在安全性问题：异种重构胚在发育早期含有2种线粒体，以后供核体的线粒体取代了受体的线粒体，但受体卵浆中所带的异种蛋白，包括细胞器及mRNA，它们的命运如何，是否也像线粒体一样完全被供核体所取代，还有待进一步证明. 再次，在核移植的过程中，可能存在跨种间病毒传染，例如，人兔核移植胚胎干细胞，有可能将某些目前未知的兔疾病传染给人类，就像艾滋病病毒可能是从非洲猩猩而来那样.

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3.2建立我国知识产权的治疗性克隆技术随着干细胞技术和体细胞核移植技术的研究进展，我国学者在治疗性克隆的技术方面也处于世界前列. 当前，在我国研究和发展治疗性克隆技术，建立我国知识产权的治疗性克隆的细胞产品，创建细胞治疗产业，是一个很好的机遇. 我国在治疗性克隆研究领域的优势：①目前，我国在哺乳动物克隆技术的研究方面处于国际先进水平，相继成功克隆出了牛、羊等动物. 1991年，西北农林科技大学生物工程研究所在世界上首次获得山羊胚胎细胞核移植成功，共得到5只羔羊. 1998年，该研究小组用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作供体，采用细胞质内直接注射的方法将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内，胚胎激活后移植到受体母羊子宫角，获得了2只体细胞核移植后代，这是世界上首批成年体细胞克隆山羊，并获得了克隆山羊的第4代后裔，目前仍生长健康. ②宽松的人文环境. 中国公众有着不同于西方的伦理观念，对于动物权利和早期胚胎的担心没有西方国家严重，也基本没有因为宗教信仰而反对胚胎生物技术的问题. ③法律和法规的基本保证. 为保证和促进人胚胎干细胞研究的健康发展，国家科技部和卫生部联合下发了《人胚胎干细胞研究的伦理指导原则》，使治疗性克隆的研究合法化. 但我国明令禁止克隆人和买卖人类胚胎.

然而，中国的优势不能在治疗性克隆的研究领域走在国际前列，主要原因是经费不足和相关学者缺乏协同研究. 应用克隆技术结合胚胎干细胞体外诱导分化和细胞治疗方法的关键是技术问题. 我们希望临床学者与基础细胞生物学家联手合作，借鉴国外的思路，应用自愿者的卵母细胞，建立中国人的ntES培养技术，为治疗性克隆的临床应用奠定基础. 我们坚信，中国有可能在这个领域走在世界前沿.

【参考文献】

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［11］ Mombaerts P. Therapeutic cloning in the mouse［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2003；100（Suppl 1）：11924-11925.

第9篇：细胞生物学的研究范文

［摘　要］　目的：探讨经络实质。方法：从分子解剖学、细胞生理学、细胞药理学等方面已取得成果，多层面分析、探讨。结论：传统中医的经络现象之秘将会在细胞生物学、分子生物学等边缘学科研究进展中得以揭示。

［主题词］　经络实质；经络现象；经络学说；解剖学；神经生物学StudyandAnalysisofMeridianEssenceChenJunde，

LiWu（HejinMunicipalDeformityFederationRehabilitationCenter，Shanxi0433

00，China）

［Abstract］　Purpose　Toapproachmeridianessence．Methods

Analyseandstudymeridianessencefromachievmentsattainedbymolecularana

tomy，cytophysiology，cellularpharmacology，etc．．Conclusion

MeridianessenceintraditionalChinesemedicinewillbeexploredinstudyadv

ancesofcytobiology，molecularbiologyandothersciences．

［Keywords］　MeridianEssence；MeridianPhenomenon；

MeridianTheory；Anatomy；Neurobiology

针灸学的发展，离不开经络现象与经络学说。

近年来由于细胞生物学、分子生物学等边缘学科不断取得的研究进展，使得人们有可能从更为细微的水平来认识人体结构和功能活动发生、调控等方面的客观运动变化规律，这就为经络实质的揭析提供了科学的基础。围绕着这方面的研究进展，有可能从分子解剖学、细胞生理学、分子发生学、细胞药理学等不同的方向全面推动新世纪医学发展的进程。

1　分子解剖学―――以经络结构特征研究进展为前奏的解剖学研究发展

尽管20世纪的许多解剖学家都把活体的、分子水平的结构学特征作为研究的基本对象，但事实上在整个20世纪解剖学的研究都是沿着固定、显微镜下观察这一模式发展的。最早对这一模式提出挑战的就是经络现象的结构学特征研究。

1.1　经络现象的科学验证近几十年来，全世界的研究者面对丰富多变的经络现象动用了几乎所有的解剖学研究方法却终无所获，致使一部分人对经络的客观存在提出了疑问。但也有人对现代解剖学的研究方法产生怀疑，这是因为从细胞生物学的研究角度看，人体活体细胞对于机械刺激的凝胶收缩反应是可以借助细胞连接结构自动进行传布的。而有人研究证实，针刺经穴诱发的循经感传活动其实具有活体细胞的刺激―反应―传导耦联特征的［1］。这就从活体细胞实验研究这一角度证实了经络现象的客观存在。既然经络现象在细胞生物学研究领域内确是客观存在着的，人们何以会找不到其结构学上的特点呢？1.2　细胞连接通讯的结构学特征很久以来，细胞生物学家们就对细胞连接通讯现象极感兴趣，目前这方面的研究不断取得进展，使得细胞连接通讯成为当前细胞生物学研究的一个十分重要的领域。然而在区分、鉴别不同分化细胞或相同分化细胞间不同的细胞连接通讯结构特点的研究工作则毫无进展。这时人们发现现代解剖学的研究其实并不包括分子水平的结构学特征，因为迄今为止的所有解剖学研究方法都是不能用来证实分子水平的结构特征的。

1.3　细胞连接过膜连接子结构模型分子生物学的研究进展表明，组成细胞连接过膜连结的微管蛋白是一个大的基因家族，使得这些看上去相同的蛋白质具有不同的抗原性。由于微管蛋白表面的不同附着点将成为细胞外基质连接蛋白、细胞膜表面的整合素、跨膜结合蛋白以及细胞内的微丝蛋白、信号传导蛋白等的结合部位，因此，以微管蛋白为核心的细胞过膜连接结构就具有了分子解剖学方面的特征，而决定这种结构特征的主要因素在于细胞的胚胎来源性。由于个体发生过程的连续性，以细胞连接过膜结构为主的分子解剖学通道可能会自我封闭成为一个一个的子系。因此，未来解剖学的主要研究任务之一，就是要阐明证实这些体系的具体存在方式，而经络现象则因同时具有细胞连接通讯和整体功能活动的双重特征，有可能成为这方面研究的最佳突破口。

2　细胞生理学―――生理效应转换模型与针灸作用机理研究

针刺经穴引起特定相关组织、器官功能代谢活动相应改变的作用机制，虽多年来为生理学家们所关注，但迄今为止尚未有一致的意见。近年来，随着细胞生物学有关细胞内信号转导研究的进展，使得人们可以从细胞水平重新考虑人体生理功能活动的产生及调节作用。

目前的研究进展表明，有机体几乎所有分化细胞对所有刺激、调控作用的反应，首先都是从细胞膜的信号转换作用这一方式开始的。例如，第二信使、G蛋白、酪氨酸蛋白激酶以及一些小分子物质如NO、CO、Ca2＋等。与这些转换作用相对应的则是细胞内众多蛋白质以功能、活性相关的信号传导方式组合成相关的序列。如果有机体细胞内各信号传导序列之间是严格区分开来分别进行着的，则人们自然可在信号传递与效应之间划上等号。然而细胞生物学的研究资料表明，细胞内的众多信号传导序列之间事实上经常存在着一些自动的“作用交叉点”，即某一信号传导序列的某种蛋白质可以同时又是另一信号传导序列的作用环节，从而使得不同信号传导系列之间可以发生直接的转化，人们称其为细胞信使级联现象［2］。对不同分化细胞的特定功能活动来说，细胞信使级联现象可能会导致不同生理效应的转换。有实验表明，肥大细胞释放组胺的作用一般是由细胞表面抗体与特定抗原结合后引发的；如果用细胞松弛素B破坏细胞内的微丝结构，则这一特定的释放作用即可受到阻滞；反之，若用一种Ca2＋通道激活剂使肥大细胞内Ca2＋浓度升高，即使没有抗原―抗体结合肥大细胞仍可释放组胺。表明不同分化细胞的信使级联现象可以直接转换成为特定生理效应的形成或调节。这样人们就可以从细胞信号转导的角度研究特定生理功能活动的形成及调节作用，而针刺经穴的作用机制也就可能从此得以阐明。

3　细胞药理学―――分化细胞对药物的不同易感性及其整体药理效应的形成

实验研究表明，在不同经穴注射不同的药物可以引起不同的药理学效应，这种效应的形成与经典药理学研究中的常见因素，如药物的吸收速率，药物在血液及效应组织、器官内的浓度以及神经系统的完整性等并不直接相关，但是却与注射药物穴位经络循行区域内细胞外基质的存在状态直接相关。表明药理学研究亦将进入一个新的历史发展阶段。

3.1　分化细胞的信使级联与药物的易感性尽管活体分化细胞基本上都具有对生活环境、整体调控因素产生信号转换、传导作用，但不同分化细胞对同一刺激、调控因素的信号转换作用可以是不相同的；即便是同一种分化细胞，由于其细胞连接通讯功能信息传递作用可以是各不相同的，故其信使级联综合反应的特点也就可能不同。因此，对同一刺激、调控因素的反应也就可以是不相同的，这就为不同经穴注射同一药物可以产生不同的药理效应奠定了内在的基础。

3.2　信使级联综合平衡模式与中药复合式药物作用根据细胞生理学信使级联理论，不同分化细胞内功能、代谢活动状态是由信使级联综合平衡模式决定的，其最大的特点在于，人体生理功能活动的形成及调节是多个作用因素同时作用的结果；某种非特定刺激、调控因素可以诱发组织、器官的特定功能。从多元性相互作用这一角度看，传统中药的复合式药物作用与细胞信使级联综合平衡模式是基本相适应的。这样，经穴对药物的不同易感性可能会演变成为对不同分化细胞功能活动状态的综合性影响，可以将这一药理作用模式称为细胞药理学假说。

3.3　特化细胞连接通讯的信息放大作用由于细胞连接通讯可在不同分化细胞间传递同一种功能活动信息，而经过信使级联的综合作用，使得这一非特定的功能信息传递作用最终表现为不同组织、器官、系统的不同活动状态。特化细胞连接通讯是将不同部位的不同组织、器官、系统连结在一起的特殊分化前联系体系，其信息放大作用更具特殊性。这样一来，经穴对药物的不同易感性及其对信使级联综合平衡体系的影响，就可借助特化细胞连接通讯的特定放大作用形成整体性的药理作用。这种以细胞药理学为基础，以特化细胞连接通讯为主要作用途径的新药理学理论可能是新世纪医学研究趋势的另一个重要方面。

综上所述，21世纪医学发展的基本趋势可能是将细胞生物学、分子生物学等边缘学科的研究进展，全面引入解剖、生理、药理等学科的研究领域中，而传统中医的经络现象将会在这一历史发展进程中起着重要的启动作用。

4　参考文献

1　E．J．安布罗斯，D．M．伊斯蒂．细胞生物学．北京：科学出版社，1977：263