人类口腔菌群研究中双生子模型的进展

［摘要］人体内有大量的微生物存在，且与人体的多种机能、代谢以及身体健康状况、疾病等密切相关。不论是口腔疾病，还是全身的一些系统性疾病，其发生发展都与口腔菌群的定植、代谢、生长、繁殖有关，因此对于口腔菌群的探索是研究口腔疾病及某些全身系统性疾病的关键环节。双生子模型在遗传方面具有特殊性，其组内个体的遗传背景高度一致，接触环境也极其相似，可使研究的纳入对象之间高度配对，从而能够控制组内变量，排除混杂因素，提高研究的可信度，在人类菌群研究中有明显的优势。目前，已有众多学者通过双生子模型证实了环境、遗传等因素对人类口腔菌群有一定的影响，从而为口腔及全身疾病的预防、治疗提供了新的思路。本文就双生子模型用于人类口腔菌群研究的进展情况作一综述。

［关键词］双生子模型;口腔菌群;口腔疾病

人体携带着大量微生物，最新的研究估计，人体所携带的微生物数量与人体体细胞数目的比值约为1∶1［1］;并经大量研究发现，这些微生物与人体健康和疾病均有着密切的联系。口腔微生物不仅影响着口腔健康，导致龋病、牙周病等菌斑性疾病的发生［2－3］，同时还与心血管疾病、糖尿病、肿瘤等系统性疾病的发生发展密切相关［4］。以龋病为例:龋病是一种常见的慢性、感染性疾病，可引起牙体缺损、牙髓炎症、疼痛［5］，不仅会影响患者的生活质量，同时还会增加社会的经济负担。目前对龋损的主要治疗方式是去龋后的充填治疗。前期已有体外和口内模型研究证实，抗菌药物改性的充填材料能调节体外生物膜的生态结构、功能［6－9］，从而达到抗菌目的。虽然这些研究尽可能的模拟口内环境，但由于个体差异，以及体外生物膜菌种的单一等原因，依旧难以实现完全模拟。因此对于龋病乃至口腔菌群的研究仍亟待有更好的研究模型，而双生子模型则能一定程度的解决以上问题。双生子分为同卵双生子和异卵双生子，其中同卵双生子理论上拥有完全相同的遗传基因，而异卵双生子的基因约为50%相同;无论是同卵双生子还是异卵双生子，由于其早期在母体内接触到的环境基本相同，因此两者个体差异较小。基于双生子的这一特点，近几十年来，已有国内外学者应用双生子模型对人类口腔的菌群进行了分析研究，以期找到可能与疾病相关的微生物及其与宿主的关系，但仍存在不足之处，如动物模型的缺乏，前瞻性的研究较少等。本文就双生子研究模型用于人类口腔菌群研究的进展情况作一综述。

1双生子模型的定义、优点及运用

双生子研究是利用同卵双生子和异卵双生子的基因共享程度及表型相似性，来确定复杂疾病或性状的遗传学基础，并判断遗传因素和环境因素对表型变异的相对贡献大小［10］。相较于其他研究模型而言，双生子模型在人类研究中的优势在于:配对两个体的基因相似、在母体内和出生后所接触的环境也类似，且生活习惯接近，从而能很好的控制变量;在年龄、性别等方面能更好的匹配，有利于排除干扰、混杂因素，以便更高效能的研究疾病的发生发展与机体内某些因素或指标之间的关系［11］。除此之外，由于同卵双生子的相关性较高，因此运用患病状况不同的双生子进行病例对照研究时所需样本量相对较少［12］。经典的双生子模型主要用于研究特定的表型或特征与遗传和环境之间的联系，如果某种特征在同卵双生子组内表现相同，而在异卵双生子中有差异，则说明该特征受到遗传因素的影响较大;反之，如果某些特定的表现型在同卵和异卵双生子中都不同，则考虑环境因素造成这种差异的可能性较大。同卵双生子遗传背景相同，且后天环境相似，但却出现不同的表型时，这样的双子模型则可以作为病例对照研究的对象，有助于对人类菌群与疾病关系的研究，Ridaura等通过在无菌鼠肠道接种胖瘦状况不同的同卵双生子的肠道菌群后发现，接种较胖个体微生物的小鼠体重增长大于接种较瘦个体微生物的小鼠［13］。该研究为人类肥胖症的治疗提供了更加有效且持久性的方式，即通过相关益生菌或益生元的植入并搭配饮食的改变可治疗人类肥胖症。

2双生子卵性鉴定

由于同卵双生子和异卵双生子在基因相似程度方面并不同，因此鉴别双生子的类别尤为重要，否则会影响其遗传倾向性的判断，尤其是在样本量较小的实验研究中。现有多种分辨双生子类别的方法，其中相对简单的方法是通过问卷的形式，若双生子个体身体形态、面部长相等特征相同的多，且两人常被其他人认错时，则判定为同卵双生子，反之为异卵双生子。虽然这种方法带有一定的主观性，但由于简单易行，已成为一种常用的方法，尤其是在样本量较大时，其可行性较高。且有学者研究发现，通过问卷和询问的方式来鉴别双生子卵性时，其准确度可以达到90%［14］。随着分子技术的发展，DNA标记物成为了判断同卵或异卵双生子更为准确、可靠的方法［15］。鉴定方法的逐渐成熟，为双生子的准确卵性确定和双生子模型的构建奠定了基础。

3双生子模型在人类口腔菌群研究中的应用

在口腔菌群的研究中，双生子模型的使用较为广泛，涉及了唾液微生物、龋病微生物、口腔菌群定植时间等方面，旨在探究龋病、牙周病等相关微生物的特征与遗传和环境因素之间的关系。Goodman在20世纪50年代首次使用双生子模型进行口腔领域的研究。该研究共纳入38对性别相同的双生子(其中19对同卵19对异卵)，并利用体外培养计数的方式检测了双生子唾液中变异链球菌和乳酸杆菌的检出情况，结果显示异卵双生子的组内差异总是大于同卵双生子的组内差异，提示基因对人类唾液微生物可能存在决定性的作用;作者分析认为，这种差异可能是由于同卵双生子的父母会以更为相似的方式对待孩子，从而导致同卵双生子所接触到的环境更加相似，至于双生子唾液微生物的组成和量与龋损之间存在怎样的联系，还需后续的研究进一步证实［16］。此后，相继有越来越多的研究者通过双生子模型研究遗传或后天环境因素对于口腔菌群各方面特征的影响。部分研究发现，环境因素对于口腔微生物的影响可能超过遗传因素的影响。例如:杜芹等［17］使用聚合酶链反应－变性梯度凝胶电泳(PCR－DGGE)探究了20对双生子的口腔微生物群组的组成和结构，结果发现同卵双生子和异卵双生子组内均表现出明显的聚类分布，说明双生子间口腔微生物的组成相似度比较高;但同卵双生子和异卵双生子之间的相似度无统计学差异，根据经典双生子模型的研究结果判断，口腔微生物的组成受环境因素影响的可能性更大。Papapostolou等［3］也得到了相似的结果，作者对双生子龈上和龈下菌斑进行了限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLPanalysis)后发现，在纳入的95对双生子中，同卵双生子组和异卵双生子组在龈上、龈下菌斑组成的相似性上无统计学差异。Ooi等［18］研究发现，同卵双生子中两个个体均能检出变异链球菌的概率与异卵双生子相似，两者无统计学差异，而且乳酸杆菌的检出率也有相似的情况。龋病的发生受多种因素的影响，其中牙菌斑是重要的始动因素之一，而变异链球菌和乳酸杆菌则是现代科学家们普遍认同的主要致龋菌。从以上的研究结果来看，人类口腔菌群的组成受到环境因素的影响较大，而遗传方面的影响相对较小。Bretz等［19］侧重于口腔菌群的产酸情况进行了相关研究，结果显示，其研究对象中的各对双生子的菌群产酸量的分布无显著差异，在同卵和异卵双生子间也是如此，从而得到了环境因素对口腔菌群产酸情况的影响大于遗传因素影响的结论。以上研究结果提示，治疗和预防龋病过程中可考虑将环境因素作为靶点，即通过调节环境而中断或防止龋病的发生。但由于环境因素所指代的范围过于广泛，以上研究也并未指出某些能发挥具体作用的部分。因此，仍需大量的后续研究，一方面进一步证实这些结果的准确性;另一方面则希望能对环境和口腔菌群之间的关系有更深入的研究，以期找到更加具体和明确的研究靶点，从而发现龋病防治的新方法。除了经典的双生子模型外，由于双生子在一些个体基本特征上的高度匹配性(如性别、年龄、种族及基因型等)，也常有研究者将其运用到龋病及口腔菌群的研究中。Bockmann等［20］以151对同卵双生子婴幼儿(受试者均为0～1岁)为对象，结果显示:有93%的双生子其口腔变异链球菌的定植时间相同(平均在12个月左右)，从而为人群中婴幼儿口腔中变异链球菌定植时间的确定提供了参考。变链球菌是重要的致龋菌之一，深入研究其在口腔中的定植等情况，对于预防或延迟儿童感染变异链球菌，更好的判断个体的患龋风险而言意义重大。通常而言，要找到整个人群的口腔变异链球菌的定植时间，所需流行病学调查的样本量巨大，且操作困难，而纳入双生子为研究对象，则可以减少样本量，降低操作难度，所得到的数据也具有一定的参考价值。Corby等［11］通过双生子模型评价了口腔生物膜中细菌定植能力的可遗传性。该研究共纳入102对双生子(其中包括龋活跃性高的个体以及未患龋的个体，并要求一对双生子内两个个体的患龋情况相同)，通过对双生子牙菌斑中微生物DNA的棋盘杂交、微生物丰富度计算、可遗传性分析后发现，约有20种微生物在龋活跃度高的组和未患龋的组之间有显著性差异;与无龋组相比，龋活跃组牙菌斑中丰富度高的细菌多为与龋病相关的细菌，如变异链球菌和乳杆菌属;而在无龋组牙菌斑中检出较多的细菌则是一些已知的或可能有益于口腔健康的细菌，且多具有中等或较高的可遗传性。由于龋病的发病率较高，其防治依旧是公共卫生的一大难题。通过分析患龋与非患龋个体口腔菌群的差异，或许能够找到与龋病发生高度相关的细菌，然后再针对这些细菌及其特征找到预防、治疗龋病的新方法，以期达到降低个体的患龋风险、减轻社会医疗负担的目的。目前对于人类菌群方面的研究，已经逐步发现了遗传及环境因素等与菌群的相关性，包括口腔微生物、肠道微生物等领域。其中肠道菌群的研究较为深入和成熟，而在口腔菌群方面，目前已有的众多研究大多仅局限于描述性的，究竟口腔菌群的相关特征受环境因素或遗传因素的影响何者更大，以及口腔菌群是如何受到影响的，都尚未有较为肯定的答案，还需后续更加深入的研究来揭示口腔疾病的有关机理，双生子模型也将发挥更大的作用。

4展望

随着微生物研究从单一物种转向群落的研究，研究中能够得到的信息量越来越大，如何合理选择和利用数据，是研究者们需要思考的问题之一，这其中，模型的使用显得尤为重要。一个好的模型不仅能提高数据的可信度，降低研究操作难度，同时还能够为后期的类似实验提供参考。双生子模型基于其独特的遗传环境特性，在微生物群落研究中有着先天的优势。然而，目前对于双生子模型在群落方面的应用研究还不够深入。比如，在口腔菌群的研究方面，利用双生子模型研究主要还是描述性的研究为主，且多关注于比较同卵双生子和异卵双生子间有无差异，从而推断遗传因素或者环境因素的影响。但是，在大量的临床诊治和调查中，我们同样会发现同卵双生子的口腔健康状况完全不同的病例出现，对于这类患者目前仍仅有描述性研究。要解释在遗传背景相同，环境因素几乎一致的配对个体组内为何会出现这种差异，则需要进行更加具有前瞻性的研究，来揭示口腔健康的奥秘。人源化的动物模型是目前研究肠道菌群与相关疾病之间关系的常用手段之一，通过与双生子模型的结合，可将宿主菌群转移至动物体内，并复制宿主的表型，从而探究菌群与疾病之间的关系。但是，关于口腔菌群的研究，目前尚未见相应的人源化动物模型的报道。在今后的研究中，对于口腔菌群的研究可以利用患病情况不同的同卵双生子的唾液和菌斑进行人源化动物模型的建立，然后再结合临床资料以及基因水平的分析，以期能更有效的找到导致同卵双生子口腔健康状态不同的可能原因。双生子模型在人类菌群研究中的优势显著，并能控制变量，减小个体间的差异;而人源化的动物模型则能在一定程度上模拟人体内的状态，通过两者的结合，有望能为人类口腔菌群的研究打开新的思路和方向。

作者：吴虹乐 任彪 程磊 单位：口腔疾病研究国家重点实验室 四川大学华西口腔医学院