分子生物学分析精选(九篇)

第1篇：分子生物学分析范文

关键词： 分子生物学 经典实验 教学应用

现代分子生物学在60余年的发展历程中，许多已被公认的理论与机制是通过一些非常著名的经典的实验发现或验证的。比如证明DNA是遗传物质的肺炎链球菌感染实验、噬菌体感染实验；又如DNA半保留复制机制的验证及冈崎片段的发现等[1]。这些实验设计精巧、论述严密，其中有的研究方法现在仍然在分子生物学的研究中使用。通过对这些经典工作的分析与回顾，可以为科研工作者提供解决问题思路提供帮助，也可以帮助本科及研究生在专业学习中了解研究方法，提高对相关理论的掌握程度。在实际教学中，许多教师以对研究实例的分析作为课堂教学的手段[2][3]。

但也有一些实验并不像前述的那些例子那么众所周知，特别是一些学科跨越较大、研究思路或方法已很少应用在现在的科研实践中、非主要的理论成果等的理论证明过程中。这些结论在多数分子生物学的教科书中一般都是一句带过或者根本不提及其研究的过程。但如果仔细分析这样的一些研究论文，则仍然可以从不同角度帮助相关学科学习人员对该研究点的理解与掌握。

本文以三个教学实例为主线，探讨经典实验的分析在分子生物学课堂教学中的应用。

1.提高学生学习的兴趣

生物学科理论知识的学习，尤其是《分子生物学》和《生物化学》，因其研究对象都是在分子水平上，看不见摸不着，很难形成感性认识。而且这两个学科知识涵盖面广，理论框架繁复。特别是《分子生物学》主要讲述分子的结构与作用机制，单纯以传统的课堂讲授的方式授课，会给学生枯燥无味的感觉。另外，《分子生物学》部分内容在初中、高中的生物课程中都或多或少地有所涉及，国内外生物院系的相关专业许多专业基础课如《普通生物学》、《遗传学》等课程也与《分子生物学》有内容重复的地方[4][5]。这些重复的内容给学生“复习”的感觉。而单纯通过增加学习的深度区分这些不同的课程的内容会加重烦躁的情绪。

通过引入一些经典实验过程及其结果分析的内容，可以在很大程度上提高学生对相关领域的兴趣，增进对这部分知识的了解。比如，“DNA是遗传物质”的论点就主要是在几个主要的实验基础上得到最后的确证的。在“分子生物学研究历史”章节中，从最早的核酸发现开始，让学生了解分子生物学发展之初的研究基础与背景，引导他们通过讨论及问答解决“验证什么是遗传物质”这一命题；然后将这一命题的验证过程中包括肺炎链球菌感染实验、噬菌体感染实验等几个重要的实验设计思路、原理、讨论一一阐述，并与学生的思路相比较。通过这种方法，可以有效地把纯粹的理论学习置入该理论产生的时代，通过“侦破”式的线索游戏，提高学生的学习兴趣。

另外，近年来诺贝尔生理与医学奖及化学奖许多奖项都授予了与分子生物学相关的一些工作，如2012年山中伸弥的多能干细胞的诱导等；通过介绍这些工作，既可以提高学生的学习兴趣，又可以把国际上的研究热点与分子生物学的发展方向介绍给他们[6]，[7]。

2.启发学习过程中的创新思维

随着近年来基础教育的改革，学生创新思维不断得到发展，但应试的压力迫使中学阶段的教育在大多数的中学课堂遵循着以往的课堂讲授的方式，学生也更适应“老师讲，学生记”的灌输式的教育方式。如何在本科专业教学中进一步启发学生的创新思维是一项长期任务。

《分子生物学》本身是尚不完善的专业学科，新的知识新的发现和新的研究方法层出不穷。如小RNA的研究是近些年来分子生物学的研究热点[8]。小RNA的干扰作用的研究历史以故事的形式讲述，继而采用启发的方式引导学生讨论这一作用在研究中的应用[9]。通过这一启发过程，学生会充分了解在现代生物学研究中理论与技术的相互促进发展，鼓励他们对已有的知识充分思考，建立基础研究与社会应用间的联系，提高创新思维的主动性。

3.综合不同学科知识，开启学生进入科研殿堂之门

现代分子生物学在研究过程中综合了生物化学、遗传学、物理学、计算机科学等不同学科的技术与方法，目前的生物学研究也需要具备多学科知识的复合型人才。但限于实验条件与各学校的特点，大部分的教学实验室，尤其在多数地方性院校，几乎不可能具备条件让学生接触所有相关的实验过程，比如分子生物学最基本的放射性标记、分子杂交等。让学生知道这些技术、了解这些技术的原理与应用范围，对发展他们的科研思维具有重要意义。但仅通过幻灯片、多媒体等形式只能把这些方法的操作过程或仪器设备展示给学生，而不能让学生了解这些方法具体能做什么、得到什么样的结果、结果如何分析，等等。在经典的一些科研实例中，却不乏综合了多学科知识的精妙设计，对这些实例的分析可以具体地把其中使用的一些方法与技术的作用、结果分析等展示出来。

对于“mRNA的合成方向是5’―3’”这一过程的证明，早期发表的文献中便使用了多种不同的方法[10][11]。包括同位素标记、细菌生长曲线绘制、RNA的提取与纯化、RNA的浓度测定、RNA的碱水解等多种微生物学、生物化学的方法经过两个实验路线被串联起来，简单的方法却得到了可信的重要结论[11]。通过分析，学生认识到科学研究过程中结果讨论的严密性，认识到今天的许多成果与结论得来不易，改变他们“眼高手低”的惰性思想；另外，使他们认识到拓宽知识面在生活、工作中的必要性。

4.提高学生的检索能力和逻辑思维能力

学生自主学习的能力是他们走上社会后应对复杂环境的有力武器，对自主学习能力的培养要贯穿于整个教学工作过程。在教学实践中，一些细心的学生提出的一些有意义的问题，引导他们利用网络和图书馆资源，通过检索相关文献，得出问题的答案；最后与老师的结果对比印证。这种方法在提高学生自学能力的同时，提高了他们文献检索的专业技能，为他们未来的工作提供了一种新的工作方法。

仍以“mRNA的合成方向是5’―3’”这一问题为例。有学生在学习转录一章的内容后，想了解这一结论是通过什么方法获得的。但多个版本的《分子生物学》教学参考书中并没有提及这个问题。通过一些中文搜索引擎，也只能得到一些对这个问题并不确切的回答，只能查阅到在证明这个问题的过程中利用C14标记U。学生提出问题：起始和终止都有U，没办法证明转录的过程就是从5’到3’啊？

这个问题被作为课后作业布置给全班同学。在这个作业中，附带提醒学生注意这一问题作为研究热点所处的时间段，然后针对这个时间段通过学术检索系统检索最权威的文献。结果学生通过谷歌的学术搜索搜到了1960年表的两篇最相关的文献[11]。讨论后经过综合，这一验证过程可以描述如下：大肠杆菌在耗光培养基中所有的U后，0℃培养以放慢其mRNA合成的速度；加入放射性标记的U，在不同的时间点取细菌提取RNA，测定放射性掺入RNA的速度；用碱水解的方法从3’末端水解mRNA，最后检测水解后的单核苷酸及RNA的放射性。如果转录是从3’向5’方向的，那么单核苷酸中的放射性与RNA中放射性的比值会随着细菌培养时间的增加而减小；如果转录是从5’向3’方向，则这个比值会随着培养时间的增加而增加。实验的结果证明转录的方向是从5’向3’的。

通过这个作业，学生了解了专业文献检索中的一些方法，同时对前人工作中的逻辑推理过程也有了一定了解。另外，这个过程还帮助学生回顾了微生物培养中的生长曲线、RNA的生物化学性质等其他相关学科的知识。

总之，在《分子生物学》的教学过程中，充分利用经典实验的分析，可以在多方面强化教学效果，提高学生学习与掌握分子生物学基础知识与技能的能力。当然，这个过程要求任课教师充分了解学科发展历史和前沿，也需要系统的教学参考书籍、教学方案及媒体的支持。这需要一线教学工作者付出巨大努力，结合自己的科研，建立适合分子生物学这一重要的专业课程自身特点的教学方法，为国家与社会的发展培养更优秀的人才。

参考文献：

[1]Weaver.R.F著.郑用琏译.分子生物学[M].科学出版社，2010.

[2]蒋桂林.生物教学中的策略教育[J].生物学杂志，1999，16，（3）：36-36.

[3]李科友，朱海兰.创新理念，培养能力[J].微生物学通报，2011，38，（2）：250-255.

[4]梁顺祥，何涛，李淑娟，等.农林院校《遗传学》与相关课程间教学内容的重复及解决途径[J].遗传，2011，33（9）：1023-1026.

[5]王子健，张超，刘群红.生物化学和分子生物学课程整合的教学探索[J].基础医学教育，2011，13（12）：1061-1063.

[6]张凯，邱念伟.与分子生物学有关的诺贝尔奖简介[J].生物学通报，2012，47（8）：59-62.

[7]王长林，陈岩，魏力军.诺贝尔生理学或医学奖在“普通生物学”教学中的应用[J].微生物学通报，2013，40（011）：2123-2127.

[8]王云，罗勋，刘天骄，等.小RNA的生成机制与功能[J].生物学杂志，2011，28（2）：58-61.

[9]谢兆辉.小RNAs作用机制的研究进展[J].遗传，2009，31（12）：1205-1213.

[10]Maitra U，Hurwitz H.The role of DNA in RNA synthesis，IX.Nucleoside triphosphate termini in RNA polymerase products[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1965，54（3）：815.

第2篇：分子生物学分析范文

关键词结核病;结核分枝杆菌;聚合酶链反应

20世纪90年代,全球多数发达国家结核病疫情出现明显回升,许多发展中国家出现结核病疫情严重加剧,结核病已成为全球最紧迫的公共卫生问题,目前世界上没有任何一个国家能逃脱结核病的威胁。每年全世界约有800万新发病人,约300万人因结核病而死亡。我国的情况也是如此,据2000年第四次全国结核病流行病抽样调查表明,我国结核病的形势仍然十分严峻。结核病流行病学显示高患病率、高耐药率、低递降率等特点 [1]。因此快速准确的诊断是控制结核病的主要条件,我们对使用分子生物学技术聚合酶链反应在结核病实验室的诊断做了一些分析研究。

1材料

仪器与试剂:广州达安基因生物公司DA-7600荧光定量核酸扩增仪和结核分枝杆菌检测试剂盒。

2方法

2.1标本采集和处理

2.1.1标本的采集和液化

用一次性痰液收集器采集,最好留取早晨第一口痰液。痰液收集后应尽快送检。在痰液标本中加入4倍体积的4%NaOH溶液,吹打均匀后室温放置30分钟使之液化。

2.1.2 1×TE溶液配制

吸取1ml20×TE,溶于19ml去离子水中,混匀即可。

2.1.3标本及质控标准品的处理

取0.5ml液化痰液至1.5ml离心管中,再加入0.5ml4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟,吸弃上清,在沉淀中加无菌生理盐水1ml打匀,15000rpm离心分钟,吸弃上清:再重复洗涤一次。(血液标本直接用淋巴细胞分离液分离沉淀白细胞)沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀,沸水浴10分钟(误差不超过1分钟),转至4°C静置6～8小时以保证充分裂解。1000rpm离心5分钟,取上清液2ul做核酸扩增反应。另取阴性质控品、阳性质控品各40ul加等量DNA提取液打匀,沸水浴10分钟后同上处理。

2.2加样

将样品处理上清液各2ul分别加入反应管中,混匀后置核酸扩增仪上,立即进行PCR扩增反应。

2.3核酸扩增程序

93°C2分钟预变性,然后按95°C45秒55°C60秒,先做10个循环,最后按93°C30秒55°C45秒,做30个循环。

2.4结果分析

在定量分析中,综合考虑相关系数,误差后,设置当前域值(参考值1.2左右)。

3结果判断

Ct值无:阴性结果;Ct值

4质量控制

阴性质控品:全部阴性;阳性质控品(包括临界阳性质控品、强阳性质控品)全部阳性;阴性质控品Ct值>临界阳性质控标准品Ct>强阳性质控标准品Ct,则本次实验有效,否则,实验无效,应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。

5讨论

结核杆菌(TB)可以导致全身性疾病,特别是在发展中国家,其发病率较高,危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大,对抗痨药物的耐药性增加[2],从而使结核病的发病大幅度增高。虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断,但对某些病人亦可造成误诊或漏诊.分子生物学技术基本实现了简便、快速、防污染、灵敏、准确地诊断结核的目的[3],并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室[4]。应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的,且是结核杆菌的保守序列,这样才能保证检测结果的特异性[5]。自从1989年聚合酶链反应(PCR)应用于结核杆菌检测以来,该技术已广泛应用于结核病的诊断并显示出很多优点.PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围,PCR检测TB的优点主要表现如下:

5.1能早期诊断TB菌血症

在TB感染的早期,特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时,PCR就能给于扩增并确诊.此外,由于外周血中TB的含量甚微,又没有新的病灶形成,因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的,而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义,因为早期菌血症是较易控制的,并可以防止继发性TB病灶的形成。

5.2时间短

PCR检测TB仅需2～4h对于某些培养法难以实施的病例,PCR法则行之有效,同时提高了敏感性和特异性,可以检测到1个TB菌。

5.3有利于鉴别诊断

对于肺结核来说,其中的结核球和成人型原发性结核等,经常易于同肺癌的诊断相混淆。病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的。在这种情况下,PCR检测就显得特别有效。在许多情况下,TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等。涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点,但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值。PCR检测这类标本,可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水。另外,对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断,PCR都可以予以完成。

5.4抗痨治疗的评价

对于抗痨治疗效果的评价,以前的方法显得软弱无力。而PCR法则可以通过定期检测,采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度。 PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标。

所以分子生物学技术聚合酶链反应对于评估结核病的临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义。随着人们对结核分枝杆菌的认识不断深入,结核病临床发展的需要,我们必须从菌体水平到分子水平,从传统实验方法到现代实验方法,进行全视角全方位的研究和探索,为达到最终控制结核病提供理想手段。

参考文献

[1] 庄玉辉.加强结核病实验诊断技术的临床应用研究.中华检验医学杂志,2001,24:69-70.

[2] 勒小红、刘元东、苗 青。结核分枝杆菌耐药基因突变的研究。中华检验医学杂志,2004。27:117-117.

[3] Englund S.Bolske G,Ballagi-pordny A,et al,Detection of Mycobacterium avium Subsp.patatuberculosis in tissue sample by single.fluorescent and nested PCR based on theIS9100 gene.Vet Microbiol,2001,81:257-271.

第3篇：分子生物学分析范文

关键词：高中生物 分子与细胞模块 教学

“分子与细胞”模块是人民教育出版社出版的高中阶段生物学新教材必修模块的开篇，通过对这一本的学习，要提高学生对整个高中生物的学习兴趣，发掘学生积极探索生物奥秘的精神，并形成科学的学习方法和辩证唯物主义自然观，还要为学生在今后的生物学习中打下必要的知识基础和一定的能力基础。

1、高中生物“分子与细胞”模块的意义

1.1能够促进学生形成良好的辩证唯物主义自然观

（1）理解生命是由物质构成的以及构成生命的物质的具有特殊性

生物世界是奇妙而又多彩，它的基本组成单位却是一个个肉眼看不见的细胞，而组成细胞的所有元素都能够在非生物界里面找到，说明两者之间存在着一定的统一性，但是各种元素的含量又有所不同，又说明了它们之间还存在着差异性，在细胞的大分子有机物组成中，包含有蛋白质、核酸、糖类和脂质等，它们或者是生命活动的承担者和体现者，或者控制着生物的遗传性状，又或者承担着多种生命功能；这些大分子物质的单体又分别是氨基酸（20多种）、核苷酸（分为脱氧核苷酸和核糖核苷酸）、单糖（主要指葡萄糖）、甘油和脂肪酸等小分子单体组成，以碳链为最基本的骨架，构成了细胞的基本结构基础，上演着绚丽多彩的生命世界，从而使学生在分子水平上认识到生命是由物质构成的以及构成生命的物质的具有特殊性，很好的引导了他们能够形成比较正确的世界观。

（2）理解细胞是生命系统中最基本的，最小的系统

从小的方面到大的方面看，生命系统是由细胞到组织、到器官、到系统、到个体，再由个体到种群、到群落、到生态系统、到最大的生态系统生物圈；虽然细胞里面还有各种小的分子甚至原子构成的各种结构，可是这些结构并不能独立完成生命活动，只有细胞是能够独立完成各项生命活动的最小单位，所以说细胞是生命系统中最基本的生命系统。如同客观世界一样，它有自身内部的各个部门，各司其职，既相互作用、相互联系、又相互区别、相互独立，细胞也有它特有的结构，即细胞的膜结构将细胞分隔为各个小的空间，既能够分工也可以相互合作，承担起生物的生命活动。

1.2 帮助学生体会任何重大科学的发现都有曲折的历程及本质

（1）科学的发展没有止境，近现代生物科学的发展突飞猛进

本模块主要向学生介绍了有关细胞方面的科学新发展：像组装细胞、干细胞研究进展和人类健康、国际人类蛋白质组计划、细胞衰老的原因、通道蛋白等等，这些科学前沿的发展使学生体会到了现代生物科学发展生生不息。

（2）科学的发展前进也需要技术方面的支持和实验方法的改进

在本模块中，教材非常注重技术发明创新和实验方法改进在解决相关学科的科学问题中所起的重要作用，根据学生知识水平，在学生能够理解的范围内，作了一些简单的介绍，例如显微技术的发明和应用、掌握分离各种细胞器的方法、体验如何制备细胞膜、了解什么是同位素示踪技术及荧光显色技术等；从科学方法上，既有系统的分析方法，也有各种具体的科学实验方法，如构建模型法、控制单一变量法、设置对照实验等。

1.3 在日常生活的氛围中体会生物知识，利用生物知识为日常生产生活做贡献

本模块包含的相关知识，与人类的现实生活，经济发展，环境维护，医疗服务等方面联系密切，它虽然看似属于微观且深奥，却是研究细胞这一最小的生命系统的基础，将更加深远地影响人们的日常生活生产发展：如植物快速繁殖培育优良品种，动植物克隆技术，利用基因重组技术增加生物的多样性，动物干细胞全能性的再生移植等等。

归根结底，学生的学习目标是要把课堂所学知识能够与日常生活结合起来，为社会发展、人类进步做贡献，并全面提高学生素养，其实质也是寻求一种个人的价值体现。

2、高中生物“分子与细胞”模块的教学意见

2.1完善对于本模块进行的整体上的教育教学设计

因为每个模块的内容所反映的都是这个学科一个或者一组的主题与核心概念；既有贯穿前后的一些重要科学思想和方法，也有要学习、探究的相似情境，还有内在的知识逻辑联系等，所以，在教学过程中需要对其进行整体上的考虑设计。整体设计应该注意到的有下面几点：

（1）本模块主要讲解哪些核心的概念，这些概念适合以何种教学策略和方法进行建立？

（2）本模块教学课时如何进行合理分配，哪些需要学生自主学习，哪些要求教师辅导学习，哪些需要老师重点讲解？

（3）本模块中涉及的实验、资料搜集、探究等一系列活动，都需要什么样的设备条件，每一项活动所要收到的学习效果存在着什么样的差别，这些过程和方法学习要求是什么？

（4）本模块学生在学习的过程中必须补充的课程资源有哪些，还有哪些课程资源通过努力是能够被开发和利用的资源？

（5）本模块所涉及的教学内容中哪些问题是要借助集体的智慧进行学习研究的，这些问题的着重点在哪里？

（6）本模块所涉及的教学内容中有哪些是学生比较生疏的，怎样让学生能够有规划地进行学习？

（7）在本模块的教学过程中，我们可以获得哪些方面的经验，如何在理论上进行总结和提炼？

2.2核心的概念及其它们之间的相互关系作为教师教学的重要环节

学生在对于核心概念以及这些概念之间的相互关联的学习时，不应停留在静态的死记硬背，也不能只是孤立地逐个把握每个概念，而应该是一种动态的学习，这就需要学生在自主、探究和合作学习的过程中去形成和建立核心概念及概念之间的相互联系，把重点放在对其的理解和实际应用上，并且要围绕着几个核心问题形成概念“串”。

3、结论

总之，教材的作用不仅是向学生传递知识，同时也要注重对学生进行各种能力，情感态度和价值观的培养。因此，只有对教材的深入分析，弄懂并提取教材内部所传递出的思想方法和能力要求，才有利于培养学生的能力，促进发展。

参考文献：

第4篇：分子生物学分析范文

关键词：桑树；WRKY转录因子；密码子使用偏性；系统进化；生物信息学

0引言

[研究意义]WRKY转录因子家族是仅存于高等植物中的一类锌指蛋白，参与植物的生长发育，能对环境胁迫和病原侵染作出响应。首先，WRKY转录因子蛋白在植物免疫反应中发挥重要作用，是植物免疫系统各通路的中心组件，包括MTI、PTI、ETI、基本防御及系统获得抗性（Birkenbihletal.，2016）。其次，WRKY转录因子在植物的应激反应中也起关键作用，其网络涉及生物和非生物胁迫的各组成部分（Eulgem，2006；Zhuetal.，2013）。WRKY转录因子家族基因过表达能增強植物对盐和干旱胁迫的耐受性，同时增强抗病性（OiuandYu，2009）。此外，WRKY转录因子还在植物种子发芽、衰老及其他发育反应中发挥重要作用（Rushtonetal.，2010；Verweijetal.，2016）。密码子使用偏性是指各种生物体偏爱使用三联密码子（编码相同氨基酸的同义密码子）的现象，普遍存在于生物界中，且物种的亲缘关系越近密码子使用偏性越相似；密码子使用偏性还与基因表达、蛋白质功能等密切相关。因此，研究密码子使用偏性对开展基因进化压力研究、基因表达水平预测及外源基因改良等均具有重要意义。[前人研究进展]WRKY转录因子家族含有60个高度保守的氨基酸WRKY功能域，包含N端的WRKYGQK保守的氨基酸和C端非典型的锌指结构（Rushtonetal.，2010）。根据WRKY结构域数量和锌指结构氨基酸组成的不同，可将WRKY转录因子家族蛋白分为三大类：第1类含有2个WRKY结构域，具有Cys2-His2型（CX46CX22-23HX1H）锌指结构；第Ⅱ类和第Ⅲ类仅含有1个WRKY结构域，其中第Ⅱ类的锌指结构与第1类的类似，第Ⅲ类的锌指结构为Cys2-His-Cys型（CXvCXE3HTC），根据保守氨基酸残基的差异，第Ⅱ类又可分为5个亚类（Eulgemetal.，2000）。至今，已有多种植物WRKY转录因子家族基因被鉴定（Wuetal.，2005；Rossetal.，2007；Lingetal.，2011；HuangetaL，2012；DmgetaL，2015；Songetal，2016；Zhangetal.，2016），并证实WRKY转录因子家族参与植物的多种生理生化过程，包括衰老（zhangetal.，2016）、纤维发育（Dingetal.，2015）、生物和非生物胁迫（Songetal.，2016；Weietal.，2016）等。不同物种或同一物种不同基因问的密码子使用偏性不同，与基因在进化过程中所面对的选择压力不同有关。物种在进化过程中受基因突变压力和自然选择压力的双重影响，但由于二者在基因进化过程中所发挥作用的权重不同，导致密码子使用偏性具有物种特异性（赵洋等，2016；曲俊杰等，2017）。密码子使用偏性与GC含量有关时表示受突变压力影响（Chenetal.，2004），与翻译过程有关时表示受正向选择压力影响（Sharpetal.，2010）。因此，通过优化密码子可提高外源基因在寄主细胞中的表达水平（周宗梁等，2012；Zelaskoetal.，2013）。[本研究切入点]桑树（Morusnotabilis）是一种常见的落叶乔木，其叶片是桑蚕的主要饲料，桑皮可用作造纸原料，桑果可供食用或酿酒，在我国多个省份均有栽培，但目前针对桑树WRKY转录因子基因及其蛋白的研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]在桑树基因组测序工作的基础上，利用生物信息学方法全面预测分析桑树基因组中WRKY转录因子家族结构及其功能特征，为进一步揭示WRKY转录因子家族生物学功能提供科学依据。

1材料与方法

1.1蛋白序列获取与鉴定

桑树全基因组蛋白序列从GenBank数据库中搜索获得，以拟南芥WRKY转录因子蛋白序列为探针，在桑树全基因组蛋白数据库中进行BLASTp同源序列比对分析，通过NCBI在线工具CDD（https：//ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）进行蛋白结构域分析，并剔除无WRKY结构域的蛋白序列。

1.2基因及其蛋白结构分析

从NCBI中获得桑树WRKY转录因子基因序列和CDS序列，使用基因结构显示系统（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）绘制基因结构示意图；通过MEMESUITE（http：//meme-suite.org/tools/meme）預测桑树WRKY转录因子蛋白序列保守氨基酸Motif，参数设为默认值。

1.3基因启动子区特征分析

通过GenBank数据库获取桑树WRKY转录因子家族基因转录起始位点上游的2kb序列，以JASPAR（http：//iaspar.genereg.net/）数据库分析启动子区富含转录调控基序。选择植物启动子基序数据库作为搜索数据库，相对阈值分数选择100%。

1.4蛋白系统进化分析

所有桑树WRKY家族蛋白通过Clustalx进行比对分析，选取WRKY和锌指结构域保守序列，采用MEGA5.0中的NJ（Neighbor-jioining）法构建系统发育进化树，参数选择Bootstrap为1000。系统发育进化树的绘制与优化使用Itol在线工具（http：//itol.embl.de/）完成。

1.5基因密码子使用偏性分析

利用CodonW1.4.4对桑树WRKY转录因子家族基因CDS序列密码子的使用偏性进行分析，包括密码子适应指数（CAI）、有效密码子数（ENC）、密码子第3位GC含量（GC3s）和平均亲水性值（Gravy）等参数。以GC3s为横坐标、ENC为纵坐标绘制ENC-plot图谱。图谱中的曲线为ENC预期值，表示密码子使用偏性仅由碱基组成决定，计算公式为：ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+（1-GC3s）2]。分布点越靠近标准曲线表示密码子使用偏性受碱基突变影响越大，越远离标准曲线表示密码子使用偏性受自然选择影响越大。使用EMBOSSexplorer网站（http：//emboss.toulouse.inra.fr/）在线软件Cusp对同义密码子的相对使用度（Relativesynonymouscodonusage，RSCU）进行分析。

2结果与分析

2.1桑树WRKY转录因子家族成员鉴定及其序列分析结果

基于桑树全基因组蛋白数据库，经BLASTp同源搜索和SMART保守结构域鉴定，共获得55个桑树WRKV～录因子基因（表1），占桑树基因总数（29261）的1.88%。其中，蛋白氨基酸残基数小于300aa的基因序列占24%，介于300-650aa的基因序列占71%，大于650aa的基因序列占5%。

桑树WRKY转录因子家族基因存在6种内含子数量类型（图1）。其中，有27个基因含有2个内含子，为数量最多的类型；有10个基因含有4个内含子；WRKY9基因的内含子数量达14个，为内含子数量最多的类型。桑树WRKY转录因子家族基因内含子相位类型有15种，呈多样性。其中，有25个基因的内含子相位为2-2型，是基因数量最多的类型；有6个基因的内含子相位为2型。进化组Ⅰ和进化组Ⅱc中的基因内含子数量和相位类型较多样，说明组内基因来源较复杂；进化组Ⅱa、进化组Ⅱb、进化组Ⅱd、进化组Ⅱe和进化组Ⅲ中的基因结构和内含子相位类型高度一致，内含子相位为2—2型，可能是由同一祖先基因复制而来。

2.2桑树WRKY家族蛋白的系统进化分析结果

利用MEGA5.05对72个拟南芥WRKY转录因子蛋白和55个桑树WRKY转录因子蛋白的保守结构域序列进行系统进化分析，结果显示，桑树WRKY转录因子蛋白主要分为三大类（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），其中，第Ⅰ类根据WRKY保守结构域处于N端或C端，可分为ⅠN和ⅠC两个亚组；第Ⅱ类根据聚类情况又可分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe等5个亚组（图2）。但MnWRKY49和MnWRKYlC未归入以上分组。

2.3桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析结果

使用MEMESUITE对桑树WRKY转录因子保守氨基酸Motif进行分析，结果发现有五类Moti啪保守性较强，其正则表达式如图3所示。其中，Motif1是WRKYMotif，在桑树WRKY转录因子家族中高度保守；Motif3为进化组IN端的WRKY保守结构域；Motif2为锌指结构，仅MnWRKY28、MnWRKY43和MnWRKY54缺少该结构域。55个WRKY转录因子蛋白均具有Motif1，所有I类基因蛋白均具有Motif1和Motif3。Motif4为未知结构域，Motif5为LXsLXgLX3L基序，类似LRR结构域，进化组I、进化组Ⅱa和进化组Ⅱc的基因蛋白结构包含Motif4，进化组Ⅱa、进化组Ⅱb和进化组Ⅲ的基因蛋白结构包含Motif5。部分桑树WRKY转录因子保守结构域和锌指结构存在变异，如进化组Ⅱc中MnWRKY50和MnWRKY51的保守结构域为WRKYGKK，MnWRKY28和MnWRKY54的锌指结构缺少CX.sCX22.23部分，进化组Ⅲ中MnWRKYl9和MnWRKY23的锌指结构分别为CX7CX23HRC和CX7CX23HIC，保守氨基酸残基发生变异。

2.4桑树WRKY转录因子家族基因启动子区特征分析结果

桑树WRKY转录因子家族基因启动子区均含有PBF结合元件（AAAGC），每个基因启动子平均含有4.8个元件（表2），PBF属于Dof家族C2H2锌指因子类，有助于bZIP转录因子结合DNA（Vicente-Carbaiosaetal.，1997）；另外两种C2H2锌指因子类（DOF2.4和DOF5.3）含量也较高。55个桑树WRKY转录因子家族基因中有28个基因的启动子区含有AHL20结合元件（AATTAAAT），AHLl2与AHL20转录因子均属于拟南芥hook因子，能特异性结合与核基质附着相关且富含AT的DNA序列，通过下调PAMP引发的NH01和FRKl可负调控植物对病原菌的先天性免疫作用（Luetal.，2010）。此外，部分桑树WRKY转录因子家族基因启动子区含有bZIP、ERF、GT-1、MYB、TGA和WRKY转录因子结合序列。

2.5桑树WRKY转录因子家族基因密码子使用偏性分析结果

为了解桑树WRKY转录因子家族基因密码子使用偏性，对ENC、GC3s和Gravy等参数进行分析，结果发现，桑树WRKY转录因子家族基因ENC介于48.00-60.00，GC3s介于0.330-0.722，Gravy均为负值（表3），表明桑树WRKY轉录因子蛋白均为亲水性蛋白，且多数具有强亲水性。

ENC与GC3s的关联分析结果显示，基因分布越靠近ENC-plot图谱标准曲线表示密码子使用受碱基突变压力影响越大，基因分布在标准曲线下方或远离曲线，表示基因受自然选择压力影响越大。GC3s分布则反映植物所受的选择压力，GC3s分布越广泛，表明密码子使用偏性受碱基突变压力越大，GC3s分布范围越小，表明密码子使用偏性受正向选择压力影响越大（KawabeandMivashita，2003）。由图4可知，桑树WRKY转录因子家族基因的GC3s介于0.330-0.722，分布较广泛，且多数基因ENC分布在标准曲线下方，表明桑树WRKY转录因子家族基因同时受到碱基突变和正向选择压力的影响。

RSCU是同义密码子实际使用量与理论使用量的比值。RSCU>1.000，表示密码子使用频率高于其他同义密码子；反之则使用频率低。由表4可知，RSCU>I.000的密码子有29个，且以A（6个）或T（11个）结尾较G（4个）或C（8个）结尾的略多，说明桑树WRKY转录因子家族基因的密码子使用偏性较弱，略偏好A或T结尾。

3讨论

WRKY转录因子蛋白为植物特有转录因子家族，广泛参与植物多种生物学进程的调控。至今，多个已完成基因组测序植物的WRKY转录因子家族基因被鉴定，番茄基因组中有81个WRKY转录因子家族基因（Wuetal.，2005），黄瓜有55个WRKY转录因子家族基因（Rossetal.，2007），大豆有176个WRKY转录因子家族基因（Lingetal.，2011），棉花有113个WRKY转录因子家族基因（Huangetal.，2012），粳稻有98个WRKY转录因子基因（周宗梁等，2012），拟南芥有72个WRKY转录因子家族基因（Zelaskoetal.，2013），苹果有132个WRKY家族基因（谷彦冰等，2015）。Baranwal等（2016）研究发现，桑树基因组中含有54个WRKY转录因子基因。同一家族基因的数量与植物进化过程中基因复制、基因组重排等有关，如水稻、番茄、苹果和棉花的WRKY转录因子家族均存在基因复制现象（Wuetal.，2005；Huangetal.，2012；周宗梁等，2012），但在WRKY转录因子数量较少的黄瓜中未发现基因复制现象（Rossetal.，2007）。WRKY转录因子基因数目除了与物种基因组有关外，还与植物进化过程中所受的环境压力有关。本研究结果显示，桑树WRKY转录因子家族基因数量为55个，属于WRKY转录因子家族基因相对较少的物种类型，说明进化过程中该家族基因受到的环境压力较小。

基因结构中内含子数量及相位类型是研究基因进化的重要证据。根据剪接中位置的不同，内含子分为3种相位类型，0型内含子位于2个密码子之间，1型内含子位于密码子的第1和第2碱基之间，2型内含子位于密码子的第2和第3碱基之间（Sharp，1981）。内含子相位的改变会导致后续阅读框发生变化，因此内含子的相位通常比较保守。本研究中，桑树WRKY家族蛋白主要分为三大类（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），且有2个蛋白（MnWRKY49和MnWRKYlC）未进行分组，与Baranwal等（2016）将桑树WRKY转录因子家族分为四类的研究结果基本一致。本研究还发现，同一进化组的基因结构内含子数量和相位类型高度一致，进化组Ⅱa和进化组Ⅱb的内含子相位类型全部为0型，进化组Ⅱd、进化组Ⅱe和进化组Ⅲ全部为2型。约50%桑树WRKY转录因子家族基因包含2个内含子，其中有25个基因的内含子相位为2-2型，分别属于进化组Ⅱc、进化组Ⅱd、进化组Ⅱe和进化组Ⅲ，推测其来源于共同的祖先基因。

本研究的系统进化分析结果显示，桑树WRKY家族蛋白主要分为三大类，Ⅱ类又分为5个亚组。所有成员均含有保守基序WRKYGQK（MnWRKY50和MnWRKY51为WRKYGKK外），Ⅰ类和Ⅱ类还包含有保守的锌指结构C2H2（除MnWRKY28和Mn-WRKY54缺少外），Ⅲ类的锌指结构为C2HC。Rinerson等（2015）研究认为，植物中WRKY转录因子家族基因存在两种可能的起源方式，一种起源于Ⅰ类蛋白C端WRKY结构域，一种起源于藻类Ⅱa或Ⅱb的某一蛋白结构域。桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析发现有五类Motif的保守性较强，所有桑树WRKY蛋白中均包含C端Motif1，Ⅰ类蛋白同时含有N端Motif3。进化组Ⅱa、进化组Ⅱb和进化组Ⅲ中含有类似LRR结构域的Motif5。可见，植物WRKY转录因子基因家族结构上高度保守，桑树WRKY转录因子可能起源于I类基因蛋白C端WRKY结构域。

WRKY蛋白特异性结合DNA的最小基序TTGAC（C/T）称作W-box。多数WRKY转录因子的目标基因启动子中均含有数量不定的W-box，彼此间或同向排列或形成回文结构，WRKY转录因子与其结合，而调节下游功能基因或其他转录因子的表达（Eulgemetal.，2000）。一些植物WRKY转录因子家族基因启动子中也存在W-box，如拟南芥WRKYl8启动子中的W-box是起负调控作用的顺式作用元件，能阻止拟南芥WRKYl8在抗病期间的过量表达，从而缓解该基因对植物生长造成的影响（ChenandChen，2002）。多种WRKY转录因子可形成复合物以调控植物的抗病性。Baranwal等（2016）研究发现，桑树WRKY基因上游启动子区富含AAAG、GAAAA和AGAAA等序列。本研究也发现桑树WRKY转录因子家族基因启动子区的AAAGC、AAAAAGT和GAAAAAG数量较多，且部分桑树WRKY转录因子家族基因启动子区含有bZIP、ERF、GT-1、MYB、TGA和WRKY转录因子结合序列，而这些转录因子大多与逆境胁迫有关。

桑树WRKY转录因子家族基因同时受碱基突变和正向选择压力的影响，其中以碱基突变选择压力占主导地位。基因密码子使用偏性与植物基因组组成及其所处的胁迫环境有直接关系（宋辉等，2015）。双子叶植物偏好A/T结尾的密码子，单子叶植物偏好G/C结尾的密码子（Tatarinovaetal.，2010），偏性强的基因偏好使用G/C结尾的密码子（Gu0etal.，2007）。桑树属于双子叶植物，虽然RSCU>1.000的密码子中以A/T结尾的略多，但密码子使用偏性并不强，多数属于低表达基因。Baranwal等（2016）研究发现，桑树WRKY转录因子家族基因表达具有器官特异性，在54个WRKY转录因子家族基因中有13个基因在根部表达，25个基因在树皮中表达，10个在雄蕊中表达，但总体来看，检测到的表达基因数目较少，基因相对表达倍数不高。这在本研究中得到进一步证实，即桑树WRKY转录因子家族基因密码子使用偏性较弱。

4结论

第5篇：分子生物学分析范文

关键词：虚拟实验室 分子生物学 虚拟仿真

分子生物学是生命科学领域最重要、最前沿的学科之一。目前已广泛的应用到相关领域及学科中，成为了更加普遍和基础的学科。尤其是与医药、卫生、环境及生物工程等领域联系更为紧密。由于分子生物学越来越广泛的应用，在人才培养方面也面临着更新的挑战和更高的要求。随着分子生物学新技术的不断出现，高校分子生物学的教学创新和改革就成为摆在高校教师面前亟待解决的一个课题。分子生物学是一门注重实验的学科，改革分子生物学的实验教学将成为教学改革的重点。传统的分子生物学实验教学中，是以老师讲解实验原理、步骤，学生分组进行实验，老师从旁指导的教学模式为主。由于实验条件等多方因素的限制，不能够兼顾每一位学生，使得教学效果不够明显，学生对于技术操作印象不深刻，同时也不利于培养学生的创新思维。因此，为了解决上述难题，在分子生物学实验教学中引入虚拟实验室的教学模式尤为重要。虚拟实验室能够很好的辅助实验教学。并且，由于其生动灵活，更容易引起学生的兴趣，从而使教学的效果能够事半功倍。

“虚拟实验室”（virtuall laboratory），亦称为合作实验室（collabo rative laboratory），最早是由美国弗吉尼亚大学（University of Virginia）的威廉・沃尔夫（WilliamWulf）教授在1989年提出的，目的是建立一个计算机网络化的虚拟实验室环境?[1]。虚拟实验室其实就是利用计算机及网络技术，实现对真实条件下的实验室的模拟仿真，借助计算机的虚拟平台构建实验室的情境、实验的步骤、实验仪器等，模仿真实的实验过程，使用户在多种感官上产生身临其境的虚拟仿真技术。基于虚拟实验室的特点和优势，虚拟实验室正在被越来越多的应用到各个学科的实验教学中。

1 高校分子生物学实验教学存在的问题

随着高等教育改革的不断深入，高等院校招生规模增大，学生数量增多，教学中凸显出一些新问题。在分子生物学实验教学中，由于新技术、新仪器的快速更新，相关学科之间互相交叉、互相运用，也同样面临着严峻的考验。目前，在分子生物学实验教学中，主要面临着以下问题：

（1）实验条件有限，不能完全满足教学需要。由于近年来，高校的不断扩招，本科生不断增多，虽然学校也在进行基础设施的建设，但是相比于本科生的数量，实验室的数量还是较少。这种情况下，要完成实验教学，就要尽可能的提高实验室的利用率，实验室常常出现饱和状态，五六个同学一个小组共用一组实验仪器，经常是一个同学动手做实验，其他同学在旁边观摩，有些实验仪器更是需要每个小组轮流使用。分子生物学实验技术日新月异，实验仪器设备发展更新迅速，一些先进的大型仪器也被引进实验室，但是由于价格昂贵，数量很有限，一节实验课下来，了解这些仪器操作方法的学生也只是寥寥，毕业后到了工作岗位或是参加研究生学习时，还要重新参加培训，浪费实验资源。另外，有的实验时间很长，但其中一大半时间都是等待的时间，又不能练习实验技术，既浪费教学时间又不能提高教学效果。

（2）实验教学内容单一，缺乏启发性。分子生物学的实验原理、操作步骤、注意事项等基本上都是按照教科书上安排实施，多是对理论课内容的验证实验，缺乏对实验本身的设计和应用的讲解。很多实验教材已经连续使用了多年，即使换用教材也是同样教材的再版，再版的教材与之前的教材并没有太大的区别，有的甚至干脆没有改动，教材上有的仪器现在实验室已经不再使用，学生完全是按照教材做实验，并没有深刻的思考为什么要做这个实验，更不要说根据已做过的实验的经验和掌握的知识去设计其他的实验。

（3）仪器操作不熟练导致的实验安全问题和仪器的过度损耗。在做实验的时候，因为对仪器的操作不熟练，经常会造成仪器的不必要损坏。例如，低温冷冻离心机，离心时的转数通常都在10000转/分钟以上，操作前需要对待离心样品进行精密的配平，新使用的同学有时会忘记配平，常常不使用天平准确的配平，在这种情况下进行离心将造成离心机曲轴弯曲、转子磨损，离心机将不能使用。这种离心机一般都是进口仪器，价格比较昂贵，维修周期长，费用高，且实验室拥有数量有限，损坏之后会对分子生物学的实验教学和科研产生很大的影响。另外，如果不熟练实验技术，实验中使用到一些有毒有害生物、化学制剂时，也存在不安全的问题。例如，生物染料溴化乙锭（EB）是强诱变剂，用于DNA琼脂糖凝胶电泳的实验，不能触摸，必须佩带防护手套，除了电泳实验台，不能触摸其他实验台，否则将造成交叉污染，危害其他同学的安全。在不熟练实验技术的情况下，很容易手忙脚乱，造成污染，需要教师从旁督促。

2 虚拟实验室用于分子生物学实验教学中的优势

（1）灵活生动，易于扩展。虚拟实验室是基于计算机系统的三维动画技术，它通过丰富的影像、声音营造出生动有趣的学习氛围，不仅能强化记忆，更能激发学生的学习兴趣。虚拟系统中包含了分子生物学实验中的多种仪器和试剂，可供学生实验时选择，不是仅仅准备好本次实验的仪器、试剂，可以使学生更深刻的理解实验的原理。而且，虚拟实验室脱离了时间与空间的限制，每个同学都可以运用自己面前的电脑，充分的利用课堂的时间熟悉掌握实验技术，并且课下也能利用网络学习。互联网方便了我们的生活，同样也为虚拟实验室远程教育打造了平台。

（2）方便交流，资源共享。课堂上教师和同学可以通过局域网进行一对一，或一对多的交流，教学更有针对性，教师也可以设计思考题，控制网络开放，把学生分成小组进行讨论，运用启发式的教学方法培养学生自主思考问题、解决问题的能力。各小组之间各自讨论后，也可以通过网络共享彼此的成果。

（3）安全可靠，利于教学。虚拟实验室能够有效的帮助学生熟练实验操作技术，大大降低误操作的可能性，不仅提高了实验教学的安全性，还能够节省实验资源和教学科研经费。虚拟实验室可以帮助教师更好的设计实验内容，合理的利用教学资源。

3 结束语

虚拟实验室作为一种辅助教学手段，对分子生物学实验教学起到了积极的促进作用，虚拟仿真的情境与实践操作相结合能够提高教学效果，真正培养学生在分子生物学领域的实践与科研能力。但是，必须强调，虚拟实验室是一种辅助手段，在教学中仍要以学生亲自动手实践为主，才能事半功倍，不能本末倒置，喧宾夺主。

参考文献：

[1] 唐明翔，杨艳彬，蒋彩虹.浅谈“虚拟实验室”在高校教学中的应用 [J]. 成都教育学院学报，2006，20（3）：75-78.

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[5] 朱敏，张际平.虚拟实验室及其教学应用[J]. 实验室研究与探索，2006，25（5）：626-628.

第6篇：分子生物学分析范文

关键词：标枪；投掷臂；最后用力；交叉步；优秀运动员

中图分类号：G804.66文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)05-0636-03

文献资料的研究表明，标枪的出手速度是影响标枪远度的主要因素之一，而最大出手速度的70%以上是在最后用力阶段产生的。本文运用生物力学的方法手段，对现阶段我国优秀男子标枪运动员的投掷臂动作进行定量性的研究，目的是进一步了解与改进我国标枪运动员的投掷技术，以期创造更优异的成绩。

1研究对象与方法

1.1研究对象研究对象为参加2004年全国田径锦标赛暨奥运会选拔赛男子标枪比赛的运动员。我们对前十名运动员中8名运动员投出最好成绩时的技术进行了分析。这些运动员均为我国现役运动员，其技术风格和成绩基本代表了我国男子标枪运动的现有水平，运动员的基本情况和成绩见表1。

1.2研究方法

1.2.1文献资料法查阅了近十几年来国内及部分国外有关对标枪技术研究的文献资料为本文提供理论依据，从不同的角度对其中的相关信息进行整理，综合运用体育学科的基本知识和方法，对所研究的问题进行了分析。

1.2.2三维录像解析法采用两台日本产内置电子快门的松下M-9000摄像机，拍摄频率为50格/s，在比赛现场进行了现场定点拍摄，拍摄取景范围从交叉步到标枪出手的整个过程，参赛运动员除1人为左臂投掷外，其他运动员均为右手投掷。利用爱捷运动图像解析系统对录像带进行解析，用三维标准DLT测量，对获得的数据进行低通滤波平滑处理，截断频率为8.0。

1.2.3数理统计法根据研究问题的需要，用SPSS12.0统计软件包对数据进行统计学的分析，从统计学上找到数据间的量化关系，以便对问题进行深入研究。

2结果与分析

根据研究的需要，将交叉步结束右脚着地瞬间至标枪出手瞬间的过程按时序划分时相：右脚着地瞬间；身体重心移过右脚支撑点瞬间；右膝最大缓冲瞬间；右脚拖拉滑动瞬间；左脚着地瞬间和标枪出手瞬间。

2.1对右肩角角度变化的分析在最后用力过程中，躯干与投掷臂的大臂之间形成的夹角是运动员“满弓”动作完成是否充分的主要标志。世界优秀运动员躯干与大臂的最大夹角约为90°［1］。从表2的数据情况来看，我国8名运动员右肩角在右脚着地瞬间平均为80±13°，右脚拖拉滑动瞬间开始增大，到左脚着地瞬间变为88±9°，基本接近世界优秀运动员的水平。从技术的角度讲，自交叉步结束右脚着地瞬间至左脚着地瞬间，右肩角应保持适宜的角度（90°左右）基本不变或适度的增大，这样可以将标枪的姿态角控制在适宜的范围内，保持标枪相对稳定。

结合我国8名运动员掷标枪技术的图片，进一步对个体分析发现，在右脚着地瞬间，8名运动员中，李荣祥、刘彦红、孙世鹏、秦强这4名运动员右肩角基本处在较为适宜的范围内，而他们右脚着地瞬间至左脚着地瞬间基本上没有较大的变化。高文绪右肩角在右脚着地瞬间较为适宜，而侯兴良此时为57°，但此后2人右肩角的变化幅度较大，高文绪从91°上升到102°再下降到98°，侯兴良从57°上升到87°再增至98°。结合技术图片可以看出，右脚着地瞬间，2人身体后倾的幅度较大，在右脚开始拖拉滑动前后，右臂没能更好的继续向左后拉引，右大臂较早的开始持枪上翻，导致右肩角变化较大，标枪的稳定性受到影响。王永光和杨文明右脚着地瞬间右肩角分别为70°和73°，到左脚着地瞬间，分别上升到75°和76°，虽然右肩角变化不大，但2人右肩角相对较小，导致标枪的姿态角较大，这样就很容易造成右大臂形成“降肘”拉枪动作。

2.2对右肘角角度变化的分析在交叉步结束右脚着地至左脚着地阶段，一般要求运动员要尽可能的拉开上体与标枪的距离，这样可以使“超越器械”的动作完成得更充分，保证运动员在一定的时间内对标枪有尽可能长的加速距离，并尽可能的保持这个距离［1］。因此，投掷臂肘部适宜的伸展角度对完成“超越器械”动作和形成“满弓”动作有重要影响。

从表3和表4中的数据可以看出，在右脚着地瞬间，世锦赛选手右肘角平均为(150±12)°，左脚着地瞬间，右肘角平均为(125±14)°。我国8名运动员在右脚着地瞬间右肘角平均为(141±16)°，左脚着地瞬间，右肘角平均为(124±9)°。右脚着地瞬间，我国运动员与世锦赛选手的右肘角，经t检验差异显著（P

从表3和表4的数据中可知，右肘角从右脚着地瞬间至右肘角变为最小时刻瞬间，世锦赛选手平均减小了(58±10)°，我国运动员平均减小了(36±14)°，经t检验二者差异高度显著（P

2.3对投掷臂拉引角的分析从表5的数据可以看出，我国运动员在右脚着地瞬间的拉引角平均为(168±5)°，至左脚着地瞬间减小为(165±8)°，总的趋势是拉引角逐渐减小，只有王永光从右脚着地时的173°上升到178°。

从上面的数据中可以看出，成绩较好的李荣祥、刘彦红、和秦强这3个人在此阶段右肘角相对较大，投掷动作控制的相对较好，向左后的扭转动作比较充分，翻枪动作开始的时机相对较晚。从表5中的数据看，在左脚着地瞬间，这3人投掷臂的拉引角都在160°以下,相对较小，也恰恰说明这一点。而其他5名运动员（包括成绩较好的孙世鹏在内）的拉引角在左脚着地瞬间都在160°以上，同时他们的右肘角也相对较小，说明翻枪动作开始的时机相对较早，向左后的动作不是很充分，缩短了人体对标枪的加速距离和用力距离，影响了投掷效果。

2.4对躯干扭转角的分析躯干的扭转角是髋横轴与肩横轴交叉扭转所形成的夹角，躯干的扭转角度越大，参与用力的肌群被牵拉的长度也就越长，器械离身体也就越远，这样用力的效果也就越好，表现出的技术相对更佳。

从表6可以看出，右脚着地瞬间，世锦赛选手的躯干扭转角平均为(30±10)°，我国运动员平均为(24±8)°，平均相差了近6°，经t检验二者差异显著(P0.05）。在标枪出手瞬间，世锦赛选手躯干扭转角平均减小到(7±4)°，我国运动员平均减小到(4±2)°，二者差异也不显著(P>0.05)。说明我国运动员最后用力阶段应尽量延长人体对标枪的加速距离，而做到这一点的关键是适当增大右脚着地瞬间的躯干扭转角。

在标枪出手瞬间，我国8名运动员中只有3人的右肩超过了右髋，占37.5%，其他5人右肩都在右髋的后面，占62．5%。而8名世锦赛选手中有5名选手的右肩在标枪出手瞬间超过了右髋，占62.5%，说明我国8名运动员中，多数运动员出手时机相对较早，出手动作需要进一步改进。

3结论

1) 交叉步结束右脚着地至标枪出手阶段，我国8名运动员多数右肩角的角度波动较大，导致标枪的姿态角控制不稳，进而影响了尽量施力于标枪纵轴上的用力效果.

2) 交叉步结束右脚着地至标枪出手阶段，我国运动员投掷臂投枪动作的幅度相对较小，对标枪的加速距离有待进一步提高，投掷臂的投枪动作有待进一步改善。

3) 交叉步结束右脚着地至标枪出手阶段，我国运动员翻枪动作开始的时机相对较早，向左后扭转不充分，大大缩短了人体对标枪的加速距离和用力距离。

4) 我国运动员在右脚着地瞬间至左脚着地瞬间，躯干的扭紧程度不够，多数运动员标枪的出手时机相对较早，出手动作需进一步改进。

参考文献：

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第7篇：分子生物学分析范文

磷是动植物体内的必需矿物元素，是继蛋白质和能量之外的第三昂贵的饲料原料［1－4］。准确评定饲料有效磷含量是优化饲料配方、节约饲料资源和节能减排的重要基础和手段［5］。饲料磷生物学效价的评定方法主要有体内法和体外法。体内法试验条件难以控制，重复性差［6］，很难满足实践需求。而体外法具有快速、简便、费用低等优点，各国营养学家都有诸多研究报道。近年来，饲料磷的体外评定技术在国际上越来越受到关注，从而推动了相关研究的快速发展，其中以Zyla等［7］和Liu等［8］所建立的方法应用最为广泛。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室于2009年成功研发一套具有自主知识产权的单胃动物仿生消化系统，并使用该仪器进行饲料原料及饲粮酶水解物总能的评定，但暂未开展仿生消化法测定饲料有效磷的相关研究。本试验利用SDS-Ⅰ仿生消化系统，采用仿生消化法测定猪饲料酶水解总能的操作规程，比较不同截留分子质量和不同来源的透析袋对仿生消化法评定饲料原料干物质和磷体外消化率的影响，为饲料磷生物学效价评定的仿生消化法操作规程的建立提供参考。

1材料与方法

1．1试验材料选用玉米、豆粕、麦麸3种猪常用饲料原料，其磷营养含量如表1所示，粉碎过40目筛后，－20℃储存备用;美国Viskase进口分装截留分子质量分别为14000、7000、3500u的透析袋购自北京经科宏达;美国光谱医学进口分装截留分子质量分别为3500、1000u的透析袋购自上海生工生物。

1．2试验设计试验采用单因素完全随机试验设计，选用美国Viskase截留分子质量分别为14000、7000、3500u以及美国光谱医学截留分子质量分别为3500和1000u的5种透析袋，采用仿生消化法评定猪饲料干物质消化率的操作规程［9］，通过测定消化残渣总磷含量，评定玉米、豆粕、麦麸干物质和磷的体外消化率，每个样品5个重复。

1．3透析袋的处理因美国Viskase透析袋中含有少量硫化物及重金属离子，使用前需进行如下处理:将透析袋剪成25cm左右的小段，在pH8．0的2%碳酸氢钠(NaHCO3)、1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中煮沸10min，然后立刻用去离子水冷却并清洗;再将透析袋放在pH8．0的1mmol/LEDTA的溶液中煮沸10min;待溶液冷却后，透析袋直接浸泡在EDTA溶液中4℃保存。从此时起取用透析袋必须戴手套。透析袋使用前用去离子水冲洗3次，将之清洗干净。美国光谱医学透析袋出厂前已预处理过，基本不含硫化物和重金属离子，使用前只需要用去离子水冲洗3次即可。

1．4缓冲溶液的配制在39℃下配制pH2．0的盐酸溶液作为胃阶段的透析液;配制pH6．44的乙酸－乙酸钠缓冲溶液作为小肠阶段透析液，并加入160×104U青霉素钾防止微生物的生长。

1．5仿生消化系统操作过程仪器使用前，首先使用0．05mol/L的氢氧化钾(KOH)溶液清洗1遍，然后用去离子水清洗2遍，最后排空管道积水，完成清洗过程。在仪器清洗的同时把2个阶段pH分别为2．0和6．44的缓冲溶液放入仿生消化系统的39℃水浴锅中进行预热。与此同时，将处理好的透析袋装入仿生消化管中，并将一端用硅胶塞密封。将称样管中的饲料样品(1．0000±0．0002)g用20mL1475．0U/mL胃蛋白酶(SigmaP7000)溶液(pH2．0、39℃)无损失地转移至透析袋中，并将消化管的另一端也塞上带加酶器的硅胶塞子。把消化管装在仿生消化系统上，连接好消化管道。设置好仪器的消化参数，运行仿生消化系统胃期(消化时间4h)的消化。胃阶段消化结束后，仪器会自动使用小肠期的乙酸－乙酸钠缓冲溶液润洗透析袋30min，调节透析袋内消化液pH为6．44，此时仪器处于暂停待加酶的状态。通过加酶器在每个消化管中加入2mL小肠期模拟消化酶，使消化液中含69．10U/mL胰蛋白酶(Amresco)、8．68U/mL糜蛋白酶(Amresco)、221．43U/mL淀粉酶(Sig-ma)，继续进行小肠期(消化时间16h)消化。待样品消化结束后，取出消化管，按照清洗程序对仪器管道进行清洗。同时用去离子水将透析袋中的消化液和残渣无损失地转移至已恒重(M1)的150mL的烧杯中，在65℃条件下烘至无水痕后，105℃烘至恒重(M2)，测定残渣总磷含量(P2)［10］。

1．6干物质和总磷消化率的计算干物质消化率(DMD，%)=100×［M0×DM0－(M2－M1)］/(M0×DM0);总磷消化率(PD，%)=100×(M0×DM0×P1－P2)/(M0×DM0×P1)。式中，M0:饲料样品重(g);DM0:饲料样品干物质含量(%);M1:烧杯绝干重(g);M2:烧杯+残渣绝干重(g);P1:饲料样品磷含量(%，绝干基础);P2:消化残渣总磷含量(g)。

1．7数据处理数据用SAS8．0的MEANS模块对基本统计量进行分析，按平均值±标准差表示;按单因素完全随机试验设计，采用GLM模块对数据进行方差分析，用Duncan氏法进行多重比较，P＜0．05为显著水平。

2结果

2．1不同截留分子质量的美国Viskase透析袋对猪饲料原料干物质和磷体外消化率的影响由表2可知，采用不同截留分子质量的美国Viskase透析袋，玉米、豆粕、麦麸3种饲料原料的干物质和磷体外消化率测定结果存在显著差异(P＜0．05)。在干物质消化率方面，截留分子质量为3500u的透析袋测得的玉米、豆粕、麦麸消化率与截留分子质量为7000u的透析袋相比，分别降低了15．83%、9．47%、8．51%(P＜0．05);截留分子质量为7000u的透析袋测得玉米、麦麸干物质消化率分别比截留分子质量为14000u的透析袋降低了3．04%和2．08%(P＜0．05)，而豆粕干物质消化率两者之间无显著差异(P＞0．05)。在磷消化率方面，截留分子质量为3500u的透析袋测得的玉米、豆粕、麦麸磷消化率比截留分子质量为7000u的透析袋分别降低了22．97%、18．39%、12．32%(P＜0．05);截留分子质量为7000u的透析袋测得的玉米、豆粕、麦麸磷消化率比截留分子质量为14000u的透析袋分别降低了9．12%、1．56%、4．50%(P＜0．05)。结果表明，在本试验条件下，随着透析袋截留分子质量减小，饲料原料干物质和总磷消化率逐渐降低。

2．2不同截留分子质量的美国光谱医学透析袋对猪饲料原料干物质和磷体外消化率的影响由表3可知，采用不同截留分子质量的美国光谱医学透析袋测得的饲料原料干物质和磷体外消化率存在差异。截留分子质量为1000u的透析袋测得的玉米、麦麸干物质消化率显著低于截留分子质量为3500u的透析袋(P＜0．05)，分别降低1．61%、3．35%，而豆粕干物质消化率无显著差异(P＞0．05)。截留分子质量为1000u的透析袋测得的麦麸磷消化率显著低于截留分子质量为3500u的透析袋(P＜0．05)，降低0．63%;豆粕磷消化率显著高于分子质量为3500u的透析袋(P＜0．05)，升高1．67%;玉米磷消化率之间无显著差异(P＞0．05)。在本试验条件下，美国光谱医学截留分子质量为3500和1000u的透析袋测得的饲料原料干物质和磷体外消化率没有明显的规律性。

2．3不同来源的透析袋对猪饲料原料干物质和磷体外消化率的影响从表4可知，采用相同截留分子质量(3500u)的透析袋，美国Viskase透析袋测得的饲料原料干物质和磷消化率均显著低于美国光谱医学透析袋(P＜0．05)，玉米、豆粕、麦麸干物质消化率分别降低了17．77%、9．74%、10．53%，磷消化率分别降低了27．98%、21．10%、16．97%。在本试验条件下，使用相同截留分子质量的不同来源的透析袋，测得饲料原料干物质和磷消化率存在显著差异(P＜0．05)。

3讨论

3．1不同截留分子质量透析袋对仿生消化法评定猪饲料原料干物质体外消化率的影响透析袋截留分子质量对体外养分消化率的影响较大。Drake等［11］和张铁鹰［12］研究表明，当采用截留分子质量大的透析袋时，粗蛋白质和淀粉的消化率均高于截留分子质量小的透析袋。本试验采用美国Viskase不同截留分子质量的透析袋，利用仿生消化系统测定了玉米、豆粕、麦麸的干物质消化率，结果也表明随着透析袋截留分子质量即孔径的缩小，饲料原料干物质消化率呈现下降的趋势。同时，本试验用美国Viskase截留分子质量为14000u的透析袋测得的干物质消化率显著高于截留分子质量为7000和3500u的透析袋的结果也表明了饲料养分在体外消化条件下大部分仍是以大分子物质的形式存在［12］。而美国光谱医学不同截留分子质量透析袋测得豆粕干物质消化率无显著差异，玉米、麦麸干物质消化率仅相差1．61%、3．35%。且美国光谱医学截留分子质量为3500u的透析袋测得的结果显著高于美国Viskase截留分子质量为3500u的透析袋，而与美国Viskase截留分子质量为14000u的透析袋测定结果接近。理论上透析袋截留分子质量越小，透析袋的孔径越小，可透析到缓冲溶液中的小分子物质越少，因此透析袋截留分子质量越小饲料干物质消化率应该越低。而从本试验结果可知，不同来源的透析袋可能由于本身制作工艺的差别及对试验条件的敏感性，测定结果存在较大差别。对于干物质及蛋白质的体外消化采用何种截留分子质量的透析袋仍存在不同观点。Gauthier1530等［13］认为，在蛋白质的体外消化模拟中，采用截留分子质量为1000u的透析袋较为合理，该透析袋孔径恰好能够使氨基酸和短肽(2～6个氨基酸)通过，与体内吸收的氨基酸和短肽的分子质量大小相当，符合体内消化吸收机理。Drake等［11］、张铁鹰［12］、黄瑞林等［14］及袁旭鹏等［15］关于蛋白质或干物质的体外消化研究中，均认为采用截留分子质量为12000～14000u的透析袋可行。体外模拟消化装置中缺乏将养分水解成可吸收形式的肠肽酶和二糖酶等消化酶，如果采用截留分子质量较小的透析袋，则会将一些在体内可吸收的养分认定为不可吸收成分。结合本试验结果，由于饲料养分在体外消化过程中大部分仍是以大分子物质的形式存在，采用截留分子质量较大(12000～14000u)的透析袋可能更适合于仿生消化法评定饲料原料干物质消化率的要求。

3．2不同截留分子质量透析袋对仿生消化法评定猪饲料原料磷体外消化率的影响与饲料干物质的仿生消化不同，按照仿生法测定饲料干物质消化率的操作规程，磷的体外消化模拟需要通过缩小透析袋孔径以达到无机磷与有机磷的分离，从而预测饲料磷的消化率。植物性饲料中的磷以无机磷和有机磷(主要是植酸磷)2种形式存在。植酸即六磷酸肌醇，是由1分子肌醇和6分子磷酸组合而成，分子式为C6H18O24P6，相对分子质量为660．08。以无机盐形式存在的磷在消化道溶解后可直接被动物吸收利用，而以有机化合物形式存在的磷必须经酶水解释放出无机磷后才能被动物吸收利用［16］。植酸在植物体内一般不以游离形式存在，根据其分子结构，植酸含有12个可解离的质子，这些位点可以与钙、镁、钾、锌、铁等金属离子结合，以复合盐类或单盐的形式存在，此外它还可以与蛋白质、氨基酸、淀粉和脂质等物质上的阳离子基团结合，以植酸复合物的形式存在。本试验采用仿生消化法评定饲料干物质消化率的操作规程，选用不同截留分子质量的美国Viskase、光谱医学透析袋，通过测定消化残渣总磷含量，评定了玉米、豆粕、麦麸磷的体外消化率。结果表明，随着透析袋孔径的缩小，美国Viskase透析袋测得的饲料原料磷消化率逐渐降低，与干物质消化率的变化趋势一致，可见部分植酸磷随着蛋白质、淀粉等消化分解后的小分子物质通过了透析袋。美国Viskase截留分子质量为3500u的透析袋所测得的玉米、豆粕、麦麸磷消化率最低分别为55．46%、55．53%和75．66%。2种截留分子质量(3500和1000u)的美国光谱医学透析袋所测饲料磷消化率存在差异，但消化率最大仅相差1．67%，不排除由于误差原因导致测定结果差异显著。截留分子质量为3500u的美国光谱医学透析袋测得的饲料原料磷消化率显著高于美国Viskase的透析袋。目前市场上销售的美国Viskase透析袋最小截留分子质量为3500u，而光谱医学透析袋可能受本试验的某一条件的影响，测定结果与理论推理相违背。对猪而言，除小麦中磷的利用率可达到约50%外，其他植物性饲料原料磷的利用率在10%到30%［17］。本试验中美国Viskase截留分子质量为3500u的透析袋测得的玉米、豆粕、麦麸总磷消化率最低，分别为55．46%、55．53%和75．66%，最接近于贾刚等［18］及方热军［19］的体内测定结果。而美国Viskase截留分子质量为3500u的透析袋是否能完全截留饲料原料中的有机磷，还需要进一步的研究验证。

第8篇：分子生物学分析范文

长期以来，传统的分析化学只是一门技术科学，它以工业生产和科学实验必不可少的测试手段和方法发挥着它在化学科学中的特殊作用。但是，随着社会的进步，尤其是现代科技的快速发展，人们越来越注意到，分析化学必须更深更广地拓宽它的理论基础才能适应新的发展。这种理论基础不仅限于化学、物理、生物等基础学科，而且涉及一系列交叉、综合和新兴技术学科，如材料、信息、能源及环保、生物工程等。事实证明，几乎这些学科的每一次重大科技成果的引入都对分析化学起到了重大影响。正因如此，分析化学在近五十年来得到了空前发展［1］。例如20世纪40年代中期电子学中光电倍增管的出现促成了原子发射光谱、红外光谱、紫外及可见光谱、X射线荧光光谱等一系列光谱分析的发展;50年代原子物理学的发展使得原子吸收及原子荧光光谱开始兴起;60年代等离子体－傅立叶变换和激光技术的引入出现了电感耦合等离子体－原子发射光谱和傅立叶变换－红外光谱、激光光谱等一系列光谱分析技术，使得光谱分析进入了崭新的阶段。在电分析化学方面，1922年极谱法问世，60年代离子选择性电极、酶电极和微电极伏安技术相继出现并快速发展，以及80年展起来的化学修饰电极、光谱电化学、色谱电化学使得电分析化学从宏观深入到微观，实现了新功能电极体系的分子设计及分子生物学研究。此外，50年代，Martin因发明气相色谱而获得诺贝尔化学奖，60年展的色－质联用技术，70年代崛起的高效液相色谱，80年代出现的超临界流体色谱及90年代急剧发展起来的毛细管区域电泳等都使色谱分析领域充满活力，飞速发展。70年代末到80年代初发展起来的串联质谱，液相色谱－质谱联用技术及软电离技术则使得质谱分析的应用范围扩大到了生物分子并在生命科学研究中发挥了重要作用［3］。

2分析化学的发展趋势

分析化学总是在寻求更灵、更好、更准、更快、更便捷的发展方向和目标，它被分析工作者慨括为“3S+2A”(3S:sensitivity，selectivityandspeediness，2A:accuracyandautomatics)的目标。从分析化学的发展历史和认识论的角度来看，随着科技的进步，分析化学学科必将进一步吸收现代科技进步的最新成果，继续不断发展，并在生产生活和社会实践中扮演更为重要的角色［4，5］。通过和其它相关学科的广泛联系，双向互动，分化交叉，传统界限分明的分支学科的局面最终将会被彻底打破，分析化学最终将会逐渐发展成为一门在社会生产生活中广泛应用的综合学科。有人甚至认为，分析化学将会逐渐发展成为一门一级学科———分析科学或信息科学。

2．1分析化学进一步向高灵敏度方向发展

高灵敏度是各种分析方法长期以来所追求的目标，也是人类对世界认识不断深入的永恒需求。当代分析方法灵敏度的显著提高大都归功于其它学科新技术的引入。例如激光技术的引入，促进了诸如激光共振电离光谱、激光拉曼光谱、激光诱导荧光光谱、激光光热光谱、激光光声光谱和激光质谱的开展，大大提高的灵敏度使得检测单个原子或单个分子成为可能。又如多元配合物、有机显色剂和各种增效试剂的研究与应用，使得吸收光谱、荧光光谱、发光光谱等分析方法的灵敏度和分析性能得到大幅度地提高。可以预见的是，以后其它新技术的发展也必将会进一步推动分析仪器、分析方法的改进和灵敏度的进一步提高。

2．2解决复杂物质和生命体系物质的分离和分析

迄今，人们所认识的化合物已超过1000万种，而且新的化合物仍在快速增长，因而复杂体系的分离和测定已成为分析化学所面临的艰巨任务。此外，自上世纪70年代以来，世界各发达国家都开始将生命科学及其有关的生物工程列为科学研究中最优先发展的领域，欧、美、日等地区和国家启动的具有战略意义的宏大研究规划“尤利卡计划”，“人类基因图”及“人体研究新前沿”中，生物大分子的分离、分析研究都占据重要的位置。21世纪初，人类已经开始进入“后基因组时代”，生命科学领域的复杂组分，尤其是与人类遗传相关的复杂大分子的分离分析开始成为人类一大挑战。由液相色谱、气相色谱、超临界流体色谱和毛细管电泳等所组成的色谱学是现代分离、分析的主要组成部分并获得了很快的发展。目前，以色谱、光谱和质谱技术为基础所开展的各种联用、接口及样品引入技术逐渐成为当今分析化学发展中的热点之一。可以相信，其它相关新技术的发展和引入必将进一步为解决这些复杂体系中物质的分离、分析作出贡献。

2．3分析仪器的微型化及微环境的表征与测定

从简单到复杂，从宏观到微观是人类认识的基本逻辑规律。分析仪器的微型化及微环境分析是现代分析化学认识自然从宏观到微观的延伸。现代电子学、光学、谱学和工程学的微型化发展，使得分析化学深入微观世界的进程得以实现。目前，电子显微技术、电子探针X射线微量分析、激光微探针质谱等微束技术已成为进行微区分析的重要手段。在表面分析方面，电子能谱、次级离子质谱、脉冲激光原子探针等的发展，已经可检测和表征一个单原子层，因而在材料科学、催化剂、生物学、物理学和理论化学研究中占据了重要的位置。现代科技的快速发展必将继续在包括综合多学科优势的微型分析，例如微流控芯片等领域作出重大突破［6］。

2．4实现形态、状态分析及非破坏性检测及遥测

同一元素的不同价态和所生成的不同的有机化合物分子的不同形态在不同环境，如生物体内性质和功能都可能存在极大的差异，在材料科学中物质的晶态、结合态更是影响材料性能的重要因素。此外，在生产流程或生命过程等特殊情况下，对于难于取样的原位分析是十分重要的。利用遥感测定方法，如激光雷达、激光散射和共振荧光、傅里叶变换红外光谱等进行几十公里距离内的气体、某些金属的原子和分子、飞机尾气组成，炼油厂周围大气组成的测定等等，这些也都将是分析化学学科发展的方向之一。

2．5实现分析操作的自动化、智能化

微电子工业、大规模集成电路、微处理器和微型计算机的发展，使分析化学和其它科学与技术一样开始逐渐进入自动化和智能化的阶段。在分析化学中，利用微处理智能系统进行实验设计和和控制，在程序控制下结合相关技术就可以实现自动采样、预处理、分析测试、信号输出和数据处理及分析等过程。这样不仅大大减轻人工操作的工作量，提高工作效率和准确度，还可以实现实时条件下的原位、在线智能监控，这必将对分析化学的发展带来十分深远的影响，而且随着电子技术和控制技术等相关学科的深入发展也将开创分析化学的全新局面。

2．6实现有关人类生活质量和安全的有效保障

随着人类对物质世界的利用和改造能力的逐渐提高，人类逐渐从只为满足生存的基本需要发展到要求满足日益增长的生活质量的需要，进而在保证生存安全的前提下提高生活质量，创造和谐世界。现代科技的快速发展必将推动分析化学更加全面有效的发挥其监测和保障作用。一方面，利用分析化学的手段进行环境中化学过程的跟踪、分析、模拟、预测，可以合理的评价人类各方面的生产、生活活动对环境的影响，为人类生存提供安全的外部环境，创建环境友好型社会;另一方面，要积极应用各种科技发展新成果，发展和完善现代仪器分析新技术、新方法，实现对关乎人类健康的食品、药品、生存环境等各个环节进行全方位的无缝监控和预警，以保证人类的健康和安全。

3分析化学对现代社会的影响及哲学思考

第9篇：分子生物学分析范文

关键词： 蛋白质，质谱分析，应用

前言：

蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上， 作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。

自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。

1．质谱分析的特点

质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

2．质谱分析的方法

近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。

3．蛋白质的质谱分析

蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。

3.1蛋白质的质谱分析原理

以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。

3.2蛋白质和肽的序列分析

现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI TOF MS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一 [5] 。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。

3.3蛋白质的质谱分析方式

质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。

3.3.1蛋白消化

蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。

3.3.2基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS) [7]

简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(peptidemassfin-gerprinting)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便，敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，而且，现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。

3.3.3电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry，ESI-MS)[8 ]

同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连续质量分析仪(tan- demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。

4．蛋白质质谱分析的应用

1981年首先采用FAB双聚焦质谱测定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，质谱中出现准分子离子[M+1]+=1319强峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分析，更大分子量的多肽和蛋自质可用MALDI质谱或ESI质谱分析。用MALDI-TOF质谱分析蛋自质最早一例是Hillen Kramp等[9]于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa蛋白质，精确度开始只有0.5%，后改进到0.1-0.2%。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10，11]，三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[12]；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13]，并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP)的分子结构[15]等。

结束语：

在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。

参考文献

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