分子生物学研究精选(九篇)

前言：一篇好文章的诞生，需要你不断地搜集资料、整理思路，本站小编为你收集了丰富的分子生物学研究主题范文，仅供参考，欢迎阅读并收藏。

第1篇：分子生物学研究范文

关键词：羊草；分子生物学；遗传多样性；组织培养；基因克隆

中图分类号：S543.901　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0289-06

羊草(Leymus chinensis)是多年生禾本科赖草属草本植物，由于其环境适应性较强。具有耐寒、耐旱、耐盐碱等优点而成为松嫩平原的优势物种，同时羊草也是一种重要的牧草资源，蛋白质含量高，适口性好，耐践踏，在发展草原畜牧业方面具有重大的经济和社会效益，但羊草种子发芽率低、种子萌发最适pH值为8.0～8.5，加上过变放牧和草地盐碱化日益加重等原因，我国现存系统管理重点实验室项目(K09M6)羊草草地约有90％以上发生了不同程度的退化，因此，研究羊草的遗传分化、抗逆机理、栽培育种以及转基因等对于改善生态环境和草场建设具有重要意义，随着分子生物学对各个学科的交叉渗透，使羊草的研究从细胞水平进一步深入到分子水平，羊草属于异交植物，物种趋向于在种群中具有较高水平的变异性，仅在松嫩草原中西部靠近内蒙古高原东部草原上的羊草种群就数以千计，这为研究羊草种群的遗传多样性提供了对象，培养愈伤组织是进行羊草转基因研究的前期工作，但诱导率低的问题尚未得到解决，笔者结合自己的科研工作，对羊草分子生物学领域的研究成果加以综述，旨为羊草抗逆分子机理研究提供参考资料。

1　羊草遗传多样性研究

由于羊草生态适应性强、分布范围广、生境类型多样，在长期的适应和进化过程中，羊草种群之间在形态、生理、生态以及遗传特征方面均产生了趋异，RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，随机扩增多态DNA)技术可以在对被检对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析，而且具有费用较低、方便易行、模板DNA用量少、不需要同位素，在安全性和实验操作上具有比AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增酶切片段多态性)、SSR(simple sequence rc-peat，微卫星重复序列)等分子标记更加简便易行等优点，从而使其成为目前研究羊草遗传多样性的最重要的手段之一，该技术主要是利用各种群羊草的总基因组DNA作为模版，筛选能够扩增出具有明显差异性条带的随机引物，以至少两次重复均出现的结果做0，1矩阵图，即有条带记为1，无条带记为0，计算总片段数及多态位点百分率、各种群间遗传相似系数和遗传距离，利用分析软件进行聚类分析从而得到其遗传结构树状图，

羊草RAPD分析可以用于研究羊草的种群关系以及遗传分化的影响因子，崔继哲等应用RAPD技术证明相似生境或同一地域的种群在一些位点上表现出相似或相同的变化，刘惠芬等运用RAPD技术对内蒙古典型草原不同生境8个羊草种群进行分析，聚类结果显示生境相似的种群能够聚在一起，而地理距离最近的种群不一定归为一类，说明小范围内羊草种群间的遗传分化与地理距离不存在相关性，而与其生境间的相似度相关，影响遗传相似性的不是单一因子而是各种因子的综合作用，较小地理范围内羊草种群间的遗传分化主要是由环境的异质性所引起的，笔者曾以采自中国大安碱地生态试验站(N45°36′，E123°53′)的羊草种子单株播种栽培，以每株羊草幼苗的地上部为材料进行RAPD分析，30个实验样品的平均遗传距离为0.1909，共可分为4个类群(待发表)，通过RAPD分析，还可以进一步将羊草遗传分化多样性的原因具体化，汪恩华等””利用分子标记与形态标记以21个有效随机引物中对9份羊草材料进行RAPD分析，对随机抽取的17份禾草种质进行了种质评估的比较研究，结果表明，羊草种质的小穗数、种子千粒重、叶色、有性繁殖量和结实率5个形态学指标与遗传多样性指标存在一定的相关性，应用RAPD技术对不同生境羊草在水分胁迫下游离脯氨酸含量的变化做聚类图比较分析，证实水分是影响羊草种群间遗传变异和生态型分化的一个最主要的因子，虽然水因子是影响羊草分化的一个主导因子，但是在实际研究工作中也认识到羊草变异和分化是多种生态因子综合起作用的结果(如温度、海拔、经纬度、土壤类型等)，而且各因子之间又是相互影响，在不同的生境中限制因子又是变换的，这就造成不同地理种群的羊草遗传分化过程的复杂性，由此可见，目前以羊草为实验材料的RAPD分析虽有许多报道。但是由于羊草本身具有较高的种群变异性。组成羊草群落的植物总计有357种，加之尚缺乏一种统一的标准分型方法，因此RAPD技术就成为研究羊草分类及来源的主要工具，在物种鉴定及遗传分化研究中发挥着重要作用。

除了RAPD技术以外，等位酶技术也可用于羊草遗传多样性分析，等位酶是指由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同，崔继哲等通过该技术，综合分析了松嫩平原11个羊草种群的遗传多样性及遗传分化指标，深入剖析了灰绿型和黄绿型两种叶色类型羊草种群之间的遗传差异，证明种群间的遗传距离与地理距离之间没有相关，崔继哲等还采用淀粉凝胶电泳技术，应用等位酶分析方法测定了松嫩平原南部微生境下羊草灰绿色和黄绿色两种生态型9个种群的遗传多样性和遗传分化程度，证明羊草种、种群和生态型水平都维持较高的遗传多样性，两种生态型之间有明显的遗传多样性差异及遗传分化，另外，对不同生境、不同分类种群的遗传结构分析发现羊草种群遗传变异度很高，但是无论如何归属，松嫩草原上的羊草种群遗传分化程度很低，推测可能与羊草为异花授粉、不同类型混生及种群间基因流强度大有关，刘杰等曾用SSR作为探针构建了羊草的遗传指纹图谱，为羊草种质资源评价、种间及种内亲源关系分析、生物多样性研究提供了有效手段，利用AFLP方法对我国不同地区分布的羊草材料进行的DNA多态性分析结果也表明了羊草基因组DNA具有比较丰富的多态性。

2 羊草愈伤组织培养及利用

植物组织细胞培养(plant tissue and cell cul-ture)是通过运用植物组织细胞培养技术实现植物育种获得新品种的一条快捷途径，既可以通过

花粉培养、未授粉子房以及胚株培养等诱导形成单倍体植物，也可以通过植物愈伤组织培养中普遍存在的染色体变异实现植物突变育种，另外，通过植物组织培养技术进行的植物细胞融合(尤其是原生质体融合)、胚胎培养以及植物体外受精技术可获得远缘杂交种，通过植物组织培养中的茎尖培养能够产生无病毒原种，因而可用于植物脱毒，解决生产实践中植物病毒危害问题，组织培养是植物细胞工程学、遗传学、植物生理学、生物化学与分子生物学研究的重要基础，不仅用于快速繁殖。还用于单倍体育种、种质保存、生理学研究和基因转化等领域。

早在上世纪80年代，高天舜就利用羊草根茎作为外植体进行愈伤组织的诱导和植株再生材料，目的是为了改良羊草的遗传性状，试图通过组织培养途径获得羊草新类型，该研究采用当年生羊草根茎幼嫩部分的节间基部切段以及隔年生老根茎和当年生根茎的芍间中部、顶部切段作为外植体，消毒处理后接种于3种MS培养基中，先进行暗培养。待长出愈伤组织后转入光照培养，诱导率平均在20％左右，分化率最高也只有24.2％，羊草幼穗和成熟种子也可作为诱导愈伤组织的外植体，刘公社等，以幼穗作为外植体，恒温25℃条件下诱导愈伤组织，在加有1mg/L2，4-D MS培养基上继代2次后，转移到含1.0mg/L KT和0.5mg/NAA的MS培养基上分化培养得到再生芽，并在无激素的基本培养基上获得了生根的试管苗，移栽到温室后可正常生长，尽管从羊草叶片、幼穗和成熟胚在同样培养条件下均能诱导出愈伤组织，但只有幼穗愈伤组织能够继续分化出再生植株，但分化率因基因型和外源激素的不同而不同，以成熟羊草种子为外植体诱导愈伤组织具有操作简便、污染程度低、材料选择直观化的优点，且诱导率和幼苗分化率较高、幼苗健壮、生长势好，崔秋华等采用3种培养基(MS、B5和8114)，3种2，4-D的浓度水平(1、2、4 mg/L)培养羊草幼嫩根茎和种子，结果表明，以种子作为外植体可获得较高的愈伤组织诱导率(29.05％)，但目前对于最适激素浓度没有统一结论，其范围从1～4mg/L不等，对愈伤组织的诱导效果也未达到令人满意的水平，仍需要深入研究。

在对羊草愈伤组织的应用方面，可以以羊草种子诱导出的愈伤组织为材料，用含有NaCl的培养基和含有NaHCO3与Na2CO3的混合盐培养基进行培养，测定羊草愈伤组织的耐盐性，结果表明羊草愈伤组织对NaCl最大耐受强度为180mmol/L；对NaHC03与Na2CO3的混合盐的最大耐受强度为4mmol/L中性盐(NaCl)与碱性盐(NaHCO3与Na2CO3)对羊草愈伤组织的胁迫机制明显不同，国内外对于愈伤组织的培养大多应用于转基因，但在羊草方面进行的该项研究却很少，刘公社将携带PAT基因的质粒通过基因枪法转化羊草愈伤组织。然后在筛选培养基上进行培养，筛选抗性愈伤组织并转接到分化培养基上，得到再生苗，然后接种到含有筛选剂的生根培养基上培养后得到转基因羊草小苗，该研究已获得耐除草剂的羊草新品种专利，曲同宝等用基因枪将BADH基因转入由羊草成熟胚诱导出的胚性愈伤组织中，获得了转基因植株，经过PCR检测证明外源基因已整合到羊草基因组中并得以表达，虽然转入羊草的基因都可被检测到已整合人羊草基因组中，而且也得到表达，但是对于转基因羊草对周围生态环境的影响还未见相关报道，筛选突变体是羊草愈伤组织的另一用途，陈晖等用组织培养方法筛选获得羊草抗羟脯氨酸(HYP)变异系HR20-8，该变异系细胞内游离氨基酸和蛋白质组分氨基酸含量均发生了较大的变化，与供体对照比较，分别提高2.35倍和1.40倍，其中，游离脯氨酸和蛋白质组分脯氨酸分别提高6.6倍和3.0倍，且脯氨酸合成途径必需的r-谷氨酸激酶的活性提高了2.5倍。

3 羊草酶蛋白类研究

蛋白质是生物体生命中的第一重要物质，是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，同时能够调控相关基因的表达，植物对抗非生物胁迫必然有蛋白质的参与，比如耐冷蛋白、热休克蛋白、水通道蛋白、赤霉素信号传导蛋白等，从羊草中检测这些蛋白的含量以及克隆表达该蛋白的基因对于研究羊草耐逆分子机理和改善羊草品质都具有重要意义。

目前对于羊草酶蛋白的研究还远远不够，主要有细胞色素氧化酶、过氧化物酶、脂酶同工酶等，其应用也仅局限于阐明羊草的遗传分化，通过聚类分析可以研究羊草种群在不同地理及生态环境中羊草在分子水平上细胞色素氧化酶同工酶存在着种内分化，羊草在同工酶水平上的分化受多个环境因子的综合影响，而且与羊草耐寒性能存在一定的内在联系，张丽萍等对采自同一天然草地上叶片呈黄绿色、灰绿色两种类型羊草的根、茎、叶的过氧化物同工酶、脂酶同工酶进行了分析比较，结果表明，两种叶色羊草，其相同组织的过氧化物同工酶谱及脂酶同工酶谱基本一致，两种羊草叶片呈现不同颜色只属不同生态型，

磁场处理不仅可以促进羊草的生长。而且还能提高羊草的抗盐碱性，磁场使羊草过氧化物酶(POD)活性提高，并且诱发了一条新的同工酶带，张卫东等认为羊草自交不孕的原因是自交不亲和。并利用禾本科植物自交不亲和性有关的硫氧还蛋白(thsioredoxin)^基因设计的引物在羊草DNA中检测到预期片段，说明硫氧还蛋白h基因可能与羊草的自交不亲和性有关，该基因现已被克隆并能够从GenBank中查到其序列。

研究羊草草原土壤酶的活性可以判断土壤的肥力，土壤肥力水平接近则土壤酶的活性相似，土壤蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶的活性与土壤有机碳、全氮呈显著相关关系，可以反映土壤肥力水平高低，是评价土壤退化的重要指标。

4 羊草耐逆基因的分离与克隆

羊草具有耐寒、耐旱、耐盐碱的特性，并且蛋白质含量较高，说明羊草在面对非生物胁迫时高效表达能够适应、缓解或对抗相应逆境条件的物质，尤其是调控这些物质表达的酶类基因，据报道，羊草种子个体萌发期最大忍受pH范围是9.14-9.53，对于NaCl可耐受的最大强度为600mmol/L，对于Na2C03可耐受的最大强度为175mmol/L，为了弄清这种适应机制的复杂性，通过大规模的cDNA克隆或者表达序列标签(EST)的测序分离相关基因是非常重要的，Jin等采集自然生长的植物叶组织经过Na2CO3胁迫处理构建了cDNA文库，并对其EST进行测序对比分析，推断在羊草叶和根中各有39和31个非生物胁迫相关基因，这些EST资源将有助于对植物耐盐碱分子基础的深入研究和理解。

甜菜碱是在生物体内起着渗透保护作用最主要的细胞相溶性物质，编码决定该物质合成的关键酶一甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因已经先后从多种生物体内得到克隆，并在多种植物中进行了遗传转化。已获得了抗盐、抗寒、耐旱能力得到较大程度提高的转基因植株，某些植物体内的甜菜碱含量和BADH活性随着土壤盐碱化程度的加重而增加，因此推测甜菜碱可能与羊草耐盐碱性有关，目前羊草中的部分BADH基因片段也已经被成功克隆。

5　问题与展望

第2篇：分子生物学研究范文

Abstract: The animal protects own one driving way to ambient temperature's adaptation, displays in the duplication and the expression pattern change of the cell and presents the new gene open and the new protein factor synthesis. The gene level, the protein level, the cell membrane level and so on three aspects has carried on the summary about the research survey of animal which adapts to the ambient temperature, and discussed the molecular biology mechanism as well as in evolution significance which animal adapts to the ambient temperature.

关键词： 动物；温度；基因；蛋白质；细胞膜

Key words: animal；temperature；gene；protein；cell membrane

中图分类号：Q291文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2011）25-0324-02

0 引言

动物的一切生命活动（生长、发育和生殖等）都是在一定的环境温度中进行的。一般说来，变温动物生长发育所要求的温度条件在 6-36℃范围内；恒温动物由于自身有调节体温的能力，对环境温度的适应范围广些[1]。当环境温度在最低和最适温度之间时，动物体内的生理生化反应会随着温度的升高而加快，代谢活动加强，从而加快生长发育速度；当温度高于最适温度后，参与生理生化反应的酶系统受到影响，代谢活动受阻，势必影响到动物正常的生长发育。环境温度若超出动物所要求的范围，动物的生命活动就会出现停滞；温度过高或过低会导致动物体死亡[2]。近年来关于动物对外界环境温度适应的分子生物学研究主要集中在基因水平、蛋白质水平和细胞膜水平三个方面。

1 基因水平上的温度

动物对环境温度的适应，会使自身的细胞内转录和表达模式发成变化，以适合环境的变化，此时它会出现新的基因开放和新蛋白因子的合成，这总的来说是动物对自身的一种保护方式。

外界环境温度的改变可以诱导动物体内热激蛋白家族基因的大量表达，从而调整动物有机体对外界环境温度的适应。

尽管热激蛋白家族基因序列保守，编码序列变异较低，但是，由于目前动物种类逐渐增多，热激蛋白基因序列和拷贝数等也在逐步显示出不同的趋势。

适应不同温度的果蝇居群，其热激蛋白70基因内存在两个显著的差异[4]，一个大的插入/缺失（indel）多态位点（56H8/122）和一个单核苷酸多态位点差异；对于来自澳大利亚东部不同纬度的11个居群，插入/缺失位点的频率与纬度呈正相关，由于纬度与温度最大（小）值和平均值呈负相关，提示温度和热值变化可能对Hsp70基因的这一变异频率产生了影响，Anderson[5]等也发现黑腹果蝇3号染色体右臂上hsr-omega基因的8bp缺失作为一个遗传标记与纬度及最高温（最热月）呈正相关，另一个3端重复的标记则多出现于温带群体中，与冷适应性相关。适应于较低纬度的Drosophila lummei有7个Hsp70基因拷贝，其热胁迫抗性高于具有5个拷贝的Drosophila lummei，后者在分布上处于较高的纬度，提示Hsp70基因结构与果蝇的适应纬度有相关性[6]。

果蝇体内一个名为“DmDG”的基因活性一旦下降，果蝇就会“怕热”，从而喜欢向温度更低的地方转移，其喜好的环境温度要比正常情况下低5摄氏度[7]。“DmDG”基因可能与果蝇的代谢功能相关。这个基因活性下降后，果蝇体内能量代谢就会活跃，于是就会更喜欢低温环境。动物体内利用基因调节温度适应性的机制普遍存在，这可以使动物适应很大的温度变化。

克隆斑潜蝇（Liriomyza sativae）3种小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8和Hsp21.7）和2种Hsp60（TCP1α，TCP1ζ），定量PCR分析表明，3种小分子Hsp均能被低温所诱导表达，而且Hsp20.8对低温更敏感，这意味着不同的小分子Hsp可能响应不同强度的低温胁迫。6种Hsp基因（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7、TCP1α、TCP1ζ和Hsp90）的相对表达量在不同生长发育阶段差异显著。总的表达趋势是：小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7）在蛹期表达量最高，而大分子Hsp（TCP1α、TCP1ζ、Hsp90）的表达量则随着生长发育而递增[8]。这意味着除响应温度胁迫外，热激蛋白基因可能还在昆虫的生长发育中起着一定的作用。

2 蛋白质水平上的温度适应

热激蛋白（Hsps）是生物适应环境温度变化的一个重要媒介分子。受到热胁迫刺激后，动物有机体对热的胁迫抗性提高与热激蛋白表达量普遍成正相关[9]。

热激蛋白存在于所有动物细胞中，是动物受到应激原刺激后诱导产生的一组应激蛋白，与机体的应激关系密切，在进化上高度保守。对滞育的吉普赛蛾（Lymantria dispar）幼虫给以37-41℃的热激可以诱发合成7种Hsps（分子量分别为90，75，73，60，42，29和22ku），-10--20℃的冷休克导致其产生2种Hsps（90和75ku），当在25℃下恢复时另外又合成分子量29ku的热激蛋白[10]。斑马鱼在热胁迫（28-37℃）和冷胁迫（20-28℃）下的热激蛋白表达模式存在差异，在热胁迫条件下，Hsp70呈上调表达，而冷胁迫下Hsp70则显稳定表达[11]。将新月鱼的成纤维细胞系的培养温度从28℃调节到37℃时诱导产生3种不同的热休克蛋白[12]。

较缓和的高温对B型烟粉虱Hsp70表达具有诱导作用，极端高温会抑制Hsp70表达。在37-41℃范围内，Hsp70的表达量随着温度的升高而升高，在41℃时达到最高峰；当温度升高到43℃和45℃，B型烟粉虱Hsp70的表达量迅速降低。B型烟粉虱温室种群体内的Hsp70表达量与温室内的温度有关：上午到中午随着气温的升高，B型烟粉虱体内Hsp70表达量随之上升；傍晚气温降低时，Hsp70表达量也随之下降[13]。Kimura（1998）比较过3个果蝇近缘种热休克蛋白基因的表达情况，发现在冷激条件下，亚热带低海拔种（Drosophila watanabe）诱导热休克蛋白表达的阈温度要比温带种（D．traurara）和亚热带高海拔种（D．trapezifrons）高，而亚热带低海拔种的耐寒性却最低，说明在果蝇中热休克蛋白基因表达和耐寒性呈负相关[14]。Sorensen et al（2001）研究果蝇（D．huzzatii）不同自然种群间HSP70基因表达后，发现在冷激下寒温带种群诱导热休克蛋白基因表达的阈温度要明显低于热带种群[15]。

3 细胞膜水平上的温度适应

在正常生理温度下，细胞膜的主动运输、酶的活性、胞外分泌等机能才能正常进行[16]。细胞的膜脂在不同温度下具有不同的酰基链和链长度[16]。细胞膜化学成分改变可能是对温度适应的最普遍模式[16]。低温通过影响细胞膜的流动性而影响细胞正常的机能，对低温的适应不可避免地会涉及到细胞膜化学成分的改变。胆固醇能够促使细胞膜结构的有序化，从而增加细胞膜的流动性。鱼类通过改变脂肪酸中不饱和成分含量和极性磷脂头部组分，减少细胞膜中甾醇/磷脂比率来改变膜的流动性使鱼类更加适应寒冷的外界环境[17]。通过对不同温度适应下虹鳟鱼（rainbow trout）的肝、肾、腮等组织细胞细胞膜中胆固醇（C）与磷脂（P）含量的研究发现，5℃适应组细胞膜的C/P 值显著低于20℃适应组[3]。把鱼体暴露于低温下会导致的极性磷脂中非饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比例增高，有利于在低温下维持细胞膜流动性，使鱼体更能抵抗低温损害[18]。低温还诱导细胞脂肪酸氧化酶的生成，由于它可以提高细胞膜中不饱和脂肪酸的含量，从而提高了细胞膜在低温条件下的流动性[19]。

在动物对温度的适应过程中，动物细胞还通过膜上各种离子通道数量及分布的改变使细胞内离子的成分和浓度发生相应的改变。研究表明，在北极生活的两种鱼类：Trematomus bernacchii和Trematomus newnesi在适应较高温度过程中，腮和肾等渗透压调节器官细胞膜上的Na/K+-ATP酶活性升高，将细胞内钠的、氯离子快速泵出体外，从而使得血清中渗透压明显降低，与海水间的渗透压差增大。研究结果表明，在冷环境中，鱼类靠升高体液离子浓度及渗透压来缩小与外界海水之间的差异，从而减少能量损耗[3]。鸭子对冷适应表现为肌浆网或内质网上Ca2+-ATPase活性及Ca2+释放通道数量上的改变时相与非寒颤产热的发生相一致[20]。

参考文献：

[1]林育真.生态学[M].北京:科学出版社，2004.

[2]孙儒泳.动物生态学原理[M].北京:北京师范大学出版社，2001.

[3]葛伟文，王之贤.温度适应的分子生物学机制[J].生理科学进展，1997， 28（3）：268-270.

[4]Bettencourt B R，I Kim，A A Hoffmann，et al. Response to natural and laboratory selection at the Drosophila hsp70 genes[J]. Evolution，2002，56（9）:1796-1801.

[5]Anderson A R，Collinge J E，Hoffmann A A，et al. Thermal tolerance trade-offs associated with the right arm of chromosome 3 and marked by the hsr-omega gene in Drosophila melanogaster[J].Heredity，2003，90（2）:195-202.

[6]Evgen'ev M B，Zatsepina O G，Garbuz D G，et al. Evolution and arrangement of the hsp70 gene cluster in two closely-related species of the virilis group of Drosophila[J].Chromosoma，2004，113（5）:223-232.

[7]Ken-ichi T，Yoshiro N，Utako K，et al. Changes in Temperature Preferences and Energy Homeostasis in Dystroglycan Mutants[J]. Sciense，2009，323:1740-1743.

[8]Li H H，Chen Z W，Le K. Cloning and expression of five heat shock protein genes in relation to cold hardening and development in the leafminer，Liriomyza sativa[J]. Journal of Insect Physiology，2009，55（3）:279-285.

[9]陈亚琼，肖调江，周浙昆.热激蛋白与生物环境适应及进化的关系[J].自然科学进展，2006，16（9）:1066-1073.

[10]Yocum G D，Joplin K H，Denlinger D L. Expression of heat shock proteins in response to high and low temperature extremes in diapausing pharate larva of the gypsy moth，Lymantria dispar [J]. Arch Insect Biochem Physiol，1992，18:239-249.

[11]Airaksinen S，Jokilehto T，Rabergh C M I，et al. Heat-and cold-inducible regulation of HSP70 expression in zebra- fish ZF4 cells[J]. Comparative Biochemistry and Physio- logy-B Biochemistry and Molecular Biology，2003，136（2）:275-282.

[12]Yatnasaki M，Tajitna M，Lee K W，et al. Molecular cloning and phylogenetic analysis of Babesia gibsoni heat shock protein 70[J]. Veterinary Parasitology，2002，110（1-2）:123-129.

[13]崔旭红.B型烟粉虱和温室粉虱热胁迫适应性及其分子生态机制[D]. 中国农业科学院，2007.

[14]Kimura R H，Choudary P V，Sehinid C W. Silk worm Bml SNIE increase following cellular insults[J]. Nucleic Acids Res，1999，27:3380-3387.

[15]Sorensen J G，Dahlgaard J，Loeschcke V. Genetic variation in thermal tolerance among natural populations of Drosophila buzzatii:Down regulation of Hsp70 expression and variation in heat stress resistance traits[J].Functional Ecology，2001，15:289-296.

[16]Hazel J R. Thermal adaptation in biological membranes: is homeoviscous adaptation the explanation [J]. Ann Rev Physiol，1995，57:19-42.

[17]Farkas T，Fodor E，Kitajka K，et al. Response of fish membranes to environmental temperature[J]. Aquaculture Research，2001，32:645-655.

[18]Jobling M，Bendiksen E A. Dietary lipids and temperature interact to influence tissue fatty acid compositions of Atlantic salmon，Salmo Salar L. parr [J]. Aquculture Research，2003，34:1423-1441.

第3篇：分子生物学研究范文

关键词：钾离子通道；结构；基因

离子通道(ion channe1)是跨膜蛋白，每个蛋白分子能以高达l08个／秒的速度进行离子的被动跨膜运输，离子在跨膜电化学势梯度的作用下进行的运输，不需要加入任何的自由能。一般来讲，离子通道具有两个显著特征：

一是离子通道是门控的，即离子通道的活性由通道开或关两种构象所调节，并通过开关应答相应的信号。根据门控机制，离子通道可分为电压门控、配体门控、压力激活离子通道。

二是通道对离子的选择性，离子通道对被转运离子的大小与电荷都有高度的选择性。根据通道可通过的不同离子，可将离子通道分为钾离子(potassium ion，k )通道、钠离子(natrium ion，na )通道、钙离子(calcium ion，ca2 )通道等。其中，k 通道是种类最多、家族最为多样化的离子通道，根据其对电势依赖性及离子流方向的不同，可把k 通道分为两类：①内向整流型k 通道(inward rectifier k channel；kin)，② 外向整流型k 通道(outward rectifier khannel；k out)。k 是植物细胞中含量最为丰富的阳离子，也是植物生长发育所必需的唯一的一价阳离子，它在植物生长发育过程中起着重要的作用，具有重要的生理功能。植物中可能存在k 通道，这一点早在20世纪6o年代植物营养学界就有人提出，而一直到80年代才被schroeder等人[23证实，他们利用膜片钳(patch chmp)技术，首先在蚕豆(v／c／afaba)的保卫细胞中检测出了k 通道钾离子通道的结构单个钾离子通道是同源四聚体，4个亚基(subunit)对称的围成一个传导离子的中央孔道(pore)，恰好让单个k 通过。对于不同的家族，4"亚基有不同数目的跨膜链(membrane。span。ning element)组成。两个跨膜链与它们之间的p回环(pore helix loop)是k 通道结构的标志2tm／p)，不同家族的k 通道都有这样一个结目前从植物体中发现的k 通道几乎全是电压门控型的，如保卫细胞中的k 外向整流通道等，其结构模型如图2一a所示。离子通透过程中离子的选择性主要发生在狭窄的选择性过滤器(selectivity filter)中(图2一b)，x射线晶体学显示选择性过滤器长1．2 nill，孔径约nill，k钾离子通道的作用.有关k 通道在植物体内的作用研究并不多。

从目前的结果来看，认为主要是与k 吸收和细胞中的信号传递(尤其是保卫细胞)有关。小麦根细胞中过极化激活的选择性内流k 通道的表观平衡常数km值为8．8 mmol／l，与通常的低亲和吸收系统km值相似[ 。近年来，大量k 通道基因的研究表明，k 通道是植物吸收转运钾离子的重要途径之一。保卫细胞中气孔的开闭与其液泡中的k 浓度有密切关系。质膜去极化激活的k 外向整流通道引起k 外流，胞质膨压降低，导致气孔的关闭。相反，质膜上h．atpase激活的超极化(hyperpolarization)促使内向整流钾离子通道(k in)的打开，引起k 的内流，最终导致气孔的张开钾离子通道相关基因及其功能特征迄今，已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离得到多种k 通道基因(图3)，根据对其结构功能和dna序列的分析，可以把它们分为5个大组：工，ⅱ，ⅳ组基因属于内向整流型通道；m组属于弱内向整流型通道(weakly inwardakt1arabidopsis k transporter 1)是第一个克隆到的植物k 通道基因，采用酵母双突变体互补法从拟南芥cdna文库中筛选出来cdna序列分析表明，akt1长2 649 bp，其中的阅读框为2 517 bp，编码838个氨基酸残基组成的多肽，相对分子质量约为95 400 da。akt1编码的k 通道，对k 有极高的选择性，其选择性依次是k >rb >>na >li 。

northern blot分析表明，akt1组织特异性较强，主要在根组织中表达zmk1(zea mays k channel 1)是从玉米胚芽鞘中分离出的k 通道基因，在皮层表达。在卵母细胞中的表达表明，zmk1编码的k 通道是通过外部酸化激活的。有研究表明，蓝光对zmk1通道在玉米胚芽鞘中的分布有一定影响[3 2l。1组kat1组基因编码内向整流钾离子通道，其与akt1组基因产物结构上的最大区别是在cooh端没有锚蛋白相关区(枷n—related do—main，anky)。kat1组基因主要包括kat1，kst1，sirk，kzm1，kpt1等。kat1(arabidopsis inward rectifier k channel1)是与akt1同时从拟南芥cdna文库中筛选出来的植物k 通道基因。kat1基因的阅读框含有2 031个核苷酸，编码的多肽由677个氨基酸残基组成，相分子质量约为78 000 da。kat1的表达具有组织特异性，kat1在拟南芥植株中的主要表达部位是保卫细胞，在根和茎中也有少量的表达。人们认为kat1通道可能参与了气孔开放，并向维管组织中转运k ，而不是直接从土壤中吸收kj。

以kat1为探针，又能从拟南芥cdna文库中筛选出kat2等功能类似的内向整流型k 通道基因通过基因工程技术，人们已相继开展了将kati和akti基因导人到拟南芥、烟草和水稻的研究，并获得了一些转基因植株。比如，施卫明等利用根癌农杆菌介导法已成功地把kat1和akt1导人拟南芥和野生型烟草中，并获得了转基因植株及其纯合株系，发现转基因植株的吸钾速率和对k 的累积能力都比对照的有明显的提高，而且，经过分子检测，也证实711和akt1基因在转基因植株中得到了整合和表达。因此，运用现代分子生物学手段和基因工程技术筛选高效利用钾的作物品种或利用现有的钾离子通道基因改良作物品种，从而提高作物本身的钾吸收利用能力应该是目前主要的研究方向。可以相信，随着分子生物学技术、基因工程技术和有关分析测试技术的发展和应用。随着研究工作的不断深入，有关钾离子通道基因的分离、克隆和利用会取得更大的进展。

参考文献：

1.j langer k，ache p，geiger d，et a1．polar potassiumⅱalispclnerscapable of controlling khomec~tasis and k 一dependent圳0gm—esisljj，theplant journal，2oo2，32：997—1009．

2 .schroeder ji，hedrich r．potassium-selective single channels inguard cell protoplasts of vicia ba[j]．nature，1984，312：361— 363．

3 . jacqueline mg，declan ad．potassium channel structures：do theycomform[j]．current opinion in structural biology，20o4，14：440—446．

4 . mackinnon r，zhou yf．the occupancy of ions in the k selec—tivity filter：ch~se balance and coupling of ion binding to a proteinconformational change undedie hish conduction rates[j]．jmb，2003，333：965—975．

5. mackinnon r，zhou m．a mutant kcsa k channel with alteredconduction properties and selectivity filter ion distribution[j]．jmb，2o04，338：839—846．

第4篇：分子生物学研究范文

关键词:研究生培养;分子生物学;实验教学

分子生物学是从分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学,是当前生命科学中发展最快并与其他学科交叉渗透最广泛的前沿学科之一.进入21世纪,分子生物学的实验技术与方法已经应用到了生物学各个分支学科的研究中[1].研究生教育是培养具有科学精神和创新能力高层次人才的主要方式,培养硕士研究生创新思维和科学研究能力,将是作为研究生阶段的研究工作和将来作为科研人员所必备的素质.近年来,很多高校在研究生的培养上采取了重大举措,如浙江大学、中国科技大学、西安交通大学、中国农业大学等,实现了研究生的理论教学、实验教学和学位论文研究三阶段的培养模式[2].在加强研究生理论教学和学位论文研究的同时,注重研究生实践能力的培养,增加了实验教学环节,实现研究生实践能力的宽领域培养,再通过学位论文的研究,形成研究生实践能力的立体全方位培养.作为一个生物学研究生,把本科所学的基础知识与科学研究的最新进展联系起来,学好、学通分子生物学是必需的一步.基于此,2012年起我校在生物学科研究生学位课中设置“分子生物学实验”课,3年来虽然取得了明显的成效,得到了研究生与指导教师的认可,但在实际运行过程中也发现了一些问题,还需要通过不断的改革和实践,使生物学科的研究生更系统、更全面地掌握分子生物学的实验技术和技能,为后续的研究性实验工作和今后走上工作岗位提高科研水平打好一个坚实的基础.

1课程定位及理念

分子生物学在20世纪取得了理论和技术的飞速发展.分子生物学技术越来越广泛地应用于生命科学的各个研究领域当中.随着越来越多的理论突破,分子生物学技术也日新月异.在高等院校的生物相关学科的研究生教学中,越来越广泛地注重分子生物学的教学.分子生物学理论课教学内容多,范围广,有一定深度,学生很难透彻理解和掌握,如果不做实验,只学习理论,往往会事倍功半,理不出头绪.分子生物学实验课能给学生亲自动手参与实验全过程的机会,便于学生加深对相关理论的理解[3].研究生来自不同的院校,由于各院校课程设置不同,研究生接受的本科阶段的教育差别很大,这种差别在实验操作能力上体现最为明显.对于已经进入分子时代的生命科学来说,不熟练分子生物学实验操作的学生就很难快速适应课题研究的科研工作.在研究生学位课中设置分子生物学实验课,合理安排实验课内容,建立常规操作与科研课题相结合的实验课程体系,是提升研究生实践能力的重要途径,同时也能为学生完成硕士学位论文及将来从事科研工作打下良好基础.内蒙古科技大学生物学硕士研究生学位点于2006年经批准设立,2007年起招收首批硕士研究生,近10年来,已为及全国输送了一批从事生物学研究与开发的优秀人才.“加强专业技术教学、紧跟学科发展前沿、全面提升研究生培养质量”一直是本学科研究生培养工作的重点和目标.为适应新形势下高等院校研究生教育与创新型人才培养的目标,对研究生分子生物学教学的改革势在必行.2012年以来,我们通过在研究生学位课中设置“分子生物学实验”课,不仅显著地提高了研究生对分子生物学课程的学习热情,而且明显提升了研究生的科研能力.

2课程建设及特色

2．1课程建设的过程与方法

每学年的秋学期初新录取的研究生入学,根据对新生分子生物学知识背景和实验动手能力的详细调研合理安排实验课内容,建立常规操作与科研课题相结合的实验课程体系,并根据学科发展不断更新和完善,力求促进研究生科研工作的顺利开展.研究生分子生物学实验教学的改革分为3个阶段进行.

2．1．1准备阶段

组织相关人员成立课题小组,对小组人员进行具体分工,以2015年新入学的硕士研究生为研究对象,采用问卷调查方式对他们的分子生物学基础知识与实验操作能力进行摸底,撰写调查报告[4].

2．1．2实施阶段

(1)制定教学大纲.根据准备阶段的调查结果讨论研究生分子生物学实验课教学大纲,实验项目实行多层次、模块化管理,分为基础性、综合设计性、创新性3个模块.基础性实验项目以基本的分子生物学操作技术为主,如:质粒DNA的提取、限制性内切酶酶切DNA分子、琼脂糖凝胶电泳分离DN段、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组DNA分子的构建与转化等、PCR扩增目的基因等.对没有任何分子生物学常规操作基础的研究生要逐个开出;对本科阶段已经接触并熟悉这些基础性实验的研究生可直接开出综合设计性实验,如:多种方法获得目的基因、动植物中某关键基因的克隆、重组质粒的构建等.创新性实验项目全部由本学科教师承担的科研课题转化而来,研究生可根据自己的研究方向与兴趣爱好选择项目完成,包括植物细胞中MYB类转录因子的筛选、与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆等.

(2)学生选课.将全部实验教学内容及具体开出安排提前公布,学生根据实际情况与自己的研究方向进行实验内容的选择,这一环节须由指导教师协助完成.选课结束后根据每个项目的选课情况准备实验,包括学生分组、准备实验材料、仪器设备、耗材试剂和实验讲义与实验报告册分发等.

(3)预实验.指导教师根据学生分组情况,每组安排组长一名,副组长一名,在实验开出前协助指导教师完成预实验.

(4)实验课开出.按计划认真组织研究生开出实验.实验操作阶段,要求学生熟练掌握实验操作流程,严格按规范进行操作.同时指导教师要充分调动学生的学习积极性和主动性,增强学生独立完成实验的能力和实际动手能力,使学生能够尽可能主动地、独立地完成实验的整个过程,为以后独立从事科研设计和科学实验打下良好的基础.

(5)课程考核.实验课结束后进行成绩考核,综合学生的预习报告、实验操作、实验结果与实验报告撰写情况给出实验课成绩.

(6)编写研究生实验教材.基于教学实践的积累,编写研究生实验教材“研究生现代分子生物学实验”,重点面向研究生的实验教学,将分子生物学基本实验技术和近年来发展起来的新技术、新方法有机融合.

2．1．3总结阶段

跟踪调查,了解研究生在分子生物学实验课结束进入课题研究后的情况,掌握他们在分子操作各个环节上的操作熟练程度,对取得的研究资料做全面的整理分析.在学科内部推出“研究生分子生物学实验”示范课,并完成相应的资料库与光盘制作,并进一步在全校范围内推广.同时课程改革小组的成员要不断讨论项目实施过程中存在的问题,并及时与兄弟院校沟通学习,提出切实可行的办法[5].

2．2指导教师队伍建设

自2012年生物学科硕士研究生开设分子生物学实验课以来,该课程的教学任务一直由我校外聘的留美分子生物学专家王建英教授负责,另配2名讲师作为助手.经过3年来的教学实践体会,加上学生与研究生导师的意见反馈,我们发现这种单一的指导教师模式是需要改进的,需要建设一支由长期工作在科研、教学一线教师组成的研究生实验课教学团队.教学任务分配上,根据团队内每位教师主要从事的科研领域和专业特长,分配相应的实验教学内容,每个项目安排2名指导教师,他们不仅熟悉所指导实验的技术要点,及时解决实验过程中出现的各种问题,还能将本领域相关的科研前沿、热点问题介绍给学生,以开阔学生视野,使每次实验均能获得预期结果.同时,指导教师在教学实践过程中也不断发现和审视自己,包括对自身专业知识的把握与实验技能熟练程度的反思,这样也能促使他们紧密跟踪学科发展前沿不断提高[6].本课程经各方面协调讨论,现已逐渐组建了一支人员稳定、业务基础全面、具有团结协作精神的教学团队.其中教授3人、副教授2人、讲师2人.其中大多数教师承担国家自然科学基金、内蒙古自然科学基金、内蒙古高校基金等科研项目,在努力完成这些科研任务的同时,有意识地将许多科研工作中的思路和先进的技术转化到研究生分子生物学实验的教学实践中.实验课教学团队的建设极大地提高了研究生实验教学质量,并申请得到了我校研究生教学改革项目建设立项资助.

2．3实验课成绩考核与结果评价

经过教学团队的调研讨论,针对分子生物学实验考核形式的问题,提出实验课评价体系多层次评价的管理制度,包含预习报告、平时考勤、实验操作、实验结果与实验报告撰写情况5个部分,分别所占比例为1∶2∶4∶1∶2;针对设计性与创新性实验,要加上实验方案制定与实验论文撰写环节.针对研究生各实验组人数较少、时间较灵活、学生专业多样化等特点,在考核中更加注重实验的具体操作过程.在课程开课初要将考核方案告知学生,让他们明确各环节的评分标准,在实际考核过程中如实记录作为评价依据.实验课结束后,通过“问卷调查与后期跟踪相结合”的模式及时对教学效果进行评价[7].通过发放问卷调查表的方式综合调查研究生对本门实验课的内容设置、教学方法及授课教师的教学效果等信息的评价.另外,在实验课结束一个学期后,我们对研究生指导教师进行问卷调查,对上一年度的实验教学效果进行了后期跟踪评价,对研究生进入到各自实验室工作后的科研思维、实验设计、操作能力等进行调研,综合评价实验教学效果[8].

3结语

分子生物学实验技术是生物学各分支学科科学研究必备的手段,在研究生入学后进入课题研究之前开设“分子生物学实验”课,熟练掌握基本的分子生物学操作技术,这是生物学研究生快速进入科研课题与顺利完成硕士学业的基本保证[9].研究生经过基本实验技能培训、全面综合实验及自主设计实验的锻炼及创新实验平台的全方位提升,科研能力得到大幅度提高.学生普遍反映研究生分子生物学实验为他们顺利进行课题研究、完成学位论文和未来的科研工作奠定了良好基础,一部分学生在硕士期间就发表了高水平的SCI论文.为生物学研究生开设分子生物学综合实验,在内蒙区内外兄弟院校进行此类设置的尚不多见,需要我们更加努力创立并逐步完善研究生实验教学平台,全面提升我校硕士研究生培养水平[10G12],及时将教师的科研成果提炼引入实验教学,提高指导教师的教学能力,使实验内容不断更新,为研究生进行课题研究及毕业以后从事相关的科研工作打下坚实的基础.

参考文献(References)

[1]张淑平,,李英姿,等．分子生物学基础实验课双语教学探索与实践[J]．实验技术与管理,2010,27(12):180G183．

[2]郑冬梅,王悦．构建研究生实验教学体系,培养研究生创新能力[J]．实验技术与管理,2010,27(5):146G150．

[3]文莹,李大伟,李颖．微生物专业研究生实验课设计思路与特色[J]．微生物学通报,2011,38(1):123G126．

[4]郭淑贞,李丽娜,张前,等．基于问卷调查的中医院校研究生分子生物学实验课程改革探索[J]．内蒙古中医药,2014(12):138G139．

[5]杜联峰,孙万邦,夏嫱,等．研究生免疫学实验教学改革与探索[J]．教育教学论坛,2015,16(4):263G264．

[6]郑源强,包玉龙,丁枫．研究生医学免疫学实验教学改革与探索[J]．中国免疫学杂志,2015,31(4):548G550．

[7]宁启兰,马捷,李冬民,等．研究生实验教学改革中的分子生物学教学实验设计[J]．西北医学教育,2009,17(4):693G694．

[8]汪渊,周青,袁凌云．开设博士研究生分子生物学实验课的探讨[J]．生物学杂志,2000,17(3):36．

[9]于振江,严国光,郑维洁．进一步加强教学实验室的建设与管理[J]．实验技术与管理,1998,15(4):34G37．

[10]王雅梅,李宝红,于培兰,等．医学研究生分子生物学实验教学体会[J]．医学教育探索,2008,7(2):173G174．

[11]孟照俊,俞小瑞,韩燕,等．医学分子生物学实验教学改革的初步探索与实践[J]．西北医学教育,2006,14(2):86G87．

第5篇：分子生物学研究范文

病理性瘢痕包括增生性瘢痕(Hypertrophic Scar，HS)和瘢痕疙瘩(Keloid，K)，是因成纤维细胞增殖，生长失控、胶原过度沉积导致真皮纤维化。K表现为侵袭性瘤样生长，而HS却随时间推移有自然软化趋势，可见在形成机制方面还有不同之处。虽然目前病理性瘢痕形成的机制还不太清楚，但这方面的研究却方兴未艾，本文就近年来对病理性瘢痕发生机制的研究综述如下。

1　病理性瘢痕形成的机制研究

1．1　肌成纤维细胞在瘢痕形成中的作用：正常创面愈合过程中的创面收缩或过度愈合引起的病理性瘢痕以及各种纤维化疾病中，肌成纤维细胞(Myofibroblast，MFB)的作用越来越受到学者们的广泛关注。MFB最主要的特征是胞质中出现完整的细胞骨架结构，包括微丝、微管系统。它除了表达胞浆肌动蛋白外，还可以与以下四种主要表型共同表达：①波型蛋白(vimentin)；②波型蛋白和结合蛋白(desmin)；③波型蛋白和a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)；④波型蛋白、结合蛋白和a-SMA。并且还证明MFB可以表达不同的平滑肌肌浆球蛋白重链(MHC)，表明MHC表型对进一步鉴别分化好的MFB不同表型意义较大。而a-SMA是体内MFB最常见的标志，其次是波型蛋白，因此可用a-SMA鉴定MFB。

在增生性瘢痕及纤维化病灶中，a-SMA阳性的MFB持续存在。免疫组化显示a-SMA阳性的MFB主要存在于HS结节状结构中，而K中则几乎不存在MFB。因为瘢痕疙瘩的特性为几乎不萎缩也不发生挛缩，内含粗大的胶原纤维，而增生性瘢痕则会发生萎缩也易挛缩，内含散乱的细胶原纤维，所以有理由认为瘢痕的挛缩与其中所含的MFB有关。另外，在证实了胎羊、胎鼠等在胎内前2／3的时间伤口不产生瘢痕，而到后1／3时间伤口会出现瘢痕愈合基础上，Estes等通过透射电镜及免疫组化方法研究了孕早期及孕晚期胎羊伤口MFB发生情况，发现孕75天制作的伤口中无a-SMA，而在100～120天制作的伤口中大量表达。电镜下可见细胞中微丝逐渐增多、排列也渐规则，并发现伴有连接纤维形成，说明MFB在瘢痕形成过程中可能起到一定作用。

1．2　病理性瘢痕形成和细胞凋亡的关系：细胞凋亡为细胞的一种主动性细胞自杀行为。在生理情况下，细胞凋亡起到调节细胞数量、便于形态发生、去除有害或异常细胞、清除已完成功能的细胞等作用；在病理情况下，凋亡不足或过度，均可导致疾病发生。最近有研究证实，人体的系统性硬化疾病中，存在成纤维细胞的凋亡增加及细胞外基质的增加。通过电子显微镜与原位末端DN断标记技术发现，肉芽组织向瘢痕组织转变期间，随着伤口的愈合，肌成纤维细胞和血管细胞的凋亡增加，并推测凋亡缺乏可能在病理性瘢痕的形成发展中发挥了重要作用。通过TUNEL及免疫组经技术发现，增生性瘢痕中存在细胞凋亡现象，增生性瘢痕消退过程中，成纤维细胞数量的减少与成纤维细胞的增加相一致。由此可认为，MFB凋亡不足和增加，是增生性瘢痕产生和消退的原因。Luo，Funayama等研究发现在瘢痕疙瘩组织中同时存在细胞增生、坏死和凋亡。Mcssadi等通过标记定量研究发现，正常皮肤成纤维细胞凋亡率比瘢痕疙瘩高2倍，凋亡相关基因表达也下降。Chen等通过基因芯片对8400条人基因研究检测发现，普通瘢痕与瘢痕疙瘩相比，有402条基因的表达有区别，其中有250条基因上调，152条基因下调，有8种凋亡基因表达过低。由此推断，瘢痕疙瘩不能正常凋亡并持续产生胶原，是其不断增生的原因之一。

1．3　Bcl-2对病理性瘢痕的影响：病理性瘢痕均是以细胞增殖所致的疾病。Bcl-2是参与细胞增殖与凋亡的重要调节基因，对细胞凋亡具有直接抑制作用，并能促进细胞的存活。我们的调查表明：Bcl-2可促进成纤维细胞的增殖，抑制成纤维细胞的凋亡。减少凋亡，延长存活的作用，必然导致胶原蛋白合成沉积增多，从而促使皮肤纤维化发生。

1．4　氧自由基和病理性瘢痕的形成：氧自由基是体内各种代谢反应的中间产物，化学性质活跃，很容易与其他分子或自由基发生氧化还原反应，生成新的自由基，由此引发连锁反应，它具有重要的生理功能，同时也与人体多种疾病密切相关。丙二醛(MDA)是自由基与生物膜中的多价不饱和脂肪酸作用发生脂质过氧化反应生成的终产物，它的产生与脂质过氧化平行，测定其含量不仅可反映脂质过氧化的程度，同时也间接反映了机体细胞损伤的程度。李伟人等通过测定病理性瘢痕中丙二醛的含量，发现增生性瘢痕与瘢痕疙瘩中丙二醛含量均较正常人皮肤明显升高(ρ＜0．05)，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩比较无差异(ρ＞0．05)，表明在病理性瘢痕中脂质过氧化程度加重，局部组织细胞由于遭受自由基攻击也可能发生了一定程度的损伤。而引起病理性瘢痕局部自由基产生和清除失衡的原因可能与生成增多有关。Wan等的研究也表明病理性瘢痕中与自由基生成有关的补体C3和游离铁含量明显高于正常皮肤。在成熟瘢痕中丙二醛含量与正常人皮肤比较无差异，则可能是因为自由基生成与清除已恢复平衡，从而脂质过氧化程度也趋于正常。同时我们也注意到，与成熟瘢痕相比增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中MDA含量非常显著升高(ρ＜0．01)，提示通过减轻脂质过氧化程度可能有助于防治病理性瘢痕的形成。

2　瘢痕疙瘩形成机制的研究

K是继发于皮肤损伤，如创伤、烧伤或手术后，以胶原过度沉积为特征的皮肤疾病。其形成机制的研究，目前在细胞、分子生物学及遗传学方面比较活跃。

2．1　抗瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的研究：K组织中成纤维细胞(fibroblast，FB)过度增生，大量的细胞外基质沉积和向正常皮肤侵袭、生长从而形成K，其原因是瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid derived fibroblast，KFB)凋亡受阻引起的。Saed等在所有KFB的p53exon4编码72位点，检测到精氨酸脯氦酸的置换，而HS和K患者正常皮肤等标本未发现异常，提示p53基因为KFB后天获得性突变的高发区，并且该基因精氨酸／精氨酸纯合型患者耳部K的发生率明显增加，而脯氨酸／脯氨酸纯合型患者发生HS的几率增加。卓阳等认为，p53脯氨酸等位基因频率的检测，可作为K高危个体的判断标志。鲁峰在20％(2／10)的K标本中发现，fas exon9编码区的“A”碱基的移码突变，提示编码fas“死亡区”结构基因的突变，可导致fas蛋白功能丧失和K细胞凋亡障碍。Bel-2、c-jun和c-fos原癌基因与FB的增殖有关。在增生期，HS和K的基底细胞、散在的FB样细胞和血管周围纺锤形细胞强烈表达Bcl-2，而c-jun和c-fos mRNA及其蛋白分子，则主要分布于真皮FB样细胞和血管周围细胞，

正常皮肤未见上述异常表现，推测活跃的KFB增殖与Bcl-2蛋白和c-jun、c-fos转录和翻译水平增加有关。1999年有研究发现，K组织中有64种凋亡诱导相关基因表达下降。K基因表达的重新编程或真皮模式的病态分化，可能涉及K的发病机制，可作为K的病理诊断标志和治疗策略。KFB凋亡普遍依赖caspase-9的活性作用。KFB凋亡相关基因表达的失衡，表面为转化生长因子(Vansforming growth factor TGF)β1活化以及p53、fas及caspase-3、caspase-8、caspase-9表达缺失，表明KFB凋亡抗性基因位点位于caspases上游。

在K形成的过程中，局部生长因子非主要因素，起关键作用的是KFB对生长因子的敏感性，即通过上调KFB胞膜上生长因子受体的数量，提高外源性刺激信号的转导能力和效率，是其细胞增殖和凋亡抑制的主要原因之一。IGF和TGF-β1，通过促纤维化效应和丝裂原效应，刺激FB增殖和瘢痕形成，是与KFB凋亡抗性关系密切的细胞生长因子。此外，肿瘤坏死因子-α在上调KFB抗凋亡能力中也发挥重要作用。

2．2　角质形成细胞的异常作用：表皮-真皮相互作用是近年来创伤修复研究的热点。表皮角质形成细胞通过自分泌、旁分泌和内分泌作用，调节组织内环境稳定和细胞增殖、分化和凋亡。在增生期K和HS表皮-真皮交界区域Bcl-2阳性，FB增多，提示表皮-真皮之间的相互作用，参与了病理性瘢痕的形成。KFB凋亡障碍可能与K低氧环境有关，即K微血管闭塞和缺血缺氧环境能诱导KFB和血管内皮细胞等表达Tβ1和缺氧诱导因子-1。后者可诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达，并可经P13-激酶通路激活抗凋亡激酶(Akt／PKB)，以维持细胞的功能和低氧适应性。

2．3　瘢痕疙瘩与langerhans细胞：K及HS组织中S-100蛋白及Cala免疫反应阳性的Langerhans细胞明显增多。Langerhans细胞与K形成关系密切。瘢痕过度增生的原因之一可能是由于病变部位Langerhans细胞增多，造成成纤维细胞过度合成胶原和细胞外基质，最终结果造成了胶原的过量沉积。HS临床表现类似于K，两者表皮组织中的Langerhans细胞均明显多于正常皮肤，且无明显差异，说明两者在形成机制方面存在某些相同处。

2．4　瘢痕疙瘩与染色体2q23、7P11及易感基因：最近，Mameros等通过瘢痕日本家系和非洲裔美国人家系进行遗传学研究后发现，日本家系与染色体2q23连锁，非洲裔美国人家系与染色体7p11连锁，他们还报道了一个有10人发病的非洲裔美国人中等大小的瘢痕疙瘩家系进行同样的研究，却未发现与2q23和7p11存在连锁关系，说明瘢痕疙瘩易感基因位点存在异质性。虽然单个基因的突变可以导致对瘢痕疙瘩产生特异的易感性，但是不同人群瘢痕疙瘩的发病率不同，而且发病年龄、临床表型和对人不同治疗的反应，也存在差异，说明不仅是一对基因参与瘢痕疙瘩的发病。其发病机制可能是由于若干对微效基因(minor gene)。最近，张刚等采用比较基因组杂交方法检测了6例瘢痕疙瘩患者的染色体后发现染色体1q、16q、20q和22q存在部分缺失，推测这种缺失导致抑制性基因的丢失，造成瘢痕疙瘩的发生和发展，从而认为瘢痕疙瘩的发病可能与染色体的结构畸变有关。

3　增生性瘢痕形成机制的研究

3．1　TGF-β3对增生性瘢痕形成的生物学作用：增生性瘢痕是现代外科治疗难点，转化生长因子β(TGF-β)在组织纤维化中具有重要作用，TGF-β是明显的促瘢痕形成因子，而TGF-β3可减少TGF-β1、TGF-β2的产生，从而减少细胞外基质(ECM)合成，因此，TGF-β3，有可能是人体内在的抗瘢痕形成因子。TGF-β家族是细胞生长、分化、ECM合成与代谢的多功能调节因子。哺乳类动物TGF-β是三种异构体，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，而这三种异构体在体内分别具有不同的功能以维持平衡，这种平衡被打破将会导致组织器官纤维化。TGF-β1是具特征性的促纤维化形成因子，通过自分泌和旁分泌机理，刺激成纤维细胞产生胶原及其基质成分并沉积。Shah等对成纤维细胞体外培养研究发现，TGF-β1和TGF-β2中和抗体有明显抑制成纤维细胞增殖，减少胶原蛋白等ECM合成，而无型别特异性的TGF-β多克隆抗体却无此作用。因此认为纤维化疾病可能是TGF-β异构体表达失衡所致。

3．2　Smad2、Smad7与增生性瘢痕：Smads蛋白家族是近年来发现的转化生长因子β1，受体下游信号蛋白，也是目前公认的介导TGF-13。胞内反应的主要通路。TGF-β1是与瘢痕形成最密切的细胞因子。Smads是TGF-β1的下游信号蛋白，Smad2和Smad7分别起正性和负性调节作用。已知在增生性瘢痕中TGF-βⅠ、Ⅱ型受体明显增加。因此我们推测，Smad2信号通路在细胞内异常持续地激活和(或)smad7抑制作用逐渐减弱，是增生性瘢痕形成的原因。Smads在细胞核内的正确定位是信号转导的前提。NSF组织有少量磷酸化Smad2表达且位于细胞质中；HSF组磷酸化Smad2表达量增多且位于细胞核中，表明其可持续激活靶基因转录，导致增生性瘢痕的形成。

3．3　增生性瘢痕相关蛋白p311：有学者曾利用基因芯片技术，对烧伤后同体早期HS与正常皮肤组织的差异表达基因进行筛选，找出97条相关基因并逐一分析，结果显示p311(Genebank ID：hsu36189)基因表达差异显著。同时，Pan等也报道了p311基因的编码蛋白p311能够促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，进而可能影响创伤修复甚至纤维化的发生发展过程。p311的编码蛋白由68个氨基酸组成，相对分子质量为8×103。p311在细胞分化过程中可能扮演着转录因子转录活性的角色。目前之所以关注P311，一则是因为p311基因在早期的HS中呈高表达，另则是因为它能够促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。而肌成纤维细胞又是创伤不全愈合过程以及肿瘤间质反应中影响纤维化过程的重要靶细胞。这也暗示P311可能通过肌成纤维细胞影响创伤修复甚至纤维化与HS的发生发展过程。

3．4　组织缺氧与增生性瘢痕的关系：缺氧促使成纤维细胞合成大量的胶原，上调TGF-β的分泌，TGF-β能够进一步促

进胶原的合成，大量胶原纤维的存在势必导致氧弥散功能的下降；在创伤后早期肉芽组织内就有血管闭塞现象，在增生性瘢痕组织内可见大量闭塞、半闭塞性的毛细血管，与血管内壁增多的内皮细胞有关。缺氧导致胶原合成增加和血管闭塞，两者进一步加重缺氧，反复循环，最终导致增生性瘢痕的形成，但持续的缺氧使胶原合成受限使瘢痕转向成熟。用原位杂交技术对增生性瘢痕进行分析：成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ胶原增加，尤其在靠近血管网的部位；TGF-β不但能为成纤维细胞而且能为血管内皮细胞所分泌。说明TGF-β能通过自分泌、旁分泌调节胶原的合成。增生期的增生性瘢痕的氧分压是降低的，随着瘢痕的成熟，组织氧分压才逐渐接近正常组织水平，增生性瘢痕外观颜色鲜红，表现为血液供应丰富，这与组织低氧分压表现并不一致，原因在于过度增生的胶原纤维结节阻碍了瘢痕组织的氧气交换，也可能是瘢痕组织增生活跃氧耗增加，使瘢痕组织貌似血供丰富，其实处在缺氧状态。

3．5　皮肤圆锥体结构损伤和增生性瘢痕：梁智等通过对雌性杜洛克猪(female red duroc pig，FRDP)的皮肤圆锥体结构损伤情况进行观察，发现浅创面组FRDP皮肤圆锥体结构的上半部分受损，但脂肪穹隆以及腺体完好，可见圆点状结构和均匀的出血点，愈合后无瘢痕形成。深创面组皮肤圆锥体结构的上半部分缺失、下半部分受损，伤及脂肪穹隆及腺体，未见圆点状结构和均匀的出血点，愈合后有瘢痕形成。创面愈合及瘢痕形成情况：浅创面组创面在伤后3周内愈合，较为平整，无瘢痕组织形成；深创面组创面愈合时间在伤后4周以上，较厚、无毛发、挛缩、质地坚硬、局部色素变浅或加深。深创面组伤后10、30天皮肤的变化与浅创面组相似，成纤维细胞和炎性细胞主要存在于圆锥体结构周围，脂肪穹隆逐渐变小，并被炎性细胞所填充；伤后150天愈合的创面明显增厚，有明显的瘢痕组织形成。深创面组伤后时间越长，瘢痕越厚；伤后150天瘢痕增生达高峰。圆锥体结构的深层部分受损可导致HS的产生。VVG染色计分显示，不同深度创面在不同时相点形成瘢痕的规律是创面越深，瘢痕越厚。由此说明，皮肤圆锥体结构受损与HS的形成有一定关系。

第6篇：分子生物学研究范文

关键词：猪传染性胃肠炎；病毒分子；生物学检测方法

中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）12- 0110-02

猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）导致猪出现脱水、水样腹泻以及呕吐等为主要临床症状的高度传染性疾病，该病在春季、初秋以及冬季具有较高的发病率[1]。猪传染性胃肠炎最早发生于美国，随后在世界各地均有发生，我国于20世纪50年代首次发现该病，目前全国大部分地区均发生过猪传染性胃肠炎。不同日龄和品种的猪均可以感染传染性胃肠炎，其中以15日龄左右的仔猪发病后死亡率最高，高达100%；5周龄以上的仔猪感染传染性胃肠炎后死亡率较低，但是会影响仔猪后期的生长，降低仔猪的饲料利用率。目前，该病已被世界动物卫生组织列为B类必检传染性疾病。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，该技术已经广泛用于各种细菌性和病毒性疾病的检测[2]。本文综述了分子生物学技术在传染性胃肠炎中的应用，以期能为从事传染性胃肠炎诊断和防控的工作者提供帮助。

1 传染性胃肠炎病毒基因组结构和基因表达方式

1.1 TGEV基因组结构 传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，该病毒的基因组不分节段、单股正股RNA，具有高度传染性。传染性胃肠炎基因组全序列分为7个区29kb，结构序列为5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且该基因组的3'-末端以共价键结合的poly结构，5'末端有帽结构[3]。基因组1约有20kb，主要负责病毒的编码，其余基因均在近3'端。传染性胃肠炎病毒全基因组编码由4种结构蛋白和3种非结构蛋白组成，其中基因7、基因3和基因1为非结构蛋白，N、M、sM、S为传染性胃肠炎的结构蛋白。

1.2 基因表达方式 传染性胃肠炎病毒在胞浆脱壳以后，其正链RNA就呈现了mRNA的功能，使基因1转录表达RNA聚合酶，同时该基因有作为模板合成负链RNA，进而亲代RNA与负链RNA形成双链复制中间体。因此，在感染传染性胃肠炎病毒的细胞内，可以检测出不完全RNA、基因组RNA、mRNA以及双链中间体4个特异性RNA，这可以作为猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测指标之一[4]。

2 结构蛋白及功能

猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白主要为S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是猪传染性胃肠炎病毒纤突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，该蛋白基因全长4.3kb，蛋白分子量为195～220ku；S蛋白不仅是决定猪传染性胃肠炎病毒抗原的重要结构，也影响着病毒对细胞的致病性、亲嗜性等。M蛋白是构成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前体是由膜外区、信号肽、极性区、跨膜区突于病毒粒子内C-端区等功能区域构成，分子质量为29～31ku；M蛋白不仅决定了病毒粒子的出芽位点和装配位点，也可以影响病毒变异。N蛋白是一种酸性蛋白质，分子量为47KDa，含有382个氨基酸残基，该蛋白不仅是猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白，同时对病毒基因组的加工、复制都具有重要作用。sM蛋白分子质量为78ku，含有1种小膜蛋白和82个氨基酸残基，该功能蛋白在抗猪传染性胃肠炎病毒感染的体液和细胞免疫中具有重要作用。

3 分子生物学检测方法

3.1 核酸探针 核酸探针检测方法的基本原理是利用核苷酸碱基互补，在碱基互补过程中，采用标记物标记与被检测靶序列互补的单链核酸分子，进而检测到目的核序列。该检测方法与扫描电镜、荧光抗体试验、病毒分离等相比，具有较好的特异性，并且可以实现快速检测的目的。现代研究表明[6]，不同的病毒探针可以分别扩增出与其对应的病毒模板，对其他病毒模板影响不大，同时核酸探针扩增的最低检测限为3 000～6 000个拷贝的单个病毒核酸，具有较高的特异性和敏感性。

3.2 普通RT-PCR方法 该检测方法使用的首要条件是知道被检测病原的相关目的基因序列，根据相关目的序列后，采用相关软件设计相应的引物，然后进行体外扩增目的基因，进而达到检测的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法检测猪传染性胃肠炎病毒，并采用相同浓度做重复性检测，结果显示RT-PCR扩增的特异性条带为590bp左右；然后又以猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒以及猪轮状病毒做特异性试验，结果显示仅有猪传染性胃肠炎病毒得到了特异性目的条带，所以RT-PCR检测方法对猪传染性胃肠炎病毒检测具有较好的重复性和特异性。

3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR检测方法是以普通PCR为基础发展的一种新型检测方法，该检测方法可以在一个PCR反应体系中加入多对引物，并通过采用优化后的PCR反应条件，达到同时检测多种病原的目的，具有快速、成本低等优点，目前也常用于各种疾病的诊断。霍金耀等[8]建立了多重RT-PCR法检测传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、嵴病毒和A群轮状病毒的方法，并对该检测方法进行了敏感性试验和特异性试验，结果显示，多重RT-PCR法可以检测出50TCID50的混合病毒，且能扩增出长度为275bp、544bp、750bp的3条特异性片段，具有较高的特异性和敏感性，可以在临床上推广使用。

3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要设计内、外2对引物，并通过2次扩增对样品进行检测，该方法相对其他PCR检测方法，具有较高的敏感性，且节约成本。现代研究表明，PCR技术在检测病毒时，可以省略不同病毒分离的过程，具有较高的敏感性和特异性，而套式PCR方法在病毒粒子较少的情况下依然能够检测出，表明套式PCR比常规PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR检测猪呼吸道冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列，根据两组病毒的基因序列分别设计了2对引物，然后分别以猪呼吸道冠状病毒细胞和猪传染性胃肠炎病毒细胞为模板进行套式PCR特异性片段扩增，结果显示，猪呼吸道冠状病毒扩增的基因片段为214bp，猪传染性胃肠炎病毒扩增的基因片段为886bp，同时检测出了这种病毒，具有较高的特异性和敏感性。

3.5 荧光定量RT-PCR方法 荧光定量RT-PCR检测方法的原理是在PCR反应体系中采用荧光探针标记法或加入了SYBR GreenI荧光染料标记PCR的反应产物，然后使用反应仪器收集反应产物的荧光信号，并根据荧光信号的强弱确定产物的量，进而达到与起始模板准确定量的目的。该检测方法与常规RT-PCR相比，不需要进行电泳试验检测PCR反应产物，反应结果更为直观、方便，同时又避免了因电泳试验对环境造成污染。王建中等[10]根据猪传染性胃肠炎病病毒的S基因序列设计了引物，并通过多组试验对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化，结果显示，优化后的检测方法对其他病原的检测结果均为阴性，检测结果的敏感性高达43.07拷贝/μL，是常规PCR检测方法的100倍，具有较高的敏感性和特异性。

3.6 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术是近几年新兴的一种分子生物学检测方法，因其具有特异性强、敏感性高、检测速度以及操作简单等优点，目前已经广泛应用于病毒病和细菌病检测。高睿泽等[11]根据猪传染性胃肠炎病毒的N基因建立了环介导等温扩增快速检测方法，并对该检测方法的敏感性和特异性进行了评价，结果显示，该方法在63℃下可以使猪传染性胃肠炎病毒N基因获得较高的特异性扩增，且与猪流行性腹泻病毒等物交叉反应，具有加高的特异性；同时该检测方法可以检测到131.4fg/μL的DNA，其灵敏度比常规PCR高出3个数量级。

参考文献

[1]王文秀，王善辉，沈志强，等.猪传染性胃肠炎病原学检测方法的研究进展[C]//2012第四届中国兽药大会论文集.2012：90-92.

[2]刘邓，袁秀芳，徐丽华，等.猪传染性胃肠炎诊断技术研究进展[J].动物医学进展，2008，29（12）：64-68.

[3]霍芳，宋道祯，汤少伟，等.猪传染性胃肠炎病毒诊断技术研究进展[J].饲料与畜牧・规模养猪，2014，（2）：30-33.

[4]董加才.猪胃肠炎病毒的分离鉴定及S基因的克隆、序列分析与原核表达[D].郑州：河南农业大学，2008.

[5]闫贵伟，库旭钢，陈淑华，等.猪乳汁中抗猪传染性胃肠炎病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2015，37（1）：31-34.

[6]陈伯祥，杨明，郭慧琳，等.猪传染性胃肠炎间接ELISA检测方法建立[J].中国农业信息（上半月），2012，（1）：167-168.

[7]王黎，李碧，周远成，等.猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].中国兽医学报，2015，35（2）：190-194.

[8]霍金耀，郑逢梅，陈陆，等.猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A群轮状病毒和嵴病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].中国兽医学报，2013，33（12）：1792-1797.

[9]沈海娥，郭福生，龚振华，等.应用套式PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的试验[J].中国动物检疫，2003，20（7）：21-23.

[10]王建中.猪传染性胃肠炎病毒S基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国畜牧兽医，2014，41（1）：66-71.

第7篇：分子生物学研究范文

摘要 瑞氏木霉是自然界中普遍存在并有重要经济意义的一种丝状真菌，作为工业生产菌株生产多种水解酶类已有多年历史。本文报道了用基因工程手段对瑞氏木霉进行遗传改造，构造具新性状的重组菌株，用以过量产生同源和异源蛋白类物质的分子生物学研究进展。包括利用CBHI基因的强启动子在瑞氏木霉中过量表达瑞氏木霉内切葡聚糖酶、小牛凝乳蛋白酶、人抗体片段、哈茨木霉几丁质酶、Hormoconis葡萄糖淀粉酶等同源和异源蛋白以及利用在葡萄糖上强表达的启动子生产纤维素酶等遗传工程进行情况。

关键词瑞氏木霉；遗传改造；基因定位置换整合；重组蛋白

1 前言

多年以来，丝状真菌及其产生的酶类已广泛用于食品和食品加工业。由于其在工业上的巨大应用潜力，促进了大规模发酵工程、下游加工工程和对菌株的遗传改造的发展，其结果有助于将丝状真菌进一步应用于当今的工业生产。大多数情况下，自然发生的菌株产生我们所需蛋白的水平很低，以至不能在商业上加以利用。因此，为了得到所需的目的蛋白，需对自发菌株进行遗传改造。随着分子遗传技术和真菌基因转移系统的发展，利用基因工程方法对丝状真菌进行有目的的遗传改造，已以成为可能。

丝状真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是多细胞的真核微生物，其作为工业菌株用于生产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年历史。瑞氏木霉所产生的一种主要的纤维酶一纤维二糖水解酶I（cellobiohydrolase1），由单拷贝基因编码，其产量可达瑞氏木霉胞外分泌性蛋白总量的50%[1]。由此可见，cbh1启动子是很强的启动子。因此在对瑞氏木霉的遗传改造中，常利用cbh1的启动子与终止子序列构建载体，并利用cbh1的前导肽序列引导重组蛋白进行分泌性表达。瑞氏木霉具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如：高甘露糖型和N-糖基化[2]等。由于瑞氏木霉具有以上优良性能，再加之其工业化规模发酵条件已比较成熟，这些都促进了对瑞氏木霉的遗传改造，为同源或异源分泌性蛋白的产生提供了一条行之有效的途径。

瑞氏木霉不仅具有适于蛋白生产的诸多优点，且对人没有毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素。近年来的实践表明，经过基因工程手术改造的瑞氏木霉重组菌株是安全无害的[3]。

2 过量生产同源蛋白一纤维素酶与木聚糖酶的生产

纤维素酶广泛用于淀粉加工、谷物酒精发酵、麦芽制备和酿造、动物饲养以及青贮饮料加工、果汁和蔬菜汁的提取等诸多方面，近年来被应用于纺织、造纸、制浆等工业。由于纤维素酶应用范围极其广泛，使得开发和改造纤维素酶生产菌株具有极强的现实意义。瑞氏木霉具有降解纤维素的完全酶系，所分泌的纤维素酶混合物通常包括内切葡聚糖酶等多种酶活力。

1990年，Harkki等报道，通过基因定位置换整合使编码CBHI的基因失活，结果EGI的产量提高，不再产生CBHI[4]（见图1）。1993年，Karhunen等报道，将编码EGI的基因置于强启动子cbh1的控制之下，用此表达盒替换染色体的cbh1位点之后，EGI的产量是通常强纤维素分解菌所得CBHI量的2倍或者与其一样多[5]。其他人也曾报道过类似的情况。瑞氏木霉的一个或几个纤维素酶基因经基因位定位置换整合而失活[6，7]。这些菌株提供了一系列令人感兴趣的新酶混合物，即可用于工业生产，又可用于研究不同酶组分对各种纤维底物的分解作用。

但是，基因失活和基因置换的方法，可能不适用于需极高特异和必须去除非必需酶活力的酶制剂。这是因为用于酶生产的培养基，可能会诱导产生大量其它水解酶类。而要使编码这些酶的基因都失活，在实际当中几乎是不可能的。为了防止这类问题的产生，Goldman(1992)、Schindler（1993）Nakari(1995)等人先后报道从瑞氏木霉中分离了非纤维素酶基因的启动子，包括pgk启动子、pkiA启动子、tefl启动子和一个在葡萄糖培养基上强表达但未知的cDNA1的启动子，这些启动子可以在葡萄糖培养基上启动合成所需要的纤维素酶，产生的酶制剂基本上没有其它纤维素酶活力。在cDNA1启动子控制下所合成的纤维二糖水解酶和内切葡聚酶产量最高可达50-100mg/L，占分泌蛋白总量50%以上[8]。1996年，Kurzatkowski等构建了能在葡萄糖培养基上生长的瑞氏木霉的重组菌株，其携带的木霉糖酶Ⅰ或木霉糖酶Ⅱ结构基因是在内源丙酮酸激酶基因（pkil）表达信号的控制之下表达。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫染色，发现这两种类型的转化体在葡萄糖培养基上生长时，能分别分泌出木霉糖酶Ⅰ和木霉糖酶Ⅱ。对于木霉糖酶来说，最好的转化体产生的特异性酶活力为76U/mg；而对于木霉糖酶Ⅱ来说，则为145U/mg；都大大高出于自发菌株所产生的26U/mg[9]。

3 异源蛋白的生产

3.1真菌酶蛋白类

将Trichoderma harzianum P1染色体上的内切几丁质酶基因分离，导入丝状真菌瑞氏木霉，并在cbh1启动子过量表达。出发菌株瑞氏木霉RutC-30不具有任何内切几丁质酶活力。T·harzianum内切几丁质酶基因编码区前的区段的瑞氏木霉中能正确发挥功能。摇瓶培养产生130mg/L有活力的几丁质酶，比T·harzianum产生的内切几丁质酶活力提高大约20倍。瑞氏木霉RutC-30似乎能忍受内切几丁质酶具有抗植物病原真菌的活力[10]，已被用于植物病源真菌的生物防治。另据B.Cubero等（1997）报道，在瑞氏木霉组成型启动子ki和cbh2终止子的控制之下构建了两种载体，分别含有T·harzianum的基因chit33和bgn16.2的开放阅读框（chit33编码一种内切几丁质酶，bgn16.2编码一种外切葡萄糖淀粉酶），并获得了稳定的拷贝转化体。对转化体bng16.2来说，整合到基因组中的基因拷贝数与mRNA和蛋白质的积累量和在葡萄糖阻遏或几丁质酶诱导条件下的胞外牧特性酶活力之间均呈正相关。该菌株比野生型菌株能更迅速地抑制病原真菌的生长。对转化体chit33来说，在葡萄糖阻遏的条件下。对转化体chit33来说，在葡萄糖阻遏的条件下，其产生的胞外几丁质酶活力是野生菌株的10倍[11]。

Joutsjoki VV(1994)报道，构建了两种一步基因置换载体。一种载体含有Hormoconis resinae葡萄糖淀粉酶P的基因组基因（gamP），另一种含有相应的cDNA，都在瑞氏木霉cbh1启动子控制下表达。这些载体经转化后置换瑞氏木霉的cbh1基因。在这两种载体中，cbh1启动子都能精确地连接到gamP蛋白质编码区上游，指导瑞氏木霉分泌出有活力的葡萄糖淀粉酶P（GAMP）。这表明gamP基因中内含子序列在瑞氏木霉中得到了正确的加工。研究结果表明，含有gamP cDNA的最优转化体能分泌大约700mg/L有活力的GAMP，是在H.resinae中产量的20倍[12]，但chb1基因被gamP基因组基因置换的瑞氏木霉转化体，所分泌的有活性的GAMP要多于含有3拷贝cDNA的转化体。对瑞氏木霉分泌H.nisresinae葡萄糖淀粉酶P的研究结果表明，自然状态未成熟GAMP的N端延伸部分可以在瑞氏木霉中作为一种有效的分泌信号，所产生的胞外葡萄糖淀粉酶活力高于以CBHI信号肽作为分泌信号时的情况[13]。

酵母基因在瑞氏木霉中表达的一例是：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DPM1基因（编码甘露糖基磷酸多萜醇合成酶）的编码区插入到pLMRS3质粒中，在瑞氏木霉pki启动子和cbh2终止子控制下表达。在pFG1质粒（含有瑞氏木霉pyr4基因）存在下，与pLMRS3质粒一起对瑞氏木霉的一种pyr4阴性突变株TU-6进行共转化。然后筛选pyr4阳性转化子，得到4株多拷贝DPM1基因串联整合的稳定转化子。与受体菌株TU-6相比，转化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了15-19倍，分泌的蛋白总量也提高了4倍[14]。

除以上蛋白外，被表达的真菌蛋白还包括肌醇六磷酸酶等。这些酶都是在cbh1启动子下表达，摇瓶培养产量达100mg/L水平。发酵培养中，产量为每升几克。在cbh1启动子的控制之下，来自担子菌纲的真菌Phlebia radiate的氧化还原酶（如：漆酶）的产量也达到中等水平

3.2哺乳动物蛋白

瑞氏木霉已被用于牛凝乳蛋白酶的生产。利用cbh1启动子和终止子，通过共转化外源基因与来自构巢曲霉（Asp.nidulans）的amdS基因一起引入乙酰胺非利用型菌株。测量到的凝乳酶mRNA和分泌出的凝乳酶的量要比相应的cbh1 mRNA和CBHI的量低1-2个数量级。这表明牛凝乳蛋白酶在瑞氏木霉中的表达受到了转录限制。但是，所获得的40mg/L的水平，与典型的在构巢曲霉素中的2-10mg/L的最初水平相比，还是一个可喜的进步[15，16]。

另外，据文献报道，利用其它丝状真菌生产的几种人体蛋白是：表皮生长因子（hEGF），生产激素（hGH），白细胞介素6，组织血纤维蛋白溶酶原激活因子（htPA）等。

Fab分子是由抗体完整的轻链和重链的Fd部分，由链间二硫链连接在一起。这种分子曾由木霉成功地生产出来，并用于研究其分泌过程。利用cbh1启动子和信号序列，分别构建了表达轻链和重链的表达盒。首先构建的是只产生轻链的菌株，然后用2种不同的重链表达载体进行再转化。这两种载体分别指导Fd链或者与CBHI核心-连接区融合在Fd链的表达。只产生轻链的菌株分泌的轻链水平很低（0.2mg/L）。对前一种重链载体的转化体来说，在摇瓶培养中，分泌的有可能的Fab分子为1mg/L。在具有cbh1-Fd融合结构的转化体菌株中，观察到产量有显著增长。最优菌株能分泌40mg/L具有免疫活力的CHBI-Fab融合蛋白。在发酵培养中，水平增长到150mg/L.然而，没有融合到CBHI上的Fab分子，水平仍为1mg/L。有趣的是，一种未知的木霉蛋白酶在CBHI-Fab融合蛋白的N-端特异去除2个氨基酸，能产生少量的Fab分子。释放的Fab分子表现出免疫活性和对抗原的亲和性，而CBHI-Fab分子的免疫活性要低5-12倍。对分离到的抗体链进行定量测定表明，分泌出的所有轻链都和重链组装在一起。CBHI-Fab产物的上清液中，含有显著数量（800mg/L）的CBHI核心-连接区肽，它们来自CBHI-Fd融合分子。这样，CBHI-Fd的产生是非常有效的（大于800mg/L），但其中只有少量（40mg/L）装配成有功能的CBHI-Fab分子（或者，释放的Fab分子）。这表明轻链的产生可能是限制性因素[17，18]。

4 总结

丝状真菌瑞氏木霉已被成功地用于生产同源和异源蛋白。利用基因工程构建具新生状的菌株，在蛋白类物质的生产方面已取得重要进展。其中，在提高丝状真菌异原蛋白产量的过程中，基因融合的方法特别值得注意。典型作法是，将编码有目的蛋白的基因融合到自然情况下分泌性良好的内源蛋白基因如葡萄糖淀粉酶、纤维二糖水解酶基因的下游。这种方法已在由Asp.awamori分泌牛凝乳蛋白酶（Ward等，1990），Asp.nidulans分泌白细胞介素6的过程中，被证明有效的（Contreras等，1991）。有趣的是，当外源蛋白整合到CBHI核心-连接区上时，产量能够提高。在牛凝乳蛋白酶的例子中，产量提高3-5倍；就抗体片段而言，产量提高50多倍（Nyysonen等地993）。

由上可见，在瑞氏木霉中已发现出多种分子系统，采用不同的策略用于同源和异源蛋白的生产。为了提高产量，使用强表达和有效分泌纤维素酶CBHI基因的不同部分，已被证明是一种有效的方法。虽然在基因组的分区段也可获得外源基因的有效表达，但cbh1启动子很强，而且cbh1位点对于表达似乎也有益。将外源蛋白融合到CBHI的核心-连接区，能够恢复对高水平表达起重要作用的区段，如：翻译起始位点、信号肽序列及其作用位点。通过基因工程和发醇培养生产同源和异源蛋白，需要进一步地改进。对于不同的培养条件，包括含葡萄糖的培养基，应该发展出不同的生产策略，策略和技术的发展将会拓宽瑞氏木霉生产重组蛋白的范围。由于瑞氏木霉在大规模生产条件中（高达360m2发酵液）的良好表现，所以它特别适于所需大量蛋白的生产[19]。遗憾的是，目前国内在这方面的研究尚未见报导。山东大学微生物技术国家重点实验室正在开展对于瑞氏木霉的分子生物学研究，已克隆到瑞氏木霉进行菌株改造，通过基因定位置换整合，破坏其木糖醇脱氢酶基因，从而构建木糖醇生产菌。

随着瑞氏木霉分子生物学研究的开展及基因工程的瑞氏木霉的应用，使我们构建多种具有良好商业潜力的菌株成为可能。我们相信利用木霉大量生产多种酶和药用产品，将不断被证明是行之有效的。

参考文献

Durand H，M，Clanet，and G，Tiraby，Enzyme Microb，Technol，1988;10:341-345

Salovuori I，Makarow M，et al.Biotechnology，1987;5:152-156

Helena Nevalainen，Pirkko Suominen，Kaarina Taimisto，J，Biotech.1994，37:193-200

Harkki A，Mantyla A，et al.Enzyme Microb Technol，1991;13:227-233

Suominen PL，Mantyla AL，et al.Mol Gen Genet ，1993;241:522-530

Fowler T，Grizali M，Brown RD Jr， In:Reinikainen T，Suominen P(eds) Proc 2nd Tricel Meeting，Majvik，Finland，1993，Foundation for Bioterchinical and Industrial Fermentation Research，vo18，pp199-210

Ward M，Wu S，Dauberman J，Weiss G，Larenas E，Baower B，Rey M，Clarkson K，Bott R，In:Reinikainen T，Suominen P(eds)Proc 2nd Tricel Meeting，Majivk Finland 1993，Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research，vo18，pp153-158

Tiina Nakari-Setala and Merja Penttili，Appl Environ Microbiol，1995，61(10):3650-3655

Kurzatkowski Wieslaw，et al.Appl Environ Microbiol，1996;62(8):2859-2865

Margolles-Clark E，Hayes CK，et al.Appl Environ Microbiol，1996;62(6):2145-2151

B，Cubero ，I，Garial et al.J A Pintor-Toro，Trice197 Abstracts(lecture)，L22.

Joutsjoki VV，Torkkeli TK，Nevalainen KM，Curr Genet ，1993;24(3):223-228

Joutsjoki VV，Kuittinen M，Torkkeli TK，Suominen PL，FEMS Microbiol Lett.1993;112(3):281-286

Joanna S，Kruszewska ，Arno H，Butterweck，ET AL.Grazyna Palamarczyk，Trice197 Abstracts(poster).P41

Harkki A，Unsitalo J，et al.Bio/Technology，1989;7:596-601

Uusitalo J.M.K.H.Nevalainen，et al.J.Biotech，1991;17:35-50

Nyyssonen E，Penttila M，et al.Bio/Technology，1993;11:591-595

Nyyssonen W，Keranen S.Curr Genet，1995;28:71-79

Sirkka Keranen and Merja Penttila.Current Opinion in Biotechnology，1995;6:534-537

Advane of Molecular Biology in the Production of Recombinant Proteins by Filamentous Fungus Trichoderma reesei

第8篇：分子生物学研究范文

关键词：生命科学；国际化人才培养；分子生物学

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2015）37-0073-02

《国家中长期教育改革和发展规划纲要（2010-2020年）》明确提出，要开展多层次、宽领域的教育交流与合作，提高我国研究生教育国际化水平。必须承认，我国目前在生命科学学生教育方面，无论是本科生还是研究生，与国外学生的教育国家化发展模式和效果还存在巨大差异，因此以国外生命科学学生的教育国际化的发展经验为参考，构建适合中国国情的国际化培养模式，对于提升我国生命科学学生的教育水平和层次具有非常重要的现实意义。目前，生命科学已经成为世界科学前沿最活跃的学科，是代表科学发展方向的学科之一。目前在世界范围内逐渐形成了这样的共识：生物技术将成为21世纪主导社会发展的主要支柱产业之一。人类正在进入生物学时代，生物学正在越来越多地被应用于解决医药领域问题、科技制造业、绿色能源以及农业和环境保护等很多重大方面。而美国白宫也在2012年了“国家生物经济”蓝图，提出未来美国政府在生物经济方面的战略性使命。在这一新形势下，把培养具备国际竞争能力的以及一定自主创新能力的高素质的创新型人才作为生命科学学生培养的目标，并在构建生命科学学科学生的国际化培养的新模式方面进行有益的尝试将变得异常重要。有很多学者发表关于哈佛大学和麻省理工学院人才培养模式的论文，如乔敏等的《学习哈佛经验建立基础医学整合课程体系的实践》、袁力的《中美大学本科课程体系比较及启示》、于歆杰的《麻省理工学院教育教学考察报告（二）――培养方案与课程设置篇》、蒋景华《麻省理工学院培养创新人才特色做法的分析研究》等，但关于国外生命科学人才培养模式的文章很少，只检索到肖尊安的《浅析国外大学生物科学人才的培养》和夏薇的《麻省理工学院和清华大学生物学专业课程设置比较》等。近年来我国的高等生命科学人才培养已加快了改革和调整的步伐并取得了一些成果。清华大学、北京大学生命科学人才培养与科学研究改革试点已经考试启动，其总目标是：在清华大学生命科学中心和北京大学生命科学中心的基础上，建立生命科学人才培养与科学研究改革试点（简称改革试点），两个中心研究方向各有侧重，优势互补，资源共用，统一实施和管理，并为实现该目标制定了明确的改革措施。吉林大学、浙江大学、武汉大学等国内一流大学已经纷纷开始进行生命科学学生国际化培养模式的改革。而分子生物学做为现代生命科学的基础学科，发展异常迅猛，以分子生物学课程为探索国际化培养模式的试点非常必要。因此，我们在辽宁大学生命科学院以中英双语教学课程分子生物学课程为例，进行了一系列的改革措施，借以探索生命科学本科学生的国际化培养模式。

一、改革的目标及具体改革内容

以分子生物学课程的国际化实践为试点，为进行辽宁大学生命科学院现代生命科学国际化人才培养模式的探讨提供参考。

1.教学理念方面的改革：分子生物学课程是一门崭新的课程，作为现代生命科学的基础学科，发展异常迅猛。这就要求分子生物课程的教学理念也要符合其发展特点。在教学理念上破除陈旧的照本宣科和一成不变的教学模式，发挥教师的主动性和创新性，鼓励教师从自己的学术科研实践出发，把前沿的学科发展动态同教材内容相结合，拓宽专业教育范围，把培养国际型实用人才做为教学理念贯穿整个教学过程。

2.教学内容方面的改革：分子生物学的前沿发展非常深入和迅速，这就要求分子生物学教学内容设置的最重要的标准必须是强调教材内容的先进性，这样才能保证所传授的内容不落伍。改变之前所用传统分子生物学的中文教材，通过使用与国际接轨的先进教材《Molecular Biology of the Gene》（科学出版社，J.D.，沃森等编著，杨焕明等译），以及自制的以该教材英文版为参考的全英文PPT课件，使教学的内容始终保持与学科的前沿发展契合（图1）。同时在每学期的教学中都根据学科发展的现状，合理并及时运用该教材编撰者在冷泉港实验室随时更新的最新的分子生物学教学动画及其他教学材料（图2），以及哈佛大学或麻省理工学院相关课程的教学辅助参考资料，这样做到随时进行知识更新，以跟进教材更新和修订周期中的学科发展动态，激发学生的学习积极性。

3.教学方法方面的改革：分子生物学是一门理论和教学结合非常紧密的学科。任何一个知识点都从具体的实验数据得来，而学术和实验能力是分子生物学教学的一个重要指标。在教学实践中理论部分利用研究式、讨论式（如第三四五章分子间的弱相互作用重要性的讨论，为分子生物学相关化学基础知识，由讨论课形式完成）、启发式、等教学方法，以解决问题为出发点，将某些相关的理论形成过程分析出来，并就形成过程中的一些关键知识点提出问题，促进学生思考，培养学生的学术研究精神。另外，开展多彩多样的课外活动，包括小型研究课题、实验技术训练和知识拓展讲座等。同时，开展“本科生导师制”工作，鼓励学生参与任课教师的学术科研实践，以实现教学与科研相互促进的目标。

4.考核标准改革：改变原考试只重视期末考试卷面成绩的做法，分子生物学考试改革改为出勤率、平时学术小论文报告、课堂讨论及发表并结合期末卷面成绩的做法，监督和培养学生平时夯实学习基础知识的好习惯，并激发学生的创新思维能力的培养。

二、具体实施方案

1.建立国际化的教学队伍与科学、公正的评价制度：引进具有国际化背景的分子生物学专业的教师承担部分教学任务，通过开展广泛的讨论与监督，评价学生对该学科的学习成果。

2.寓教于研，建立国际化的拔尖创新人才的培养体系：以辽宁大学本科生导师制度为依托，吸引优秀的本科学生参与到任课教师的学术实践中。通过课题中子课题任务的承担和参与，强化其对分子生物学课程的理解，提高其兴趣。

3.制定国际化的分子生物学课程教学指导方案。构建国际化的本科生培养方案，将为提高研究生的国际竞争能力奠定坚实的基础。通过借鉴国外高水平生命科学学科的课程体系，进一步优化了课程结构，制定符合自身特色的本科生国际化培养方案。

4.开展多种形式的国际化学术交流活动。辽宁大学生命科学院的承担分子生物学及相关课程如基因工程、分子遗传学、细胞生物学以及细胞信号转导等专业的任课教师绝大多数都有海外工作或者留学经历，并且与国外保持着密切的联系。分子生物学教研室充分利用这些教师资源，利用辽宁大学的“暑假小学期”制度，定期邀请国内外分子生物学相关领域的专家及学者来院讲学及交流，为学生开设各种形式的前沿讲座和报告。这些措施使学生能够与外籍专家近距离的交流和学习，让学生能深刻体会到国外先进的教育理念和教学方式，感受国外先进的教育理念和教学方式，领略国际一流学者的风度和学识，从而激发学生的求知欲，为他们在国际学术舞台上展现自己的渴望增加了助力。

通过以上改革，学生对分子生物学课程学习的兴趣显著提升，课堂出勤率显著增加，学习成绩也有大幅度提高。同时，通过对分子生物学课程学习的引导，学生对分子生物学相关学科如细胞生物学、分子遗传学等以及其他生命科学学科产生了浓厚的兴趣，对提振生命科学本科学生的学习风气起到了积极的促进作用。学生的国际化视野得到了拓展，用英语讨论分子生物学学术研究热点的能力得到了锻炼，对国际学术环境有了较为整体的了解，而这些也使得本院本科生在联系国际知名大学继续求学深造的过程中竞争力大大提高，并且陆续获得了美国和日本等国际知名大学的录取。通过以上实践，希望我们的分子生物学课程教学改革对生命科学国际化人才培养模式能有所参考。

参考文献：

第9篇：分子生物学研究范文

百日草（zinnia elegans）属菊科百日草属的1a生草本植物，是重要的园林观赏花卉；其叶片花序可入药，有消炎，祛湿热的作用。在吉林农业科技学院校园内种植有大量的百日草，调查发现百日草白粉病发生较为严重，主要危害植株的叶、叶柄和花瓣，孢子堆生于叶片正、反面 、叶柄和花瓣上。发病初期，叶面出现零星的白色小粉斑，扩大后为圆形病斑，白粉斑可相互连接成片，有时白粉层覆盖整个叶片[1]。目前国内尚未见关于百日草白粉病无性孢子生物学特性的系统研究报道[2-3]，为此，本试验为百日草白粉病无性孢子生物学特性进行研究，为防治百日草白粉病提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

百日草白粉病无性孢子采自百日草白粉病无性孢子采自新城局农业站院内发生白粉病的百日草的病叶上；供试碳源为蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、淀粉；供试氮源为谷氨酸、硝酸钠、硝酸铵、硝酸钙、氯化铵、尿素；其他本文由收集整理材料有0.1%naoh溶液、0.1%hcl溶液等。

1.2试验方法

1.2.1 不同温度培养条件对孢子萌发的影响

取新鲜的洋葱表皮1㎝×1㎝，在75%酒精中浸泡1周，再取出洋葱表皮放入无菌水中清洗。用清洗过的洋葱表皮蘸取适量的百日草病叶上的白粉病无性孢子，在显微镜4倍镜下单一视野内孢子数量不少于30个，观察记录总数不少于200个。将蘸有病菌无性孢子的洋葱表皮置于盛有无菌水的培养皿中，每个培养皿3片。将培养皿分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒温生化培养箱（shp-1500，中国上海精宏有限公司）中，共7个处理，3次重复，培养48h后，将洋葱表皮置于载玻片上在显微镜下观察并记录孢子萌况。

1.2.2 不同光照培养条件对孢子萌发的影响

按照2.2.1的方法将蘸有病菌无性孢子的洋葱表皮置于盛有无菌水的培养皿中，分别置于全光照、全黑暗、光暗交替条件下于恒温生化培养箱中[4]，共3个处理，3次重复，培养48h后，将洋葱表皮置于载玻片上在显微镜下观察并记录孢子萌况。

1.2.3 不同ph培养条件对孢子萌发的影响

按照2.2.1的方法将蘸有病菌无性孢子的洋葱表皮分别置于盛有以0.1%naoh溶液和0.1%hcl溶液配置的ph为4、5、6、7、8、9、10的培养皿中[5-6]，共7个处理，3次重复，置于25℃恒温生化培养箱中培养48h后，将洋葱表皮置于载玻片上在显微镜下观察并记录孢子萌况。

1.2.4 不同碳源培养条件对孢子萌发的影响

按照2.2.1的方法将蘸有病菌无性孢子的洋葱表皮置于盛有0.5%葡萄糖溶液的培养皿中，每个培养皿3片。再分别以蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉代替葡萄糖，共5个处理，3次重复，置于25℃恒温生化培养箱中培养48h后，将洋葱表皮置于载玻片上在显微镜下观察并记录孢子萌况。

1.2.5 不同氮源培养条件对孢子萌发的影响

按照2.2.1的方法将蘸有病菌无性孢子的洋葱表皮置于盛有0.2%谷氨酸溶液的培养皿中。再分别以硝酸钠、硝酸铵、硝酸钙、氯化铵、尿素代替谷氨酸，共6个处理，3次重复，置于25℃恒温生化培养箱中培养48h后，将洋葱表皮置于载玻片上在显微镜下观察并记录孢子萌况。

2 结果与分析

不同温度培养条件对孢子萌发的影响 见表1。

由表1可见，不同温度对孢子萌发率有较大的影响，其中25℃处理与其它处理间有显著性差异，但并未达到极显著水平。所以，25℃更适于百日草白粉病无性孢子的萌发。其中5℃、10℃、35℃萌发率极低，说明低温及高温对孢子萌发有抑制作用。

不同光照培养条件对孢子萌发的影响 见表2。

由表2可见，记录的数据经数理统计分析后，光暗交替与全光照、全黑暗有显著性差异，但无极显著性差异；全光照与全黑暗之间无差异。因此最适光照条件为光暗交替。

2.3 不同ph值培养条件对孢子萌发的影响 见表3。

由表3可见，在ph=4～10范围内均可萌发，其中ph=8与其它处理间差异显著。孢子萌发率最快即为孢子萌发最适ph值。ph=4、ph=10的处理孢子萌发率较低，说明强酸，强碱对孢子萌发有抑制作用。

2.4 不同碳源培养条件对孢子萌发的影响

见表4。

由表4可见，记录数据经分析后得，孢子萌发率：淀粉>葡萄糖>乳糖>蔗糖>麦芽糖，其中淀粉处理萌发率最高，为60.97%。淀粉、葡萄糖、乳糖处理差异不显著，所以孢子萌发适宜碳源为葡萄糖、乳糖，最适碳源为淀粉。

由表5可见，在各种氮源的培养液中，孢子均能萌发，尤以硝酸钙为氮源的处理孢子萌发率最高。且硝酸钙与氯化铵、硝酸铵、硝酸钠、尿素、谷氨酸处理间有显著性差异。因此硝酸铵为最适氮源。