传统工艺陈醋发酵及熏蒸过程中变化分析

摘要：该研究分析了山西老陈醋在传统工艺发酵过程中淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶酶活变化，并对发酵及熏蒸过程中淀粉、总糖、酒精度、总酸、有机酸和氨基酸等常规成分的变化规律与形成机理进行了探讨。结果表明，酒精发酵阶段，4种酶活力变化不大，醋酸发酵阶段，4种酶活力均有所降低；发酵及熏蒸过程中淀粉含量由64.05%降至18.88%；酒精发酵阶段，总糖含量从11.88%降至1.12%，醋酸发酵阶段，总糖含量从2.28%增至7.35%，熏蒸阶段，总糖含量从7.13%降至5.89%；酒精含量在酒精发酵过程中从1.3%vol增至5.7%vol，到发酵22d时几乎降为0；总酸含量在1～22d内从1.17%增至10.23%；在发酵及熏蒸过程中醋酸含量从1.03mg/g增至76.25mg/g；酒精发酵阶段，乳酸含量从1.94mg/g增至60.60mg/g，随后含量变化较小。

关键词：山西老陈醋；传统工艺；常规成分；分析

山西老陈醋是我国传统的四大名醋之一，其独特生产工艺的确立已有300多年的历史，被列为部级非物质文化遗产，产品具有有机酸组成丰富、氨基酸含量高、品质和风味优良等特点[1]。山西老陈醋的传统生产工艺，以高粱、麸皮为主要原料，以谷糠为辅料，以大麦、豌豆为原料制作的大曲作为糖化发酵剂，高粱、大曲、麸皮和谷糠的比例为100:62.5:70:100，生产工艺包括原料处理、拌曲、（糖化）酒精发酵、醋酸发酵、熏蒸（醋醅）、淋醋、陈酿等步骤[1]。整个生产过程，除淋醋和陈酿阶段外，历经31d，其中1～16d为酒精发酵，17～25d为醋酸发酵，26～31d为熏蒸。其中熏蒸是传统山西老陈醋生产中一道特有的工序，在这一过程中醋醅由黄色变为深褐色，能增加醋的色泽和焦香味，对传统山西老陈醋色、香、味的形成具有重要的作用关于食醋生产过程中常规成分的变化分析已有很多报道[3-9]。但对山西老陈醋在发酵及熏蒸过程中常规成分的变化研究报道很少。本研究分析了山西老陈醋在发酵及熏蒸过程中糖化酶、淀粉酶和蛋白酶等酶活变化，并对发酵及熏蒸过程中淀粉、总糖、还原糖、酒精度、总酸、有机酸和氨基酸态氮等成分变化规律与形成机理进行了分析。研究结果对山西老陈醋传统生产工艺的改良具有指导意义。

1材料与方法

1.1材料与试剂

实验样品均取自山西老陈醋集团有限公司传统工艺生产车间。在发酵的第1、3、5、8、11、14、16天（酒精发酵）采集酒醪样品；第17天、19～25天（醋酸发酵）采集醋醅样品；第27～31天（熏蒸阶段）采集熏醅样品。NaOH、甲醇、冰醋酸、CHCl3、乙酸乙酯（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙酸、乳酸、柠檬酸（均为优级纯）：美国Sigma公司；蒽酮（分析纯）：上海试剂一厂。

1.2仪器与设备

Z-5000型原子吸收分光光度计：日本日立株式会社；AF-610B型原子荧光分光光度计：北京瑞丽仪器有限公司；L-8000型全自动氨基酸分析仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；Waters2695型高效液相色谱仪：美国Waters公司；HC-2062型高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1淀粉酶、糖化酶和蛋白酶活力的测定

淀粉酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dini-trosalicylicacid，DNS）比色法[10]，以1g物料在40℃，pH5.6的条件下，每1min水解得到的还原糖的量为一个总淀粉酶活力单位（U/g）。糖化酶活力的测定参照GB8276—2006《食品添加剂糖化酶制剂》的方法进行[11]，并略有改动，以1g物料在40℃，pH4.6的条件下，每1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖为一个糖化酶活力单位（U/g）。蛋白酶活力的测定参照国标GB/T23527—2009《蛋白酶制剂》中的福林比色法[12]，以1g物料在40℃，pH3.0或pH7.2，每1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个酸性或中性蛋白酶活力单位（U/g）。

1.3.2理化指标的测定

水分含量的测定参照GB5009.3—2010《食品中水分的测定》中的105℃恒质量法[13]；淀粉含量的测定参照GB/T5514—2008《粮食、油料中淀粉含量测定》中酶水解法[14]；蛋白质含量的测定参照GB5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中的自动凯氏定氮仪法[15]；脂肪含量的测定参照GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的测定》中索氏抽提法[16]；总糖的测定采用蒽酮比色法[17]；还原糖、总酸、氨基酸态氮的测定分别参照GB/T5009.7—2008《食品中还原糖的测定》中的菲林试剂法[18]、GB/T5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》中的酸碱滴定法[19]和GB/T5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》的甲醛滴定法[20]进行；酒精度的测定采用酒精计法。

1.3.3游离氨基酸的测定

游离氨基酸的测定参照GB/T5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》的方法进行[21]。酒醪、醋醅和熏醅样品经蒸馏水浸提后，过滤得到的溶液定容至250mL，作为待测液。取1mL待测液用6mol/L的HCl稀释一倍，过0.45μm滤膜后，用于氨基酸自动分析仪测定样品中的氨基酸含量。

1.3.4有机酸的分析

有机酸的测定采用GB/T5009.157—2003《食品中有机酸的测定》中的高效液相色谱法[22]。色谱条件：SpursilC18-EP色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：20mmol/L的KH2PO4溶液（pH2.5）；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器，检测波长210nm。

2结果与分析

2.1发酵阶段淀粉酶、糖化酶和蛋白酶的活力变化

淀粉酶、糖化酶和蛋白酶是参与谷物食醋酿造的主要酶类，本实验对酒精和醋酸发酵过程中这几种酶的活力进行了检测，山西老陈醋在传统工艺的酒精发酵（1～16d）与醋酸发酵（17～25d）过程中，淀粉酶和糖化酶的活力较高，最高分别为438.94U/g和257.23U/g，而酸性和中性蛋白酶活力较低，分别只有64.56U/g和27.40U/g。4种酶活在酒精和醋酸发酵阶段略有变化但基本稳定，且酒精发酵阶段的酶活明显高于醋酸发酵阶段，这与醋酸发酵阶段加入了麸皮和谷糠的稀释作用有关，也可能与此阶段大量产生醋酸有关。

2.2发酵及熏蒸过程中的变化

对传统山西老陈醋发酵及熏蒸过程中水分、淀粉、总糖、还原糖、酒精度、总酸、氨基态氮等的变化进行了分析，在醋酸发酵阶段（17～25d），水分含量稳定在62%～63%，淀粉由35.10%下降至27.48%（干质量），总糖含量从2.28%增加至7.35%，还原糖含量从4.70%增加至8.54%，总酸在第22天达到最高，为10.23%。在此阶段，淀粉酶和糖化酶仍有一定活力（图1），可将淀粉继续水解为糖，但醋酸菌是该阶段的优势菌种，它能迅速氧化酒精生成乙酸，并降低pH值，抑制其它微生物生长，因此糖类物质被利用较少，含量均略有增加。酒精在醋酸菌作用下迅速转化为醋酸，至第22天已检测不到；对应地总酸含量在第22天达到最高不再增加。由于醋酸发酵阶段蛋白酶的活力很低（图1），所以蛋白质和氨基酸态氮含量变化很小。熏蒸（27～31d）是一个加热的过程，水分由于蒸发作用而明显降低（64.2%～57.2%）；淀粉由于加热和有机酸存在，由27.65%下降至18.88%（干质量）；因美拉德反应，还原糖和氨基酸含量分别由7.75%和0.41%下降至2.91%和0.28%；总糖略有减少，脂肪和蛋白质含量基本不变，总酸含量增加，但不明显。

2.3发酵及熏蒸过程中氨基酸的变化在传统山西老陈醋的在酒精与醋酸发酵

以及熏蒸过程中能检测到至少20种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸，各种氨基酸含量的变化趋势大致可以归纳为：酒精发酵过程中有不同程度的增加，醋酸发酵过程中变化不大，熏蒸阶段有不同程度的降低。结合图1的结果，在酒精发酵阶段氨基酸的增加主要是蛋白酶分解蛋白质产生的，所以除赖氨酸、组氨酸和鸟氨酸外，其他氨基酸含量均有所增加。而赖氨酸、组氨酸和鸟氨酸含量减少，主要是这些氨基酸在高粱等谷物蛋白中总量较少[24]，同时参与微生物（如酵母菌）菌体生长代谢所致。在醋酸发酵过程中，蛋白酶活力降低，而氨基酸仍需参与微生物（如醋酸菌）菌体的生长代谢，因此，含量较高的氨基酸变化较小，含量较低的氨基酸（如赖氨酸）显著降低。在熏蒸过程中，由于氨基酸和还原糖的美拉德反应，因此，各种氨基酸的含量均有所降低。

2.4发酵及熏蒸过程中有机酸的变化分析

酸味物质是食醋中的主要组成成分，有机酸是酸味的主要来源，其种类、含量及其相互比例与食醋的质量密切相关[25]。本实验采用师晶晶[5]建立的山西老陈醋中有机酸的分析方法，对传统山西老陈醋发酵及熏蒸过程中醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、丙酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸进行了测定，醋酸和乳酸是传统山西老陈醋生产过程中含量变化最大的两种有机酸。在酒精发酵过程中，乳酸是主要的有机酸，醋酸含量在酒精发酵初期也有所增加。醋酸发酵前期，醋酸含量增加明显，后期（22～25d）基本保持不变，从工艺改良的角度出发，醋酸发酵的时间可缩短到第22天，总发酵时间可缩短4d。由于酒精发酵的4～16d主要是厌氧发酵，因此乳酸菌能产生大量乳酸。这与吴佳佳[23]从山西老陈醋的发酵酒醪中分离到了很多乳酸菌，并随着酒精发酵时间延长，乳酸菌的种类增多的结果相吻合。在醋酸发酵阶段，由于麸皮、谷糠添加的稀释作用，在初期（17d）醋酸和乳酸含量迅速降低，但由于醋酸菌的接入和通气量的增加，酒精转化成醋酸，使醋酸的含量快速上升，成为最主要的有机酸。而在熏蒸阶段醋酸和乳酸的含量均略有升高。酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸，在整个生产过程中，基本呈现先升高，后降低，再升高的趋势。在醋酸发酵和熏蒸过程中，酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸的含量增加，这可能与微生物的发酵和熏蒸过程中水分的蒸发有关。丙酸在第3天时含量达到10.47mg/g，随后降低；第17天向酒醪中添加麸皮和谷糠，丙酸含量明显升高，这可能是因为填充料带入了一部分丙酸造成的；但第19天其含量突然降低，具体原因仍需进一步探讨，在熏蒸过程中，丙酸的含量降低。

3结论

酒精发酵阶段，淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶的活力虽然呈现出高-低-高的趋势，但基本稳定。在山西老陈醋的传统工艺中，曲的用量非常大（高粱与大曲质量比为100∶62.5），大曲除了是微生物（霉菌、酵母菌、醋酸菌等）的载体外，也是酶制剂，曲中淀粉酶等水解酶迅速分解淀粉变成糖，总糖和还原糖也在酒精发酵阶段的第1天最高。所以酒精发酵阶段的水解酶主要来自大曲，后期酶活稍有升高，可能是霉菌等微生物生长产生的。在醋酸发酵阶段，由于添加了麸皮和谷糠，酒醪被稀释，同时醋酸菌发酵产酸，pH降低，酶活受到抑制，因此，各水解酶的活力均有所降低。由于酵母等微生物生长代谢，总糖、还原糖含量在酒精发酵阶段不断降低；而在醋酸发酵阶段略有增加的原因，可能是在此阶段糖化酶和淀粉酶仍具有一定的活性，可继续水解淀粉产生寡糖和单糖，而醋酸菌等微生物较少利用它们；在熏蒸阶段又降低，由于还原糖和氨基酸在加热的情况下，易发生美拉德反应，消耗了糖类。酒精含量在酒精发酵的第1～11天上升，在酒精发酵后期（14～16d）保持稳定，在醋酸发酵第4天时检测不出，酒精发酵的时间可缩短2d。总酸含量从第1～22天增加，而从第23～31天其含量变化不明显。氨基酸在酒精发酵过程中含量明显增加，此阶段蛋白酶的活力较强，能分解蛋白质产生小分子肽和游离氨基酸；氨基酸含量在醋酸发酵过程中变化较小，此阶段蛋白酶活力显著降低，能少量分解蛋白质生成氨基酸；熏蒸过程中氨基酸含量有不同程度的降低，由于氨基酸和还原糖在加热的条件下易发生美拉德反应，消耗了氨基酸。醋酸是山西老陈醋中的主要成分，在醋酸发酵前期和熏蒸过程中含量明显增加，在醋酸发酵后期（22～25d）基本保持不变，醋酸发酵的时间可缩短到第22天，总发酵时间可缩短6d。乳酸主要在酒精发酵过程中产生，在醋酸发酵和熏蒸过程中变化较小。其他有机酸在发酵及熏蒸过程中含量较低，变化较小。

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作者:陈涛 桂青 郭俊陆 王正刚 陈福生 单位:华中农业大学食品科技学院 中国热带农业科学院椰子研究所 山西老陈醋集团有限公司 环境食品学教育部重点实验室