微生物多样性研究精选(九篇)

第1篇：微生物多样性研究范文

【摘要】随着分子生物学、基因组学和生物信息学的发展，微生物的分子水平上的研究也取得了快速发展，与其他方法相比，其灵敏度高、可重复好和可靠性好，是目前应用最广泛的方法之一。

【关键词】分子生物学；技术；肠道微生物

【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1005-1074(2009)04-0032-01

人体肠道中寄生着种类繁多和数量巨大的微生物，构成了肠道微生态体系。这正常情况下，这些微生物对机体无害，或有利于机体的健康，为正常菌群。正常菌群参与宿主对营养素的消化、吸收与合成；刺激其免疫机制。这种与宿主的肠道相互依存又相互影响的关系形成了动态的微生物平衡[1]。微生物学研究表明，环境条件的轻微变化，均可导致机体微生态系统的变化，造成菌群的失调，对宿主的肠道功能产生不良影响[2]。肠道微生态的破坏，还可引起内外源性感染，干扰机体营养代谢和免疫功能，甚至严重影响机体健康，导致一系列疾病的发生。随着分子生物学、基因组学和生物信息学的发展，微生物的分子水平上的研究也取得了快速发展，与其他方法相比，其灵敏度高、可重复好和可靠性好，是目前应用最广泛的方法之一。

1肠道微生物总DNA的提取

肠道微生物总DNA的提取是研究胃肠道微生态系统的基础，只有获得尽可能完整的DNA模板才能为后续分析提供可信性。目前获得肠道菌群总DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法，以及近年来一些大型公司推出的商业试剂盒。酚/氯仿抽提法间接从样品中获取基因组DNA是实验室常用提取细菌DNA的方法，金晶等[3]通过对酚/氯仿法提取肠道微生物总DNA进行优化，得到了基本完整的基因组DNA.这一经典的技术由于其操作过程不需要特殊的仪器设备，得到的DNA纯度相对较高，被广泛的应用。

2肠道微生物基因片段获取

Sharles等于1990年在E.Coli基因组中发现的一种基因间重复保守序列，大小约为126bp。1991年，Hulton等在Salmonella typhimurium，Yersinia pseudo- tuberculosis，Klebsiella pneumoniae和Vibrio cholerae中也发现这种高度保守的重复序列，由于该序列主要存在与肠杆菌科，故称之为肠杆菌基因间的重复共有序列（Enterobacterial repetitive intergenic，ERIC）。Versalovic等认为ERIC-PCR扩增的是两个相邻的ERIC保守序列之间的区域，由于不同的细菌基因组上的ERIC重复序列的数目和分布不同，从而得到由一系列大小不同片段组成的DNA指纹图谱不同地域和不同年代的同一株菌其指纹图谱一样，不同的方法提取基因组DNA，图谱具有良好的可重复性。潘莉等[4]为了了解以粪检有无白细胞区分的两类腹泻儿童肠道菌群结构的特征及其与健康儿童的差别，应用ERIC-PCR对其肠道微生物总DNA进行扩增，结果分析发现了一段与腹泻相关的未知基因序列。在检测运动员不同训练强度下肠道菌群结果变化ERIC-PCR也能取得很好的结果[5]。

3DNA遗传指纹图谱技术分析

3.1变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(Denaturing GradientGel Electrophoresis，DGGE)是由Fisher和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其原理是利用长度相同的双链DN段解链温度的不同，通过梯度变性胶将DN段分离开来。DGGE可以用来检测除最高温度解链区域以外的所有发生单个碱基变化的DN段。另一个基于相似原理的技术，称为温度梯度凝胶电泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TGGE)，与DGGE的不同之处在于不是变性剂呈现线性梯度，而是温度呈现线性梯度，使得不同的核酸序列停留在凝胶的不同位置从而得以分离。该技术很突出的优点：可以分离具有细微差异的基因组片段；从凝胶中切下谱带，然后测序分析来揭示群落成员系统发育的从属关系，检测出特异细菌种群的存在；具有同时检测多个样品，可以对不同样品进行比较。

3.2限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。该技术是利用限制性内切酶能识别DNA 分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段，于是电泳图谱呈现多态性。末端限制性片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisn，T-RFLP)与RFLP相似，只是在 PCR 引物末端标记荧光，扩增的基因片段被限制性内切酶消化后，那些带有荧光标记的末端限制性片段就可在DNA测序仪上检测出来。Cecilia等[6]利用T-RFLP技术分析抗生素治疗和服用益生菌产品对人类肠道微生物区系的影响，结果表明T-RFLP技术易于监控部分优势菌群，但是利用培养技术却很实现对它们的监控。

3.3分子杂交技术-荧光原位杂交荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)是在 20 世纪80 年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。基本原理是：如果被检测的细菌基因组DNA纤维切片上的靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。该法具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点。人体肠道微生态系统的动态平衡对生理、健康有着重要作用，分子生物学技术的快速发展使研究人体肠道微生物各种群的数量、结构及动态变化更为直接和精确。当然，分子生物学技术人目前尚有一些缺陷，在与传统的培养鉴定方法方法结合使用，将能够在人体胃肠道复杂的微生物生态研究中发挥重要的作用。

参考文献

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第2篇：微生物多样性研究范文

1.1PCR核酸技术

PCR核酸技术是构成分子生物技术的核心技术，也是整个技术中最具有广阔应用前景的一项实用技术。PCR核酸技术由三部分构成：PCR-SSCP技术、PCR-DGGE技术及PCR-RFLP技术。a)PCR-SSCP技术是PCR核酸技术的一个重要构成，通过将银染方法技术和荧光检测技术结合研究，对SSCP凝胶DNA谱带结构的高效率方法进行合理优化分析，使整个SSCP凝胶DNA谱带结构获得保障，进而通过检测分析提取的环境样品的试验对应内容，通过提取出环境样本中的DNA组别对整个试验后续过程进行有效分析[1]；b)PCR-DGGE技术是对生命物理学内容的实际应用，按照一定顺序检测生命物质碱基，获得变性试剂解链不同的内容物质反映，对样本进行检测，达到研究目的。可以从环境样本中提出相关样本基因组别的DNA，为后续试验提供样本。按照PCR扩增原理扩增样本DNA数量，保障目标基因组的数量；c)PCR-RFLP技术虽然也属于PCR核酸技术，但与上述两种技术相比有较大不同。PCR-RFLP技术通过利用限制性核酸内切酶，对不同位置在特异的位点上结合，进行有关的DNA识别，通过识别试验了解DNA的双链结构，分析整个试验。这项试验的具体操作方法是通过在被当作引物的物质内，单独添加项目标记，使这个标记项目具有位置的一定性，这项标记可以在后续实验中作相应的类型对比参照，在进行DNA结构切割实验的过程时，需要对样本内采用相应的限制性核酸内切酶，得到相应的DNA双链片段[2]。

1.2PCR的测线技术研究

微生物环境技术研究需要按照生物学有关内容，利用分子生物技术使微生物环境中能偶分离出一些崭新的、有价值的研究群体或不同类型种类的生命特征。因而对微生物环境中各品种、各类别和种类的确定，可以为新微生物群体的发现提供有力的技术保障，使PCR测序技术能够在微生物环境检测中发挥实际应用价值。

1.3基因探针测试技术的研究

基因探针是通过对微生物环境中的特异性研究，对单链DNA的片段进行序列研究，在结合解链的相关操作步骤中，根据碱基结构生物学的互补原理，对微生物环境中提取的样品进行相应交互反应对照观察。在提取的微生物样本中微生物基因探针上进行相应位置标记，可以在微生物繁殖过程中进行有效对比观察，使微生物环境中生物技术的发展获得有效、直观的保障[3]。

2分子生物技术在环境工程微生物领域中的应用

2.1环境排放对微生物多样性的影响

自然环境中存在数量众多的生物种类，生物结构和类型存在很大不同。众多生物的结构微小，不容易被直接观察到，却广泛地生存在生物介质如河流的底泥、污水等处，这些被统称为微生物。随着工业的快速发展，环境污染逐渐加重，使微生物的生物学结构发生一定程度变化。在保障环境治理的同时，也要对微生物进行观察和了解，通过与环境因素的有效结合，使微生物研究获得有研究价值的资料。要了解环境首先要从环境的生物群上进行研究，要治理环境就要从环境工程的微生物群种中进行研究，选取相应方法技术，提供有价值的研究数据。在生活、生产中的垃圾排放要进行管理和规划，控制垃圾排放对微生物生物结构变化产生的影响，保障微生物群的多样性和生物学良性发展。

2.2对污染物的降解作用

现代工业的快速发展使污染物增多，严重地破坏了生态环境。其中有的化学物质很难被有效清除，对环境的影响有直接的破坏作用，分子生物技术是可以通过微生物对环境的影响使环境的结构产生一定变化，为污染物的降解提供新的解决途径。中国的分子生物技术需要根据时展的客观需要，研究微生物修复的相关机制，得到微生物改善土壤和水质的有效性方法，这种降解过程与传统降解过程相比具有对生态环境保护和协调作用。

2.3石油降解技术应用

中国工业发展的重要特点是能源消耗速度快，社会发展离不开能源。目前环境污染治理与工业发展速度不协调，石油等能源污染问题使环境治理工作的难度加大。石油污染的类型是多种多样的，污染可以出现在石油生产中，也可以出现在海上石油平台，多种多样的污染问题使污染处理困难重重。分子生物技术可以在石油降解工作发挥很大作用，分子生物技术比传统降解技术具有多种优势且成本相对低廉，应大力发展分子生物技术和石油降解的相关研究。

3结语

第3篇：微生物多样性研究范文

污水微生物群在CR-DGGE技术改变下与既有技术有很大差异，在这个过程中研究人员有了新的认识。污水中的好氧细菌群落结构和功能在温度升高时会发生很大变化。运用DGGE技术我们可以分析出，不同温度环境会存在不同的细菌群落。在同等的工作环境下，使用PCR-DGGE技术，跟踪分使用低温菌、常温菌分别接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构，进行及时动态观察。在相同工艺条件下，对低温菌群与常温菌群进行相同的操作，结果是：产生的微生物群结构有很强的相似性。随着时间的推移，这两类菌群在结构上的相似度越来越强。去除污水中的氨和氮主要使用硝化方法。在这种硝化作用过程中氨氧化细菌负责将氨氧成亚硝酸盐。

这种实现亚硝化作用过程是硝化过程中重要的步骤。所使用的氨氧化细菌具有生长速度低、相对生物种群较少的特点。传统的细菌分离、培养、分析方法，会消耗工作人员大量的时间。采用PCR扩增16SrDNA、功能基因并且随机克隆测序等相关技术手段。在高浓度氨氮废水处理系统的不同时间，分析并且处理活性污泥样品、氨氧化细菌的种类和氨单加氧酶的活性。御用PCR-DGGE相结合的技术，针对样品将总细菌群进行差异性研究。实验证明，PCR-DGGE技术可以使我们更为深入、全面的了解氨氧化细菌的类群及其相关功能。

应用PCR-DGGE工艺对城市污水处理与完全混合的传统式处理工艺进行了相关的实验对比。在同一反应器的不同位置，微生物群的分布、不同工况下的微生物种群结构进行了相关的分析、研究。研究表明，这两种污水处理工艺中的微生物种群都具有很强的多样性，区别是：两者种群的结构差异巨大。采用生物滴滤反应器与生物滤池处理相同的污水，然后采用PCR-DGGE研究不同反应器或反应器的不同位置中氨氧化细菌菌群的组成。种群对反应器的形式或者位置的差异没有任何依赖性，不会随这些因素变化而变化。

二、PCR-DGGE技术在废气生物处理中的应用

生物滤池与生物滤塔是处理臭味、异味行之有效的好办法，这种生物过滤技术可以对恶臭与挥发性油剂废气体很好的遏制，从而该技术能够很快的推广。在除臭生物滤池中较强酸性与中性两种不同运行环境下，运用PCR-DGGE技术研究，可以发现：微生物种群的多样性与生物种群结构上发生的改变。利用扩增细菌16SrRNA基因的V3可变区，运用相关技术分析滤池内的种群变化。回收有研究意义的DN段，与PCR测序、T载体克隆测序有效的结合。最终确定众多种群中的优势菌群。微生物对强酸性环境有很大影响；中性条件下的微生物种群更为丰富。此外，滤池的层次上的差异，也导致了种群空间分布的差异性。

实验证明，除臭过程中硫氧化细菌占有相对明显的优势。影响生物滤塔处理效率以及反应器的稳定运行的主要因素是塔中的微生物种群的结构，以及微生物的多样性。我们可以采用DGGE技术，对处理含氨废气的生物滤塔中的微生物进行多样性研究。随时间的推移，对反应器不同填料、不同时期微生物多样性比对研究。证明：微生物的多样性与反应器运行时间的长短有直接关系，随着时间的不断延长其多样性会有所降低；将填料方法进行对比可知：如果是堆肥填料，其微生物多样性更为丰富，反应器也能达到很好的效果。

三、PCR-DGGE技术在污泥生物处理中的应用

污泥的稳定化在污泥处理过程中是一个相当重要的过程。在此过程当中，微生物的稳定对于整个污泥系统的稳定起到了至关重要的作用。专家们采用DGGE指纹图谱技术，研究污泥堆肥工艺中的细菌种群动态变化和种群的多样性。研究证明：生物法污泥堆肥时间不大于8d。采用DGGE指纹图谱与相似性系数Cs值对污泥堆肥各工艺环节样品进行相关分析，可以发现，反应时间的持续，导致了微生态结构的Cs值逐渐增高。这说明：微生物种群结构会逐渐趋于稳定状态。污泥微生态种群可以迅速进行选择，进而调整内部细菌种群数量和结构。

四、总结

第4篇：微生物多样性研究范文

临床研究[4]发现，人类对感染性疾病的敏感性与个体年龄有关，一些疾病主要发生在幼儿，而另一些疾病主要发生在成年人和老年人。目前关于微生物多样性的研究多局限于人体某一特定发育阶段[5]，并不能代表整个人群的真实情况；因此，针对不同年龄阶段人群进行采样分析，对于全面认识微生物的组成具有重要意义。

人类口腔是一个非均质的环境，既有非脱落固体表面（如牙齿），也有脱落表面。口腔黏膜为口腔内的脱落表面，该生境表面上皮细胞持续脱落可使黏附的细菌快速更替[6]。了解口腔黏膜表面微生物群落的组成对黏膜感染性疾病的诊断和防治具有重要意义[7]。本试验以口腔黏膜疾病好发部位——颊黏膜[8]为研究对象，采用聚合酶链式反应（polyme-rase chain reaction，PCR）-变性梯度凝胶电泳（de-naturing gradient gel electrophoresis，DGGE）指纹图谱技术对不同年龄及牙列阶段人群颊黏膜样本进行研究，通过分析不同年龄及牙列阶段人群颊黏膜微生物的多样性，探索颊黏膜微生物群落组成随年龄产生的演替趋势。

1 材料和方法

1.1 研究对象的选择

从四川大学华西口腔医院初诊人群中纳入25例健康研究对象，分为5个年龄组：乳牙列组（3～5岁），混合牙列组（6～12岁），青少年组（15～18岁），青年组（30～44岁），老年组（>60岁）。研究对象无全身性疾病，无口腔局部疾病，近6个月内未使用抗生素等药物。本研究经过四川大学华西口腔医院伦理委员会批准。研究对象或其监护人在取样前均签署知情同意书。

1.2 样本采集

使用消毒棉签在研究对象左右两侧颊黏膜区域各擦拭10 s（避免接触到牙面），将棉签置于含750 μL TE缓冲液（pH=7.4）的离心管内，冰浴下4 h内运送至实验室，-80 ℃保存备用。

1.3 基因组DNA的提取和 PCR 扩增

所有样本室温解冻，涡旋3 min使样本充分分散至TE 缓冲液内，弃棉签留菌悬液备用。使用 QIAamp DNA Micro Kit（Qiagen公司，美国）提取细菌全基因组DNA作为模板，通用细菌16S rRNA引物Bac1和Bac2作为引物[9]进行扩增。引物Bac1的5’端包含DGGE所需40 bp的“GC夹”[10]，其作用是增加扩增片段的GC含量，防止DNA双链完全解离。PCR扩增细菌16S核糖体DNA基因，具体方法见文献[11]。引物序列如下。Bac1：5’-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTG CCA GCA GCC-3’[9-10]，Bac2：5’-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’ [9]；扩增产物长度约为300 bp。每50 μL PCR 反应体系包含：纯化基因组DNA（10 ng·μL-1）2 μL、上游及下游PCR引物（25 μmol·L-1）各1 μL、无酶水21 μL、DreamTaqTM PCR Master Mix（2×）（Fermentas公司，立陶宛）25 μL。使用Gradient PCR Thermal Cycle （Eppendorf公司，德国）进行聚合。循环条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。取PCR扩增产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，Goldview Ⅰ型核酸染料染色后置长波紫外光下观察，采用Mole-cular Imager Gel Documentation system（Bio-Rad公司，美国）凝胶成像系统采集图像。

1.4 DGGE

使用Bio-Rad D-Code system（Bio-Rad公司，美国）对PCR扩增产物进行DGGE。丙烯酰胺凝胶质量分数为8%，变性剂浓度梯度质量分数为40%～60%（100%变性剂包含体积分数为40%的甲酰胺与7 mol·L-1的尿素），变性胶上表面加入5 mL无变性作用的积层凝胶。60 V恒定电压、58 ℃条件下，在1×TAE缓冲液（pH=8.5）中电泳16 h。电泳完成后，采用0.5 μg·mL-1溴化乙锭染色15 min，然后用1×TAE缓冲液漂洗去除多余染料，Molecular Imager Gel Do-cumentation system采集并记录 DGGE 凝胶的数码图像。

1.5 DGGE凝胶微生物图谱分析

使用Quantity One软件（Bio-Rad公司，美国）标准化DGGE凝胶图像用于分析条带模式，得到的最终参数包括检测到的条带数、条带分布的频率等。

1.5.1 Sh[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]annon指数 Shannon指数（H）代表微生物群落多样性的丰富程度。公式为：H=-∑PilnPi，H的计算是基于DGGE胶条带的位置和条带的强度，条带的强度（Pi）由经凝胶分析软件Quantity One分析后得到的波峰面积来表示，即Pi=ni/N，其中ni为峰面积，N为所有峰的总面积。

1.5.2 非加权组平均法（unweighted pair-group me-thod with arithmetic means，UPGMA）聚类分析 使用UPGMA聚类分析构建系统进化树。

1.6 统计学分析

应用SPSS 19.0软件分析数据，多组间的条带数和Shannon指数的比较采用独立样本Kruskal Wallis检验，组间多重比较采用Student-Newman-Keuls检验（SNK检验），检验效能α=0.05。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

经PCR扩增各颊黏膜菌群的16S rDNA，25例样本均得到预期长度约300 bp的产物（图1），扩增产物无明显拖尾及引物二聚体形成。

2.2 DGGE图谱总体特征

图2为5个年龄组的颊黏膜菌群DGGE指纹图谱。图2每一泳道代表一个研究对象颊黏膜细菌样本的DGGE指纹图谱，不同位置的条带代表不同的优势细菌，泳道的条带数代表该样本中的优势菌种的数量。分析图2可以看出：1）个体间唾液微生物中共享的优势菌群数量较多，图谱表现为相同位置的 条带在各个体中均有出现；2）唾液微生物的组成同时具有个体差异性，未见有完全相同的泳道出现。

2.3 条带数比较

5个年龄组DGGE 图谱经标准化后，得到64个不同条带，条带平均数介于10～31之间。乳牙列组、混合牙列组、青少年组、青年组和老年组检测到的平均条带数分别为21.2±4.0、17.8±3.9、15.8±4.3、16.8±3.7、22.2±6.5。乳牙列组、混合牙列组和青少年组颊黏膜优势菌群的种类随着年龄的增加而呈递减趋势；进入青年阶段以后，这种趋势得以逆转，表现为青年组、老年组优势菌群种类随着年龄的增加而逐渐增加。虽然可看出这种趋势，但经Kruskal-Wallis秩和检验，各组间的差异并无统计学意义（P>0.05）。

2.4 Shannon指数比较

乳牙列组、混合牙列组、青少年组、青年组和老年组的Shannon指数分别为1.73±0.2、1.43±0.1、1.05±0.2、1.45±0.2和1.63±0.3。经Kruskal-Wallis秩和检验，5组间的总体差异具有统计学意义（P=

0.003）。与微生物种类数目的改变相似，颊黏膜优势菌群的多样性随着年龄的增加而呈现递减趋势；进入青年阶段以后，这种趋势改变，青年组、老年组优势菌群种类随着年龄的增加而逐渐增加。组间比较显示，青少年组与其他4个年龄组相比，其差异有统计学意义，提示青少年期是颊黏膜微生物多样性改变的转折点。

2.5 群落结构分析

为了解颊黏膜菌斑微生物多样性随年龄增加而发生的群体性改变，本研究对得到的DGGE图谱进行了UPGMA聚类分析，依据不同样本的条带分布相似程度构建了系统进化树（图3）。从UPGMA聚类分析结果看出：11、[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]12、13、15和22号样本在树图中聚成一簇，除22号样本外，其余4个样本都来自青少年组；2、3和4号样本在树图中聚成一簇，都来自乳牙列组；6、7、8和9号样本在树图中聚成一簇，都来自混合牙列组；16、17、18和20号样本在树图中聚成一簇，都来自青年组。由此可见：相同分组内大部分样本聚类位置相近的群落结构表现出较高的相似性；不同分组的大部分样本未聚类在一起，群落结构呈现出一定的差异。该结果提示：颊黏膜微生物的群落结构随着年龄和牙列的改变存在演替现象；但是从图3中也可以看到，每个节点处代表相似性的数字并不是很大，对聚类分析结果的可信度会造成一定的影响。

3 讨论

口腔黏膜的细菌感染，是除牙齿及其支持组织感染外最常见的口腔感染[8]，多为机会致病菌（如大肠杆菌群，假单胞菌属，肠球菌等）导致的混合性感染。疾病发生时，感染部位的菌群组成发生变化[8]，正常黏膜菌群（链球菌属、奈瑟菌属、嗜血菌属等）丰度显著减少，而机会致病菌丰度显著升高。了解健康及疾病状态下黏膜菌群的组成改变，可对微生物学诊断技术的发展，疾病的早期治疗及预防产生重要影响[7]。

目前已从人类口腔中检测出700多种微生物，口腔微生态群落的物种复杂性在口腔多菌种感染性疾病研究中的重要性日益突出[12]。研究[12]发现，口腔中50%以上的微生物不能依靠传统方法进行培养和分类，这限制了对口腔微生态群落结构的全面了解。近年来非培养分子生物学检测技术迅速发展，PCR-DGGE技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域。目前，PCR-DGGE技术主要应用于微生物群落多样性和群落变化，细菌富集和分离检测，rRNA编码基因的微观异质性检测，克隆文库筛选，PCR和克隆偏倚的确定等研究[13]。在口腔医学领域，PCR-DGGE主要用于检测唾液、菌斑等微生物群落结构以及龋病[14]和牙周病[15]患者的口腔微生物群落组成改变。本研究采用PCR-DGGE方法对不同年龄及牙列阶段人群的颊黏膜样本进行研究，克服了传统培养学方法的缺点，使研究结果具有更强的可信性。

伴随年龄增长，口腔结构的一个明显变化是从牙萌出到形成完整牙列，这期间口腔菌群也进行着动态演替[16]。人出生时口腔一般是无菌的，即使有少数细菌，也是在分娩过程中污染所致；与外界接触后，出生6～10 h口腔细菌的数量即有显著增加；幼儿期乳牙萌出，细菌定植的环境增加，口腔微生物的数量明显增加，种类更加复杂；青春期恒牙完全萌出，口腔生态环境相对恒定，几乎所有成人口腔中的菌种都能在青春期口腔中分离到；成年期口腔微生物的定植数量和种类达到高峰，与其他时期相比，该时期的口腔菌群组成更为复杂和多变[16]。本研究使用PCR-DGGE技术从颊黏膜微生物群落组成多样性方面将这种演替过程进行了更直观地描述。本研究未涉及新生儿和婴儿的颊黏膜菌群研究，但已有研究[17]表明，随着婴儿月龄的增加，其口腔中检出细菌的种类和数量均明显增加。Vaahtontemi等[18]检测了5月龄到34岁不同年龄组人群的龈缘、唇黏膜和颊黏膜表面的细菌数量，发现3个部位定植细菌的总量随年龄增加而减少。结合[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]Vaahtontemi等[18]及本试验的研究结果可以看出，随着年龄的增加，颊黏膜表面的细菌总量逐渐减少，但细菌多样性在青少年（15～18岁）及青年（30～44岁）期间呈上升趋势。

造成口腔微生物年龄相关变化的因素有很多：儿童因其黏膜防御机制尚不成熟，口腔黏膜有更多的细菌黏附[18]；老年人免疫力下降，黏膜菌群发生变化[19]；口腔卫生措施也会对黏膜菌群造成影响[20]。本研究发现的颊黏膜微生物群落结构随年龄和牙列改变存在的演替现象很可能与宿主不同年龄阶段免疫力及口腔卫生习惯等因素相关[21]。

综上所述，本研究对不同年龄阶段人群口腔颊黏膜微生物群落的组成差异进行分析，发现颊黏膜微生物的群落结构随着年龄和牙列的改变存在演替现象，青少年期可能是颊黏膜微生物多样性改变的重要转折点。本研究结果为进一步深入研究宿主黏膜微生物组的动态演替过程奠定了基础。但是，本研究样本量较少，其结果只能作为初步参考；此外，虽然PCR-DGGE在口腔微生物群落分析中具有显著优势，但只能检测优势菌群，且无法进行定量分析。在下一步工作中，需扩大样本量，采用更先进的技术，如基于焦磷酸测序技术的宏基因组学[22]等高通量测序技术，对健康人群口腔颊黏膜微生物的演替进行更深入的研究。

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第5篇：微生物多样性研究范文

1．1菌根共生对外来植物入侵的促进作用

菌根共生体在强化植物个体对环境的适应性、提高植物营养水平以及塑造植物种群和群落结构与动态等方面均起着重要的调节作用．在菌根菌与植物相互作用过程中，一方面植物可以向菌根菌提供更多的碳水化合物，另一方面菌根菌可以为植物提供氮和磷等营养，提高植物对环境中水的利用效率，增强植物对一些病原微生物侵染的抗性．因此，外来植物若能与入侵地的菌根菌形成共生体，将大大提升其入侵潜力．目前的研究表明，菌根共生可能是促进外来植物成功入侵的一个重要原因．如NI－JJER等在研究乌桕（Sapiumsebiferum）成功入侵的机理时发现，与土著植物相比，其根系中的丛枝菌根真菌（Arbuscularmycorrhizafungi，AMF）是提高乌桕生长率、促进其进一步入侵温带湿地系统的重要原因．HARNER等研究了AMF在斑点矢车菊（Cen－taureastoebe）入侵过程中的重要性，结果发现AMF极大地促进了斑点矢车菊对氮的吸收，从而有利于其在河漫滩地的泛滥生长．目前，AMF在外来植物入侵中的作用已被大量试验证实．如杨如意等认为菌根真菌在加拿大一枝黄花（Solidagocanadensis）入侵过程中起着关键作用．MARLER等对入侵美国西北部草地的斑点矢车菊的研究揭示：外来植物如能与AMF形成共生体大大提高了其入侵潜力．FUMANAL等在研究从北美传入法国的豚草（Ambrosiaartemisiifolia）时发现，接种其根系中的AMF显著增加了豚草的株高、基茎、叶片数、根生物量干重、地上生物量干重以及总生物量干重，从而进一步促进其入侵．为了说明菌根共生如何促进外来植物入侵的机理问题，CAR－EY等采用同位素标记的方法研究了菌根共生对斑点矢车菊与本土植物爱达荷狐茅（Festucaidahoen－sis）的营养竞争关系，结果表明，菌根菌通过地下菌丝网络将碳水化合物由本土植物爱达荷狐茅向斑点矢车菊进行转运，进而抑制了爱达荷狐茅的生长，促进了斑点矢车菊的入侵，但此机制是否适合于其他入侵植物尚不清楚．此外，有研究发现，本地植物与菌根菌之间存在碳素竞争，从而抑制了本地植物的生长．那么菌根菌是否对入侵植物也具有负反馈作用还需要大量的实验证明．总体而言，目前关于入侵植物与菌根菌相互关系的研究大多采用温室盆栽试验，所以仍需大量的野外证据来支持．

1．2固氮微生物共生对外来植物入侵的促进作用

土壤氮是决定生态系统稳定性的最重要因素之一．研究表明，外来固氮植物通过与土壤中的固氮微生物共生，显著提高了入侵地土壤氮的含量与可获得性，进而提高了入侵种类的丰富度．火树（Myricafaya）是生长于大西洋加那利群岛上的一种能共生固氮的木本植物，该植物侵入夏威夷后，与土壤放线菌Frankia共生，其每年所固定的氮是本地植物固氮量的4倍，为其进一步入侵创造了有利的土壤条件．XU等在研究入侵中国西南部的外来植物紫茎泽兰（Ageratinaadenophora）的根际土壤特性和固氮细菌群落时发现，重度入侵地土壤的土壤肥力、固氮细菌数量和种类多样性显著高于轻度入侵和非入侵地．牛红榜等的研究结果亦显示外来植物紫茎泽兰重度入侵区土壤中氮元素的含量和土壤中自生固氮菌的数量都显著高于轻度入侵区和未入侵区．YELENIK等比较了黄羽扇豆（Lupinusluteus）和金环相思树（Acaciasaligna）2种外来共生固氮植物与入侵地土壤氮循环之间的关系，结果表明：2种外来植物均显著提高了土壤中植物的可获得性氮含量，进而有利于其进一步入侵．然而固氮植物入侵对土壤氮可获得性的影响不仅取决于其本身的生物学特性，还与被入侵生态系统的生境特征等因素有关．如入侵南非的豆科金合欢属植物金环相思树和海岸金合欢（Acaciacyclops），在养分充足的土壤中氮矿化速率加快，而在贫瘠土壤中却没有．此外，外来固氮植物与入侵地土壤根瘤菌共生要比与本土根瘤菌共生更有利于其生长．如PARKER等对由美国入侵到北澳大利亚的含羞草（Mimosapigra）的根瘤菌进行分类鉴定，结果发现，入侵的含羞草中一些根瘤菌品系完全不同于生长于美国本土的含羞草根瘤菌品系，且这些澳大利亚根瘤菌品系对含羞草的入侵具有明显的促进作用．综上，固氮微生物能提高入侵地土壤中氮的含量与可获得性，创造出有利于外来入侵植物生长的土壤微环境，促进外来植物成功入侵．

1．3土壤病原微生物的释放有利于外来植物入侵

尽管“天敌逃避假说”遭遇了一些研究的挑战，认为入侵植物逃避天敌不一定会提高入侵植物对群落的破坏作用，因而“天敌逃避假说”可能不是外来植物成功入侵的重要机制．然而，该假说目前仍然是最能解释外来植物成功入侵的重要机制之一．该假说认为外来植物的成功入侵是因为其在入侵地成功逃避了本土的天敌（主要指食草性动物），从而充分发挥了其潜在的竞争优势．最近的研究进一步认为外来入侵植物逃避的天敌还包括原产地的土壤病原菌、寄生虫、食根性原生动物等微生物．KLIRONOMOS通过接种病原体进入灭菌与未灭菌的土壤来研究入侵植物和本土植物的生长与病原体侵染的关系，结果表明，土壤病原微生物对本土植物具有负反馈作用．CALLAWAY等研究了入侵植物斑点矢车菊在本土与入侵地土壤上的生长与土壤微生物群落总体作用之间的关系，发现在未灭菌的本土土壤上栽培斑点矢车菊，其生长速度明显低于灭菌的本土土壤，而斑点矢车菊栽培在入侵的未灭菌的北美土壤上，其生长速度明显地高于灭菌的土壤．由此推测：本土土壤病原微生物的侵染对斑点矢车菊的生长具有负反馈作用，而在入侵地由于缺乏相应的土壤病原微生物，斑点矢车菊的入侵更容易．VANDERPUTTEN等在研究入侵博茨瓦纳共和国稀树干草原的印度蒺藜草（Cenchrusbiflorus）时指出，逃避本土土壤病原微生物也许是其成功入侵的原因．“天敌逃避假说”是基于扎实的生态学理论提出的，但该假说也有自身的局限性．BECKSTEAD等在研究入侵美国加州的欧洲海滨草（Ammophilaare－naria）时发现，入侵地与原产地的土壤微生物对欧洲海滨草的生长均表现为负反馈作用．也有研究表明，入侵植物在入侵地可以通过富集对本地植物有害的土壤病原菌来影响本地植物的生长，从而成功入侵．如MANGLA等［52］发现入侵印度的飞机草（Chromo－laenaodorata）可以富集入侵地土壤生态系统中的土传致病真菌－半裸镰刀菌（Fusariumsemitectum），抑制本地植物生长，促进其成功入侵．

1．4土壤微生物群落总体结构的改变促进外来植物进一步入侵

在土壤总群落结构与功能水平上，土壤微生物群落组成与地上植物群落组成密切相关．外来植物入侵常常导致本土植物群落组成剧烈改变，进而引起根系分泌物和凋落物的化学组成发生变化，最终使土壤微生物群落结构发生相应的演替，且改变后的土壤微生物群落有利于外来植物的进一步入侵．目前，关于土壤微生物群落与入侵植物相互作用的研究主要集中于以下2个方面：

（1）外来植物入侵与土壤微生物群落具体组成的关系．SI等在研究南美蟛蜞菊（Wedeliatrilobata）入侵程度与其根际土壤微生物群落结构的关系时，发现轻度和重度入侵显著增加了南美蟛蜞菊根际土壤真菌群落的丰富度，而对细菌群落未造成明显影响．此外，南美蟛蜞菊的入侵也对参与土壤氮循环的微生物群落结构产生了明显影响．KOURTEV等研究了日本小檗（Ber－beristhunbergii）和柔枝莠竹（Microstegiumvimineum）的入侵对土壤微生物群落结构的影响，结果表明2种植物的入侵显著改变了土壤微生物的群落结构，尤其是代表细菌与菌根菌的脂肪酸含量均随着入侵的深入显著提高．BATTEN等研究了外来植物黄矢车菊（Centaureasolstitialis）和钩刺山羊草（Aegilopstri－uncialis）与土壤微生物群落结构的关系，发现植物入侵显著提高了土壤硫还原细菌、硫氧化细菌等的脂肪酸含量．此外，我国学者对紫茎泽兰和薇甘菊（Mika－niamicrantha）的研究也得到了类似的结论．

（2）外来植物入侵与土壤微生物群落多样性的关系．外来植物之所以能成功入侵是因为其能够促进根际土壤微生物群落结构的演替，进而创造出有利于自身生长的土壤微环境，从而加快了入侵进程．DUDA等和LI等的研究表明，盐生草（Halogetonglomeratus）和薇甘菊入侵均显著提高了土壤微生物群落的功能多样性．针对土壤微生物群落结构多样性，祖元刚等研究了喜树（Camptothecaacu－minata）替代紫茎泽兰过程中根际微生物的群落特征，结果表明，紫茎泽兰的入侵显著提高了土壤真核微生物群落的多样性，对细菌多样性没有明显的影响．这些研究结果的差异一方面可能与采用的研究方法有关，另一方面也可能与研究的入侵植物种类有关．

1．5土壤微生物群落功能改变对外来植物进一步入侵的作用差异

土壤微生物群落的功能主要表现在对有机物的矿化作用和无机物的转化，并由此影响着土壤营养的可获得性，而土壤营养的可获得性又直接影响着植物的个体生长和种群或群落动态．现有研究表明，外来植物有选择地改变土壤微生物群落的某种功能可能是其成功入侵的重要机制之一．如BAJPAI等证实：与非入侵地土壤相比，紫茎泽兰入侵地土壤具有较高的微生物活性和速效氮含量，对紫茎泽兰生物量积累具有积极的作用．LORENZO等发现，银荆（Acaciadealbata）的入侵使土壤碳、氮和可交换磷含量持续增加，从而为银荆的进一步入侵创造了有利的土壤营养条件．SUN等发现，紫茎泽兰的重度入侵显著增加了土壤总磷和硝态氮含量．EHRENFELD等分别研究了入侵植物日本小檗和柔枝莠竹对土壤微生物群落功能的影响，结果表明，伴随着植物入侵，土壤总氮的矿化作用和硝化作用均显著提高，从而为植物的进一步入侵创造了有利的营养条件．不同入侵植物对土壤微生物功能的影响不尽相同，如EVANS等研究了旱雀麦（Bromustectorum）入侵对草地氮素营养动态的影响，结果表明，旱雀麦通过提高氮素在植物体中的滞留量而降低了土壤氮的可获得性，从而降低了土壤总氮的矿化速率．DRENOVSKY等研究了钩刺山羊草入侵与土壤营养循环之间的关系，结果表明，植物入侵显著降低了入侵土壤中碳与氮的循环．这些研究结果的差异一方面可能与研究的入侵植物种类有关，另一方面也可能与入侵生境有关．因此，今后要扩大外来植物种的研究范围，探索不同物种入侵与土壤微生物群落的功能关系，为揭示入侵机理提供更多的证据．

2植物入侵的内生菌生态学机制

植物内生菌（endophyte）泛指那些在其生活史中的某一段时期寄居在植物体内，对植物组织没有引起明显病害症状的微生物，包括那些对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌、菌根菌以及营表面生的腐生微生物．植物内生菌可增强宿主的抗逆性、抗病性、抗虫性、提高植物的生产力，以及对其他植物的排斥性等，但大多数研究都是针对本土植物进行的．近年来，研究者开始从内生菌的角度研究外来植物成功入侵的相关机理．有研究证明，内生菌能够增强入侵植物的入侵性，如SHIPUNOV等发现，入侵北美草原的斑点矢车菊体内定居了多种内生真菌，并且部分内生真菌直接提高了斑点矢车菊在入侵地的竞争力，进而增强其入侵性．ASCHEHOUG等研究了内生真菌对入侵植物斑点矢车菊化感作用的影响，发现感染内生真菌的斑点矢车菊对本土植物（Koeleriamacrantha）的化感强度很高，感染数是没感染数的2倍多，从而进一步提高了斑点矢车菊的竞争能力．此外，假高粱（Sorghumhalepense）体内定居多种内生固氮细菌，这些内生固氮细菌的存在进一步提高了土壤中碱金属（Ca2＋、Mg2＋、K＋、Na＋）、微量元素（Zn2＋、Fe3＋、Cu＋、Mn2＋）以及可被利用的氮、磷元素的浓度，从而提高了假高粱的入侵能力．此外，人们还发现，内生菌的存在可以通过改变入侵植物的根际微生物群落结构来修饰其入侵性．如RUDGERS等发现内生真菌（Neotyphodiumcoenophialum）的存在提高了外来植物高羊茅（Loliumarundinaceum）根际微生物群落的多样性，从而进一步促进其入侵．然而，人们也发现了一些相反的结果．如NEW－COMBE等发现斑点矢车菊体内的部分内生菌是病原菌，这些病原菌的存在抑制了斑点矢车菊种子的发芽、生长，并延缓其开花．不难看出，植物内生菌在外来植物入侵过程中可能起至关重要的作用，尤其是对入侵植物的促进作用．因此对入侵植物与其内生菌之间的相互作用开展深入研究可能会发现新的规律，为控制入侵植物提供新的解决途径．

3入侵植物的微生物学机制研究面临的问题

国内外关于外来植物入侵的微生物学机制研究也发挥了重要作用，但仍然存在一些问题：

（1）由于入侵植物的种类不同，与土壤微生物群落相互作用的过程与机理亦不尽相同，争议仍然存在，目前很难提炼出具有普遍意义的结论；

（2）在外来植物入侵的过程中，入侵植物与入侵地土壤微生物间必然存在一定的营养竞争关系，这种竞争关系在外来植物入侵过程中究竟发挥了怎样的作用，至今尚不明确；

第6篇：微生物多样性研究范文

关键词：硝化菌群；分子生物技术；荧光原位杂交

分子生物技术的应用对于污水生物处理带来了一定的帮助，是现阶段应用比较普遍的一项技术手段，在进行污水生物处理的过程中，主要包含两个阶段，一个阶段是硝化，一个阶段是反硝化，这两个阶段都是脱氮的主要环节，在硝化过程中，主要的微生物是硝化菌群，其中包含了众多的微生物离子，在污水生物处理的过程中，主要依靠了生物活性以及稳定的菌群分布两个主要特点，这样才能促进污水生物系统中脱氮更加稳定的运行。在应用分子生物技术处理污水中硝化菌群的过程中，已经有相关研究项目对此展开了详细的分析，本文主要对此加以论述，希望对今后的研究工作带来一定的帮助。

1 基于FISH技术的分析方法

这一技术的应用主要是在目标微生物的基础上根据基因的特异性进行排列而成的，在设计的过程中，其中还含有寡核苷酸探针，具有荧光染料的特点，在碱基序列互补性的基础上，只要经过相应的杂交，就会显示出荧光信号，这说明杂交成功，在显微镜的显示下，可以对目的基因加以相对定量分析以及定性分析，在典型的FISH技术中，可以选择具有不同特异性序列的微生物加以检测，这样就可以对微生物群中的结构的变化情况进行研究，从而得出应有的信息。这种方法在污水生物系统中的应用是十分普遍的，并且随着信息技术的发展，这一技术也得到了进一步的完善。

以FISH-MAR技术为例，这一技术是建立在FISH技术基础之上的，因为单独采用FISH技术处理生物代谢等问题还存在一定的局限性，所以在现代化的应用过程中建立起了FISH-MAR技术，这一技术是通过显微照片的形式将生物的复杂性展示出来，清晰的显示出相应的菌群结构以及空间分布等问题，这一技术的核心在于可以在无机底物中加以培养，并且对具有放射性的细胞进行收集，在影像中所呈现出来的颜色是黑色，具体的实验流程是先将适量的污泥加入到血清瓶中，然后在血清瓶中加入适量的放射性标记底物，再经过2h的好氧培养，这样就可以得到污泥样品，将样品固定以后加以冲洗，经过FISH程序与MAR程序以后通过显微镜进行观察，得出相应的结论。

这种方式对微生物代谢与微生物群种结构的研究具有重要的意义，但是不足之处在于对目标含量较低的微生物结构来说并不适用，因为这种方式需要建立在荧光信号以及放射自显影的基础上，所以在活性污泥中，如果目标微生物的细胞过低，那么就会造成目标微生物的rRNA也具有较低的含量，这样就会对荧光信号产生一定的影响，不能得到正常的显影，进而无法准确的检测出结果。因此，如果硝化菌群无法呈现出优势菌群的特征时，那么就不适合采用FISH-MAR这一技术，即便是使用了这一方法，也无法获得显著的效果。

2 基于PCR技术的分析方法

2.1 amoA与16SrRNA基因

在应用这一技术的过程中，主要是选择具有进化标记的硝化菌群中的DNA序列进行研究，在这一序列的基础上，可以得知x择的分子标记基因为16SrRNA基因以及amoA。在对其进行研究的过程，这一技术所产生的影响是十分深远的，对于不同的微生物而言，16SrRNA在区域中所具有的差异也是十分明显的，其中可以分为两个组成部分，一个组成部分是古细菌，一个组成部分是细菌，在此基础上对微生物开展了更加深入的分析，在进行微生物分析的过程中，发现基因结构也是具有一定差异性影响的，16SrRNA自身具有保守性以及差异性的特点，通过上述的特点可以对系统发育以及相应的进化距离加以进一步的确定。

大部分AOB在分别基于amoA和16SrRNA基因的系统发育树上的分类有着高度的相似性。他们同时也发现，尽管对AOB的16SrRNA基因和amoA基因进行定性分析时都可以反映出环境中AOB的种类，但由于不同种AOB之间的16SrRNA基因序列的高度相似性和该类型引物的非特异性，限制了16SrRNA基因类引物对AOB菌群系统发育树分析的精确度。而尽管amoA不是制定系统发育树的因子，但由于amoA只存在于AOB中，而且不同种AOB的amoA序列差异度超过其16SrRNA基因的序列差异度，使得amoA类引物的扩增特异性更强，因此对AOB菌群遗传差异的分辨能力更高，从而能够更精确地分辩出AOB的种属。但无论是amoA类引物，还是16SrRNA基因类引物，目前都只针对β-变形菌纲的自养型AOB，因此在使用这两类引物对AOB进行分析研究时都会低估环境样品中AOB菌群的多样性。

2.2 PCR-T-RFLP

PCR-T-RFLP（PCR-terminal restriction fragment length polymorphism，PCR-末端限制性片段长度多态性）技术是对PCR扩增过程中所使用的引物一端用荧光物质进行标记。当用该引物对样品DNA进行PCR扩增后，PCR的扩增产物就带有了荧光标记。然后选择适当的限制性内切酶对PCR产物进行消化，就可产生不同长度的限制性片段。传统的T-RFLP技术通常只使用一条带有荧光染料的引物和一种限制性内切酶。随着该技术的改进，有的研究者会同时使用两条带有不同荧光染料的引物进行PCR扩增，从而提高目标微生物的分类水平。最后利用DNA自动测序仪和带有其它荧光染料标记的内标物对消化产物的长度进行分析，并获得峰值图。由于每种微生物带荧光标记的限制性片段长度唯一，所以峰值图中每一个峰至少代表一种微生物，每个峰面积与峰总面积的比值代表这种微生物的相对含量。相对于PCR-DGGE技术，PCR-T-RFLP技术能在相对较短的时间内对大量样品的菌群结构进行分析。PCR-T-RFLP技术还具有较好的重现性和更高的灵敏度，从而该技术能够对样品中含量较少的微生物进行研究。

3 结论与展望

分子生物技术在污水生物处理系统内硝化菌群研究中的应用，从微生物学角度更本质地揭示了影响污水生物处理系统硝化性能的因素。本文提到的分子生物技术在污水处理中脱氮除磷相关机理和理论的研究中也有着广阔的应用前景，如短程脱氮、反硝化除磷、同步硝化反硝化及厌氧氨氧化等。通过这些技术可以识别特定生物代谢过程的微生物种群；建立目标菌群动态变化与工艺运行参数之间的相关关系；从微生物学角度对系统运行状态给予最直接、最可靠的分析与证明，为污水生物脱氮除磷系统的长期稳定运行奠定理论基础，提供借鉴与指导。

参考文献

第7篇：微生物多样性研究范文

海洋微藻研究的苦与乐

时间追溯到2004年，严小军在浙江乐清翁育苗场检验微藻饵料生物是否具有设想营养价值。刚开始，育苗场的老板并不同意，严小军就用科学精神去感动他，告诉他们这样做的目的是为了让今后的育苗更加可靠。就这样，严小军和他的研究生每天一清晨就到育苗场干活，空余时间则在一起做不同饵料微藻的营养效果实验，衣服不知被汗水浸湿多少回。终于功夫不负有心人，实验得出结果，今后育苗只要选取1-2种饵料生物就可以达到更好的效果。令人意想不到的是，实验选出的饵料在当年的育苗中就取得了更好的经济效益，“这时候大家是何等的开心！”后来，他们把育苗场收集的样品带回实验室继续分析，最后看到了特定的脂类物质出现了选择性的富集，“我们知道当初提出的假设成功了！”

实验的成功无疑让每个参与其中的人都为之振奋，但殊不知，经验丰富的育苗高手――严小军的研究助手徐继林老师一开始并不看好他们的假设。这个饵料微藻是否会真的像严小军设想的一样是具有不同的饵料效果？饵料的效果是否真的来自脂类营养学的影响？徐继林将信将疑，而且他也担心在育苗场做实验是否能取得足够的支持和精细的样品。

实践是验证真理的唯一标准，实验之后徐继林相信了。“徐老师在此之后成为了这一研究的主力，即使在我们获得国家奖之后，我和他还是一直深入地探讨是否有可能进一步改进我们的技术”，通过不断努力，严小军建立了国际上最先进的微藻脂类学研究方法，从而可以筛选到了更好的饵料微藻。在福建漳州诏安，他们建立了东南沿海最大的滩涂贝类育苗基地。

那么，什么是微藻脂类学研究？国际上对于脂组学的研究出现于90年代末，主要基于液质联用的分析方法对海洋微藻全脂组成进行精准分析，该项技术曾获2002年诺贝尔化学奖，已经成为近年来广泛兴起的蛋白质组学、代谢组学的重要研究工具。而微藻脂类物质主要包括：甘油磷脂（磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油）、甘油糖脂（MGDG、DGDG、SQDG）、甘油三酯、甘油甜菜碱酯（DGTS、DGTC、DGTA）、鞘脂（Sphingosine、Cer、GSL），这些物质结构多样复杂并担负不同的生理功能，脂类物质随生理条件会出现相互转化。

海洋微藻的大学问

对海洋微藻脂类的研究有三大意义：作为微藻本身及其食物链以及生物地球化学循环的重要生物指示物，作为微藻生理学代谢与营养学的重要指标，作为微藻生物能源的重要物质基础。

所以，对微藻脂类研究势在必行。严小军所在的实验室是国内最早开展微藻脂组学研究的研究团队，他门采用飞行时间质谱高精度分析的技术手段，解决了一些早期研究中无法识别的精细结构的判别特征和判别规律，也发现了一些新型的脂类结构。经过近十年的持续研究，已经形成一套完整的脂类结构的分析技术和脂组学技术体系。近年来，随着质谱技术的快速发展，鉴定极为复杂的脂类物质的结构组成为可能，同时结合不同条件下结构组变化的规律，形成脂组学新学科，是代谢组学技术中发展最快的专门领域。

目前，他们已经成为国际上较为知名的微藻脂类学研究的研究队伍，收获众多前沿发现。比如，在微藻鞘脂方面发现了一些全新的糖鞘脂结构，这些糖鞘脂结构作为新的微藻化学分类学生物指标具有重要意义，且可能与微藻抗病毒的能力有关；发展了微藻甘油三酯的精确结构鉴定方法，解决了微藻甘油三酯共流出组分的精确判断方法；在微藻脂组学研究微藻生理代谢中，发现硅藻氮缺乏是微藻生长从指数期向对数期转变的最为关键的生源要素限制因素，而并非传统认为的硅缺乏，这一发现与近期对于硅藻基因组中出现罕见的鸟氨酸循环具有科学解释的一致性，同时还观察到硅藻类是所有饵料微藻中能够在进入生长平台期后最快速积累甘油三酯，是最优良的饵料生物；在微藻分类学方面，解决了骨条藻、微绿球藻中几株形态相似种的脂类学判别难题。

对于目前已经取得的傲人成绩，严小军并没有浮躁，而是冷静地认识到，“相对于国际上一些重要的研究团队来说，我们对于微藻脂类学的研究技术已经处于尖端水平，但将微藻脂类学的研究方法放入一个更加宏观的生理学与生态学研究的问题中尚显能力不足”，美国伍兹霍尔海洋研究所的科学家采用微藻脂类学研究技术提出了蓝细菌对于磷限制耐受的新观点；以色列魏斯曼研究所的科学家利用微藻脂类学研究技术提出了颗石藻受病毒入侵的鞘脂生物合成基因横向传递的新理论……

差距虽有，但令人欣慰的是，严小军近期在对深海热液口盲虾的脂类学分析中发现了不同于光合作用层普通虾的鞘脂差异，为深海热液口盲虾的生理学适应提出了一个新的视角。

除了海藻脂类学研究，严小军的另一大创新性成果是――微藻脂肪酸甾醇同时分析，这是紧密围绕微藻营养对于贝类生长发育的一项技术创新。由于贝类在摄食微藻后可能同时对脂肪酸和甾醇都有营养需求，哪个物质对贝类的生长更为重要？这时就需要同时分析两类物质的变化规律以精确判别其重要性。如果采用传统的脂肪酸和甾醇分开测定，不仅需要两份样品做平行的独立分析，而且可能由于不同的分析批次而导致结果的系统性误差。因此，严小军在充分研究传统分析方法的基础上，发现了“如果将脂肪酸充分甲酯化之后，再直接对甾醇进行硅醚化衍生，进行一次性的GCMS分析就可以同时获得分析结果”，幸运的是，他在实际分析中发现脂肪酸甲酯和甾醇硅醚在出峰时间上分别处在两个差异显著的时段，这大大简化了物质结构判别中可能出现脂肪酸甲酯和甾醇硅醚混杂在一起而所带来的潜在麻烦。有了新的分析方法，后续的实验就顺利许多，最终研究结果发现，贝类摄食微藻后，对于特定的脂肪酸具有显著的富集作用，而对于甾醇，尤其是胆固醇，具有更加高效的富集倍率。这不仅使严小军了解到了贝类对于微藻脂类营养的一些内在规律，还为选用微藻高效营养种类指明了路径。

实现产学研的成功转化

在严小军看来，要进一步使我国的藻类资源开发利用走在国际前沿水平，我们仍然需要不断地努力，要实现这一目标，主要解决两个关键问题，一个是新型设备的产业链改造，我们所知，目前企业在自动化控制方面已经达到一个较高的水平，但是在新型加工工艺装备方面，仍然依靠进口设备，缺乏自主知识产权，“短时间内无法改变这种局面，但需要下决心改进工艺设备的高端化”。

另一个问题是研发成果的产业化。“相比于老一辈科学家而言，我们更加注重学术成果，但对于产业发展的紧密结合做得不如前辈好。”近五年来，有趋势表明，科研成果的产业化在得到有效地推进，“大家有理由相信，新产品新工艺的产业化将进入一个快速发展的新时期。”

如今，严小军正在进行3项产学研合作的探索。针对螺旋藻红球藻高质量培养与加工技术，2011年与云南程海丽江程海保尔生物开发有限公司合作，共同申报发明专利16项，包括“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”“一种螺旋藻培养基循环利用的方法”“一种养殖螺旋藻越冬复壮保种的培养基”……研究掌握了螺旋藻重金属积累溯源的主要途径，突破了螺旋藻重金属的减除技术，极大地改进了螺旋藻的产品质量和废水处理技术。

针对海藻生物活性物质与海藻工业技术，2012年与山东日照洁晶集团股份有限公司合作，重点针对海藻化工行业产品种类趋同、利润低下、工艺耗水量大等问题，提出了将传统海藻工业老三样“海藻酸钠、甘露醇、碘”提升为新三样“岩藻黄素、褐藻多酚、岩藻多糖硫酸酯”的产业合作创新构想。

针对微藻饵料营养供应技术，2012年与福建宝智水产科技有限公司合作，共进行了10余种滩涂贝类苗种培育，其中3个品种为首次进行规模化生产，无论是苗种的质量还是经济效益均居全国同行业首位，2014年各项产品年销售额突破5000万元。建成了东南沿海规模最大的滩涂贝类育苗基地、全国滩涂贝类行业中唯一一家温控车间――“循环温控新品种培育车间”。

打开海洋生物科学研究的一扇窗

2013年，在北京生物芯片国家工程研究中心程京院士的指导下，严小军领导建立了生物芯片北京国家工程中心宁波分中心――我国唯一的海洋领域的生物芯片分中心。该中心的目标是将生物芯片技术应用于生态环境、生物育种、海水养殖病害快速检测等领域，是海洋生物技术科学研究和产业化的一个重大机遇。

生物芯片为何物？简单来说，生物芯片就是一种将多数的生物分子探针取得快速检测的方法和技术，最主要的是DNA探针微阵列技术，芯片的制造和检测技术包括了材料学、化学、分子生物学等多学科的技术手段。其应用主要包括“物种的快速检测”和“生物生理学变化的多参数变化规律测定”两个方向，用途十分广泛。

中心成立以来，严小军团队已成功建立基于LAMP-LFD技术的蓝藻有毒水华的监控新技术。目前，有多位教授承担了部级生物芯片的重大科技计划，取得了很大进展。其中，张德民教授采用生物芯片技术，提出了基于微生物群落结构变化的海水养殖健康诊断新方法，对于东海近海海域提出了基于微生物分子区系结构的区域划分方法。程京院士将生物芯片技术应用于海洋，可能在生态环境诊断、生物病害筛查、生物探矿、海洋微型生物快速鉴定等领域具有广阔的用途，“生物芯片技术有望在‘十三五’期间实现在海洋领域的产业化突破。”

今年以来，严小军担任了宁波大学副校长，主要分管国际教育和宁波海洋研究院的筹建，工作异常繁忙，“但对于科学研究和学生培养，仍然是我心中关注的中心”，作为一个科研人员，严小军很赞同这样一个观点，“做学问要有好奇心、学术荣誉感、社会责任感”。好奇心是要对自己研究的事情有浓厚的兴趣，学术荣誉感是要对自己发表的研究结果有一种自信和珍惜，社会责任感就是要时刻关注自己的研究是否可以应用于社会经济，“这三条也是我培养学生的育人理念”。

第8篇：微生物多样性研究范文

论文摘要：代谢组学是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式。本文在介绍代谢组学基本含义的基础之上，对代谢组学的研究方法及其在环境微生物领域的研究进展进行了评述。

一、代谢微生物概述

代谢组学(metabonomics/ metabolomics) 是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。化学分析技术中最常用的是1H核磁共振(1HNMR)以及色谱(毛细管电泳)-质谱联用(X-MS)。目前代谢组数据处理的主要方法是:应用主成分分析(PCA) 等将从原始图谱信息或预处理后的信息进行归类，并采用相应的可视化技术直观地表达出来;建立类别间的数学模型，使各类样品间达到最大的分离，并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测;最终建立可利用的该领域的应用数据库和专家系统。应用代谢组学可进行疾病诊断、对药物进行毒性评价和研究植物细胞代谢等。

二、代谢组学的研究方法

代谢物组学分析中，对于不同类型的代谢产物，往往要采取不同的分析方法进行研究。目前，代谢物组学通常采用红外光谱法( infraredspectroscopy ， IR) 、核磁共振( nuclear magneticresonance ， NMR)、质谱(mass spectrometry ， MS) 、高效液相色谱( high performance liquidchromatography ， HPLC) 以及各种技术的耦联，如气象色谱耦联质谱( gas chromatography2mass spectrometry，GC/MS)和液相色谱耦联质谱(liquid chromatography2mass spectrometry，LC/MS)来分析研究代谢物并为其绘制图谱。这些技术的耦联可以提高对样品的分辨率、敏感性及选择度，有利于对更多的生物体系内的代谢物绘制图谱。一般来说，选择代谢物组学分析方法时，其原则是要同时考虑仪器和技术的检测速度、选择性和灵敏度，找到一种最适合目标化合物的方法。

三、代谢组学在微生物领域的研究进展

(一)微生物分类，突变体筛选以及功能基因研究

经典的微生物分类方法多根据微生物形态学以及对不同底物的代谢情况进行表型分类。最近，随着分子生物学的突飞猛进，基因型分类方法如16SrDNA测序，DNA杂交以及PCR指纹图谱等方法得到了广泛应用。然而，某些菌株按照基因型与表型两类方法分类会得出不同的结果。因此，根据不同的分类目的联合应用这两类方法已成为一种趋势。BIOLOG等方法在表型分类中应用较为广泛，但是，代谢谱分析方法(metabolic p rofiling)异军突起，逐渐成为一种快速、高通量，全面的表型分类方法。采用代谢组分类时，可以通过检测胞外代谢物来加以鉴别。常用的胞外代谢物检测方法为样品衍生化后进行GC2MS分析、薄层层析或HPLC2MS分析，最后通过特征峰比对进行分类。Bundy等采用NMR分析代谢谱成功地区分开临床病理来源以及实验室来源的不同杆菌(bacillus cereus)。除了表型分类外，代谢组学数据可以应用于突变体的筛选。在传统研究中的沉默突变体(即未发生明显的表型变化的突变体)内，突变基因可能导致了某些代谢途径发生变化，通过代谢快照(metabolic snap shot)可以发现该突变体并研究相应基因的功能。

(二)发酵工艺的监控和优化

发酵工艺的监控和优化需要检测大量的参数，利用代谢组学研究工具可以减少实验数量，提高检测通量，并有助于揭示发酵过程的生化网络机制，从而有利于理性优化工艺过程。Buchholz等采用连续采样的方法研究了大肠杆菌在发酵过程中的代谢网络的动力学变化。他们在葡萄糖缺乏的培养液培养的大肠杆菌中加入葡萄糖，并迅速混匀，按每秒4～5次的频率连续取样。利用酶学分析、HPLC/LC2MS等手段监测样品中多达30种以上的代谢物、核苷以及辅酶，从而解析了葡萄糖以及甘油的代谢途径和底物摄取体系。通过统计学分析建模，发现在接触葡萄糖底物后的15～25s范围内，大肠杆菌体内发生的葡萄糖代谢物变化与经典生化途径相符，但随后的过程则与经典途径不符，推测可能存在新的未知调控步骤。Takors认为，通过上述代谢动力学研究，掌握代谢途径及网络中的关键参数，将直接有利于代谢工程的优化，包括菌株的理性优化以及发酵参数的调控。

(三)环境微生物研究

微生物降解是环境中去除污染物的主要途径。深入了解污染物在微生物内的代谢途径，将有助于人们优化生物降解的条件，从而实现快速的生物修复。这些代谢中间体大都通过萃取、分析方法进行逐个研究，并借助专家经验拟合出代谢途径，其动力学过程亦很少触及。代谢组学方法的采用有可能改变这一现状。Boersma等采用代谢组学方法研究氟代酚的微生物降解途径。氟代化合物具有特殊的19F核磁共振属性，19F的核磁共振灵敏度与1H核相近;由于生物体内无内源性19F核磁信号，因而无本底干扰。所有19F核磁信号均可归结于异生素及其代谢物。19F核的化学位移值宽，约为700ppm(1H为15ppm，13C为250ppm)。较宽的化学位移导致19 F在不同取代物的峰图不易产生重叠。因此，借助核磁共振技术可以更方便地研究含氟化合物的代谢中间体。Boersma等根据总代谢物的核磁共振图谱，推测出红球菌内羟化酶在不同的取代位(1，2，3三种不同的取代数量)羟基化氟代酚，然后再通过儿茶酚内位双加氧酶开环形成氟代粘糠酸的代谢过程。此外，他们还首次检测到开环后的下游代谢物，即通过氯粘糠酸异构酶生成氟代粘糠酸内酯以及氟代马来酸等中间代谢物。根际(rhizosphere)空间在植物2微生物相互作用中发挥着重要的作用。Narasimhan等利用根际代谢物组(rhizosphere metabolomics)方法，阐释了植物分泌物对根际微生物降解多氯代酚( PCB)的作用机制。然而，在采用拟南芥突变体(产生较少的phenylp ropanoids)的对照组中，降解菌的数量较低，降解率也仅达50%。结果表明植物根际分泌的次级代谢物促进降解菌的繁衍增殖，从而促进了污染物的降解。

此外，微生物代谢组学还应研究如何改进样品的制备方法。例如，在代谢组研究中，为了中止细胞代谢反应采用冷淬火(cold quenching)方法，将细胞样品迅速置于低温(液氮或-70℃甲醇中)，这会导致许多微生物发生冷休克(cold2shock) ，释放出大量的胞内物质，引起代谢组学定量研究发生偏差。

参考文献：

[1]周宏伟，谭凤仪，钟音，栾天罡.代谢组学及其在微生物领域的研究进展[J].分析化学.2007(2).

第9篇：微生物多样性研究范文

【关键词】食品微生物；检测技术；进展研究

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.01.689文章编号：1004-7484（2014）-01-0569-02

1前言

食品微生物是指与食品有关的微生物的统称，包括有食源性病原微生物、生产型食品微生物、食物变质。由于食品微生物对人身体健康的重要影响，采用先进的检测技术对其进行准确、有效的检测也显得尤为重要。

2食品微生物检测技术进展及研究

2.1分析化学检测技术进展及研究近年来，在食品微生物检测技术中，随着应用仪器与技术的不断更新，分析化学检测技术也朝着多元化的方向进行发展。分析化学检测技术包括有气相色谱·质谱联用检测、高效液相色谱检测、液相色谱·质谱联用检测、气相色谱检测等。分析化学检测技术主要是通过对食品微生物化学组成的分析来进行鉴定与区分。此种检测技术的应用，开辟了食品微生物检测与鉴定的新途径，对微生物检测的准确性有着显著的促进作用。

2.2PCR检测技术的进展及研究PCR检测是利用聚合酶链反应，将模板DNA、Taq酶、镁离子、双蒸水、缓冲液等混合物装入PCR微型管内，并在可编程调控的PCR仪上来完成检测。PCR检测技术自从1985年发明以来，通过不断地完善与改进，应用于食品微生物检测中时具有较高的敏感性与准确性。PCR检测技术包括有免疫PCR、多重PCR、反转录PCR等，每种PCR检测技术都可准确地检测到相对应的病菌与微生物，但其也主要是针对食品当中病原菌的特异性靶基因进行定位检测，且PCR检测技术还存在假阳性、定量困难等问题，还需进一步地完善[1]。

2.3核酸探针检测技术的进展及研究核酸探针技术主要是利用同位素或者其他标记方法，对已知核苷酸的序列DN段进行标记，并将其加入已变异的DNA样品当中，进而通过一定的条件作用达到食品微生物检测的目的。核酸探针技术检测食品微生物具有敏感性、特异性等优势，但其在检测时需对检测样品进行一段时间的培养，且检测方法及过程比较复杂，并对毒素污染的不含产毒菌的食品无法进行准确检测。

2.4免疫分析检测技术的进展及研究免疫分析检测技术包括酶联免疫吸附技术与免疫荧光技术，酶联免疫吸附技术是将抗体或抗原吸附于固相载体上并进行免疫酶染色，待底物显色后，再经由定量或定性来分析有色产物量，进而得到微生物的检测结果。此种检测技术结合了放射免疫测定法与免疫荧光法两者的优势，具有反应灵敏、准确性高、可定量、适用范围广等优点。近年来，随着酶联免疫吸附技术的完善，对检测食品中沙门氏菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等检测做出了卓越的贡献。

而免疫荧光技术主要是通过在食品样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，并经洗涤后在荧光显微镜下进行观察，从而得出检测结果；另外，也可采用间接法先于检样上滴加已知特异性荧光标记的抗血清，待其产生反应后再进行洗涤，并加入荧光标记的抗体进行观察。免疫荧光技术主要可用来检测葡萄球菌毒素、李斯特菌、沙门氏菌等，其特异性强、敏感性高、检测速度快，但也存在一些客观性的不足，还有待进一步在研究与改进。

2.5生物传感器检测技术的进展及研究对食品微生物以生物传感器检测技术进行检测时，其主要是将生物受体复合物（包括酶、核酸、抗体、多糖化合物等）与物理化学传感器直接连接，并通过动态、实时观察特异性生物，来分析其微生物的种类。生物传感器检测技术包括有免疫传感器、酶传感器、DNA杂交传感器、微生物传感器等，虽然其在食品微生物检测领域中的应用比较广泛，但其敏感性还存在一定程度的欠缺，具体的发展与完善有待进一步研究。

2.6放射测量检测技术的进展及研究放射测量技术作为化学与物理相结合的一种微生物检测技术，主要是对培养基内的微生物进行检测。放射测量法的检测原理比较简单，其检测方法类似于碳元素追踪法，通过利用培养基内细菌生长、繁殖的过程，来确定样品中微生物存在与种类。放射测量检测技术具有简单、准确、快速、自动化等诸多优势，其也被广泛应用于食品微生物中大肠埃希菌的定量检测当中[2]。

2.7电阻抗检测技术的进展及研究电阻抗检测技术的检测原理为，培养基中微生物在不断生长过程中，可将其电惰性底物代谢成为活性底物，进而使得培养基中电导性增大，且培养物的阻抗降低。另外，培养基中微生物在生长过程中可产生一种特征性阻抗曲线，可依据电阻改变的图形对检测细菌进行鉴定。电阻抗检测技术具有反应速度快、重复性好、敏感性与特异性强等优点，在食品微生物检测中的应用也比较广泛。

3食品微生物检测技术的发展趋势

基于食品微生物检测技术中目前存在的不足之处，其发展趋势必将朝着以下几点进行：

①标准化与国产化。从我国目前对食品微生物的检测情况来看，大多数检测都是采用国外的快速检测法，这也造成了检测成本高，缺乏国家相应的标准等缺点。因此，大力在引进并融合国外的先进技术，研究出符合我国检测产品标准的检测技术，同时还需加大力度建立国家标准与规范。②提高质量与准确性。应用新工艺、高科技，提高与实验相关产品的质量，并优化设计特殊培养基，进而提高检测技术的灵敏度与特异性。③充分发挥各检测技术的优势。在进行食品微生物检测时，必须熟知各种检测技术的优缺点，有效地做到扬长避短，从而使其检测技术能够最大程度地发挥自己的优势[3]。

4结束语

随着科技的快速发展，相信在不久的将来，各种存在缺点的食品微生物检测技术将会被新型、先进、简便的微生物快速检测技术所替代。通过对检测技术与标准的不断完善与规范，使其能为人类的公共卫生、疾病预防、饮食健康等方面做出巨大的贡献。

参考文献

[1]王云国，李怀燕.食品微生物检验内容及检测技术[J].粮油食品科技，2010，3（3）：40-43.