微生物培养的方法精选(九篇)

第1篇：微生物培养的方法范文

通讯作者：李琼秀

【摘要】 目的 分析BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统和罗氏培养法在肾结核患者尿液分枝杆菌培养中的诊断价值。方法 收集昆明结核病防治院2007年9月～2010年8月期间256例门诊和住院的肾结核患者尿液标本，用BacT/ALERT3D和罗氏培养这两种方法进行结核分枝杆菌培养，分析两种培养方法对肾结核的诊断价值。结果 BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统阳性率为43%，罗氏培养法阳性率为25.4%，BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统的阳性率明显高于罗氏培养法，结果所需时间短于罗氏培养法，但是培养费用高于罗氏培养法。结论 通过结核分枝杆菌培养两种方法的比较，对选择肾结核的检查方法有一定意义。

【关键词】 肾结核； 分枝杆菌培养； BacT/ALERT3D

肾结核病是由于结核菌侵犯了人体的肾脏组织而导致的疾病，肾结核起病隐匿，不易发觉，导致肾结核病很难在发病早期得到及时的确诊，患者尿液结核分枝杆菌培养可以确诊肾结核，使疾病在早期得到治疗，传统的罗氏培养法和BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养两种方法都能帮助诊断肾结核，为了解两种方法的临床应用价值，特对两种方法进行比较，以对选择检查方法有所帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源：系2007年9月～2010年8月期间笔者所在医院门诊和住院肾结核患者的尿液标本，共计256份。BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养142例，其中男87例，女55例，年龄19～56岁，平均37岁；罗氏培养114例，其中男68例，女46例，年龄23～55岁，平均35岁。同时收集其相关临床资料。

1.1.2 试剂与仪器 BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养仪和与其配套的MB/Bact培养瓶、MAS抗生素添加剂。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 留取全量夜尿，静置4～5 h后，弃上清液，取沉淀部分10 ml,经3000 r/min离心30 min,取沉淀进行碱处理［与等倍量4%氢氧化钠（NaOH）混合，处理15 min］后接种。

1.2.2 标本接种 （1）BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统:加10 ml reconstituein flud至抗生素MSA中使其溶解，然后加0.5 ml溶解的MAS到MB/BacT培养瓶中，用注射器取0.5 ml标本加入该培养瓶中，经扫描培养瓶条码后放入BacT/ALERT3D仪内自动检测。（2）罗氏培养法:取标本0.1 ml均匀接种在整个培养基斜面上，每份标本接种2支培养基。接种后斜面向上于37 ℃环境中平放24 h后，检查培养基污染情况，拧紧瓶盖，直立放置，37 ℃继续培养。罗氏培养法结果判断参照临床技术操作规范-结核病分册［1］。

1.3 统计学分析 采用χ2检验。

2 结果

2.1 两种检测方法的结果 在肾结核活动期，较易检出结核菌，256份标本用两种方法检测，结果BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统的阳性率为43%，罗氏培养法阳性率为25.4%，BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统的阳性率明显高于罗氏培养法（P＜0.01）。见表1。

表1 两种检测方法的结果（n,%）

注：χ28.51，P＜0.01

2.2 两种检测方法的时间和费用 BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统细菌生长报告阳性时间平均为12.8 d；罗氏培养法细菌生长报告阳性时间平均为20.2 d。BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统的收费标准为70元，罗氏培养法的收费标准为30元。见表2。

表2 两种检测方法的时间和费用

3 讨论

结核病是当今全球范围对人类最具威胁性的感染性疾病之一，是单病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病。中国是全球结核病的重灾区，结核病的发病总人数居全球第二。由于不规范的抗结核治疗导致耐药结核分枝杆菌，尤其是耐多药结核病（MDR-TB）的产生与传播是造成全球结核病严峻形势的主要原因之一［2］。2006年以来，广泛耐药结核病（XDR-TB）的出现使得结核病的防控更加棘手［3，4］，肾结核病的检测周期长，罗氏培养法得到结果的时间晚于BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养。罗氏培养法的阳性率也明显低于BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养。肾结核的诊断方法较少，BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养诊断肾结核就显得尤为重要和珍贵。

BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统原理：此系统用一个比色计传感器和反射光监测溶解于培养基内的CO2的存在和生成。如果检测标本中有结核分枝杆菌存在，则生物代谢培养基中的底物产生CO2。位于每个培养瓶底部的透气传感器的颜色就会由蓝绿色变为黄色。即使轻微的颜色改变亦导致系统监测的反射率增加，瓶底的反射率每10分钟由仪器监测并记录一次，在报告阳性时，大概每毫升的细菌浓度为106～107。

BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养检测系统自动化程度高、阳性率高、污染率低、检测时间短等优势，然而BacT/ALERT3D全自动微生物快速培养仪需要进口，与其配套的培养基也需要进口，价格昂贵，成本明显高于罗氏培养法。

参 考 文 献

［1］ 中华医学会.临床技术操作规范-结核病分册.第1版.北京：人民军医出版社，2004,3:32.

［2］ 刘家云，徐修礼，孙惠平，等.耐药结核分枝杆菌基因突变分析.中华检验医学杂志，2010，33：594-598.

［3］ Banerjee R,Schecter GF,Flood J,et al. Extensively drug-resistant tuberculosis:new strains,new challenges. Expert Rev Anti Infect Ther,2008,6:713-724.

第2篇：微生物培养的方法范文

方法：在对微生物检验中，探讨培养基的相关配制、灭菌、性能测试、无菌试验和储存等方面，探讨微生物检验中培养基质量的控制对策。

结果：在微生物检验中，培养基配制所用的容器选用玻璃或者不锈钢等制品较合适，采用离子交换水和蒸馏水；在对培养基进行灭菌的前后要对pH值进行测定；在自行对培养基进行配制的过程中，要严格按照标准规定，对每次的支配做好详细记录；用于配制培养基的电子天平或者酸度剂要每年都进行检定。

结论：微生物检验中要保证对培养基治疗的控制，采取相应的控制对策，才能够保证微生物检验的可靠性和准确性。

关键词：微生物检验培养基质量控制

【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1008-1879（2012）11-0026-02

培养基为微生物的生长繁殖或者积累代谢等提供了所需的营养基质，也是微生物检验工作的基础，微生物检验中最重要的工作环节就是培养基的使用和配制。培养基的配制是否合格，对微生物的鉴定、分离、生长和检验的结果起到很重要的作用，因此对于培养基质量的控制是至关重要的。但是随着商品化的发展，成品培养基和干燥培养基也在迅速发展，由于行业的设备和生产工艺较落后，对于培养基质量控制的方法不够健全，加上市场的监管薄弱，这些因素都严重影响了培养基的质量。保证实验室的环境能够适应培养基的配制，让培养基的质量得到有效控制。现在对控制微生物检验中培养基的质量控制对策进行探讨，报道如下。

1资料和方法

1.1一般资料。自制培养基要严格按照处方的要求，培养基的成分中大多数是生物制品，不同批次产品在质量上也存在差异性，因此要对处方的要求做好详细的记录，注意成分的添加顺序，能够保证分装灭菌前各成分之间能够互溶或者完全均匀。在对微生物检验中，探讨培养基的相关配制、灭菌、性能测试、无菌试验和储存等方面，探讨微生物检验中培养基质量的控制对策。

1.2方法。

1.2.1为了防止离子混入培养基，对微生物的生长造成影响，配制培养基的容器不适合选用铁或者铜，培养基的含铜量不宜超过0.3mg，否则不利于细菌的生长；培养基中含铁量不宜超过0.14mg，否则对细菌毒素的产生会起到妨碍作用。培养基配制所用的容器选用玻璃或者不锈钢等制品较合适，玻璃器皿选择中性硬料的玻璃，防止培养基酸碱度受到影响。

1.2.2对培养基的用水进行配制，应该选用离子交换水或者蒸馏水，因为二者不含杂质。自来水或者井水里面钙和镁等元素的含量较多，经过高压灭菌之后易出现沉淀现象，不符合配制培养基的质量要求。对培养基的pH值进行校准，微生物正常的生长代谢离不开合适的pH值范围。不同的微生物需要的pH值不同，因此在配制的过程中要注意对培养基的pH值进行校准。培养基要求的pH值是经过高压灭菌后的值，经过灭菌后培养基的pH值会下降，能够对pH值进行更好的掌握。

1.2.3培养基一般会采取高压蒸汽式灭菌，按照厂家提供的要求进行灭菌，对已经配制的培养基要立即进行灭菌，避免微生物繁殖消耗养分，让培养基的酸碱度得到改变。自行对培养基进行配制时要严格按照规定标准进行，对每次的支配做好详细记录，能够在出现问题时，通过这些资料对问题原因进行追查。如果使用的是商品培养基，在购买的时候要向通过认证的厂家所要相关检测报告。商品培养基的配制采用的标准要根据使用的目的进行选择。

2结果

在微生物检验中，培养基配制所用的容器选用玻璃或者不锈钢等制品较合适，采用离子交换水和蒸馏水；在对培养基进行灭菌的前后要对pH值进行测定；在自行对培养基进行配制的过程中，要严格对每次的支配做好详细记录；用于配制培养基的电子天平或者酸度剂要每年都进行检定。

3讨论

做好对培养基的灭菌和无菌试验，对于容器较大的培养基，在灭菌时间上要进行适当的延长。对于特殊的培养基，要按照要求进行高压灭菌，高压后进行迅速冷却，避免因为长时间保存影响到营养成分。对灭菌有不同要求的培养基不能够集中灭菌，做好灭菌记录，不能够进行重复式的高温灭菌。对于配制好的培养基，要进行无菌试验，保证灭菌的效果。如果配制大量的培养基，可以采取抽样的方法进行无菌试验，对样本进行观察，没有细菌生长的培养基才能被使用。即使之前做过无菌试验，但是在接种样本时，要对液体培养基的颜色、是否有长菌、有没有脱水干裂的现象进行观察。

对培养基的性能进行测试和贮存，基础的培养基细菌的生长要发育良好，而且能够充分体现出细菌的特征。在对培养基进行选择上，应该选择已知的阳性和阴性菌进行接种培养，保证应该有的一些生化反应的能力。对于商品培养基，没有开封的保质期应该为2到3年，已经开封的保质期为6个月，商品培养基要贮存在阴凉干燥的环境下，避免有强烈的光直射，对于已经过期的培养基进行排除，成品培养基不适合放在冰箱里贮存，应该在保质期时间内使用。灭菌之后的培养基保存的有效期不同，不能够做统一的规定。灭菌后不可以立即就使用，要避光，在干燥的环境下保存。

微生物检验工作的基础就是控制好培养基的质量，关系到检验工作的可靠性和准确性。每年请专业的机构对配制培养基所用的酸度计和电子天平进行检定，对培养箱、高压灭菌器和无菌室紫外线的等进行定期的检查，预防因为忽视环节而导致培养基出现质量问题，让微生物的检验偏离了科学性和客观性。培养基的质量问题能够直接影响到微生物的检验结果，因此要保证对培养基质量的控制，避免出现检验误差。采取相应的控制对策，才能够保证微生物检验的可靠性和准确性。

参考文献

[1]姜海燕.浅谈微生物检测中培养基的质量控制[J].中国现代药物应用，2011，58（01）：58-59

[2]张新秀.浅谈微生物检验培养基的质量控制方法[J].医学信息（上旬刊），2011，73（02）：73-74

第3篇：微生物培养的方法范文

论文关键词：微生物学；能力培养；基础能力；综合运用能力；科研创新能力

加强大学生能力培养，提高学生综合素质，是高等教育的核心任务。通过什么样的方式、方法，采取何种有效的途径来提高学生的综合能力，是高等教育面临的重大课题。作为高等教育的重要阵地，学校教育既要注重知识的传授，更要注重能力的培养。如何在专业课教学过程中，渗透学生能力培养，是我们在微生物学课程教学中一直努力的方向。微生物学是现代生物科学一门重要的基础学科，也是一门应用性很强的学科，其应用范围已经渗透到农业、工业、医药、环保、生物工程等各个领域。多年的教学中，我们在对学生的基础能力、综合运用能力及科研创新能力的培养等方面进行了有益的尝试，取得了一定的成效。

一、基础能力培养

基础能力是一种积极学习的态度、自主学习能力及团结协作能力。要培养学生的基础能力，就要让学生有目标，有兴趣，带着问题去主动学习，在主动学习中培养团结协作能力。

1.上好绪论课，培养学生积极学习的态度

要培养学生积极学习的态度，首要问题是培养他们学习的兴趣。兴趣是最好的老师，是学生最持久的内在动力，是推动学生自主学习的主观因素，是学生发挥主观能动性的基础。在微生物学课程教学中，我们非常重视绪论课在培养学生学习兴趣方面的作用。俗话说，好的开头等于成功的一半。第一印象往往给人留下难以磨灭的记忆。绪论课教学，既是课程入门的向导，又是师生合作的开始。如果绪论课的教学能引起同学们的兴趣，就等于抓住牛鼻子，后面的“戏”就好唱了。根据这一特点，我们充分发挥第一堂课的作用。一是广泛收集材料，精心准备教案，认真组织课堂教学，每一个环节不轻易放过。二是从日常生活中的常见现象导出微生物与人类生产、生活的关系。如从日常生活中的衣物发霉、剩饭变酸现象，到生产中酿酒、做面包馒头、制酱、制腐乳、豆豉等等引出微生物概念。三是以讲故事的方式引出微生物的发展史、关键人物及其贡献。由荷兰一个小镇上的布商列文·虎克从小喜欢磨制透镜，一个偶然的机会，他发现透镜能将小东西放大，在这个基础上，研制出了显微镜，至此引出了微生物的发现；由当今誉满全球的法国白兰地、巴黎时装引出巴斯德解决酒变质、家蚕病害等贡献，导出微生物的发展。四是采用形象的比喻与生动的语言列举大量的数据和典型的事例说明微生物的特性。由空气、土壤、水体、人体表面、人体消化道、人民币纸币等携带的微生物种类和数量介绍微生物种类多、数量大、分布广。五是以充满激情和向往的语气介绍微生物学的发展动态和热门话题。向学生展示微生物学研究的前缘领域如DNA芯片、微生物传感器、微生物燃料电池、定向药物、基因导入等，拉近学生与现代科学发展的距离，使学生知道本学科当前发展的趋势、研究的热点及争论的问题……。让学生在老师富有感召力的教学中，深切感受到科学的道路并不是一帆风顺的，机会是给一个时刻准备着的人，从而对微生物学产生浓厚的学习兴趣，热切地希望跟随老师去探讨奥妙无穷的微生物世界。

2.采用讨论式教学，培养学生自主学习能力

微生物学是我校生物工程、食品科学与工程、食品安全与检测等专业的重要基础课程，在课程教学中，有关微生物基本理论、基础知识、基本技能的内容如微生物的纯培养方法、微生物细胞的结构与功能、微生物的营养、微生物的生长繁殖及其控制、病毒等内容进行重点阐述，让学生对微生物学知识有一个较全面的了解和掌握。而对资料性、一般演绎性的内容则“点讲”，即在介绍基本概念后，老师引导出章节内容主题和重点，留有更多的未知知识空间，提出问题，让学生带着问题学习讨论，以培养学生自主学习能力。例如，在微生物多样性这一章学习时，学生已经系统学习了微生物学基本理论和基础知识，课堂上，我们提出问题：微生物在工业、农业、医药、环保方面的应用情况怎样？哪些微生物在这些领域有应用？微生物在这些领域的应用前景怎样？如何合理利用和保护微生物资源？课堂外，让学生带着问题分组讨论：学生就某一个方面的问题分组（2～3人）讨论，通过查找资料，得出答案，每组确定一名代表公开作答，其他同学提问补充，教师讲评。由于课堂知识的学习是有限的，课外知识的学习是无限的，这种方法的采用增强了学生对课堂的参与性，加深了对所学内容的理解，拓展了知识范围，充分调动了学生学习的主观能动性，有效地培养了学生的自主学习能力，学生终生受益。

3.开设大型综合实验，培养学生团结协作能力

微生物学是一门实践性很强的学科，搞好微生物实验教学对加深学生对微生物学理论知识的理解，培养学生的团结协作能力，提高学生实验技能具有非常重要的意义。为此，我们在实验课教学中，将微生物学实验课的内容分为基础实验、综合实验和创新实验三大部分。学生在完成基本技能训练实验，对培养基的配制、常用的灭菌方法及无菌操作要点、微生物标本片制作、显微镜使用、细胞大小测定及细胞计数、十倍稀释法、平板活菌计数等有一个全面的了解与掌握后，开设大新综合实验，以提高学生实验能力及团结协作能力。实验内容大多来源于生产和生活的实际课题。如窖池窖泥的微生物检测及优势菌分析；不同大曲中微生物检测与鉴定及其糖化力、发酵力测定；发酵酸奶活性菌分离、培养与鉴定及发酵酸奶的制备；常见食品卫生指标检测及食品卫生质量标准指定等等。实验期间，全天候开放实验室，教师提要求、理思路，引导学生设计实验方案，学生3～5人一组，利用业余时间，集体智慧完成实验方案设计，分工合作完成药品材料与仪器准备以及取样、接种、分离、灭菌、培养基配制等一系列工作，遇到困难，在教师启发下，小组成员分析讨论并予以解决。每一步、每一个环节操作不规范或小组成员之间配合不默契，均会导致前功尽弃。大型综合实验的开设，不但有利于培养学生实验设计能力、动手能力、独立思考能力和处理实际问题的能力，而且有利于培养学生的团队精神、小组成员间的分工与协作能力。

二、综合运用能力培养

综合运用能力指提出问题、分析问题及解决问题的能力。在课堂教学中，通过教师引导使问题呈现出来，让学生看到问题，进而提出问题；通过介绍一些典型问题的探索过程和分析方法，启迪学生对问题进行分析和评价，最终形成问题解决的方法与策略。

如讲解病毒一章时，讲完烈性噬菌体与温和噬菌体定义与特点后，老师介绍工业发酵生产中出现的异常发酵现象——菌细胞生长缓慢，甚至没有生长；耗糖缓慢或停止，发酵缓慢，周期长；PH不降反而上升；有大量泡沫产生，发酵液粘度增加；产物积累少甚至不积累；发酵液逐渐变清，镜检时发现菌数显著减少，菌体不规则，有“云雾状”碎片等，从而使问题呈现出来。学生通过教师的介绍与引导，在脑海中提出疑问：似乎菌细胞慢慢被吃掉，留下一些碎片，什么原因导致细胞裂解呢？教师适时导出：细胞裂解原因之一是细胞走向衰老凋亡，原因之二是遭受噬菌体感染。学生分析：根据生产菌生产周期和发酵时间，排出细胞自然衰老，细胞的裂解可能是遭受噬菌体感染。教师提问：如何证明你的判断是正确的？噬菌体在光学显微镜下不见？学生得出：通过检测噬菌斑有无判断。教师提出：噬菌体是如何污染的（污染途径）？在发酵生产中如何防止噬菌体污染？学生纷纷利用学过的知识，在教师的启发下，从污染途径着手，提出这样防止噬菌体污染的若干种方法，教师加以总结和完善。老师的循循善诱，为学生打开了丰富的想象空间，学生运用学过的知识去求解未知领域，从而让学生的学习由感知、记忆水平提高到想象、思维高度，极大地培养了学生知识综合运用能力。

三、科研创新能力培养

大学是每个学生打基础的阶段，这是高等教育的一种共识。大学打基础阶段内涵是很丰富的，她强调全方位的基础建设，其中重要一环就是科研能力的锻炼培养和提升。在教学中，我们不但将科研意识、思维方式和教师承担的科研课题融入教学中，还通过学生申报和参与大学生创新试验项目来培养学生的科研创新能力。

例如在学习微生物细胞的化学组成时，教师介绍知识点：碳在各种微生物细胞中约占50%，N在各类微生物细胞中含量差异较大，期中细菌、酵母含N较高，占7%～13%，霉菌含氮量较低，约占5%，因此细菌与酵母常作单细胞蛋白（scp）生产菌。教师由此拓展授课内容：利用微生物生产单细胞蛋白的重要意义、单细胞蛋白的应用范围及其局限性等，然后提问学生：如何大规模发酵生产单细胞饲料蛋白？要发酵生产单细胞蛋白，三个问题需要解决：一是发酵生产菌的选择问题。必须选择蛋白质含量高的菌细胞，这样的菌细胞可以从自然界筛选，也可以从菌种保藏中心购买。如果希望产量有所提高，可以通过诱变（选择合适诱变剂、诱变方法，对突变菌株进行粗筛、复筛等等）以筛选高产突变株用于发酵生产。二是原料问题。由于大规模发酵生产原料使用量大，要选择价格低廉、来源广泛的原料，最好是微生物能分解利用的农副产品及其废料。三是发酵生产工艺优化问题。发酵生产中要控制好酸碱度、通气量、接种量、培养温度、培养时间以获得最高产量。由此导出教师的科研课题——“微生物发酵再生曲酒丢糟的研究”选题思路及科研开展——教师如何选择菌种，通过正交试验进行纯种发酵、双菌共酵、两步发酵、多菌种混合发酵、添加纤维素酶再发酵等生产单细胞蛋白。这种在继承、传授知识的同时，将教学与科研相结合的教学模式，能将学生引进科学领域，学习科研方法，激发了学生学习微生物的兴趣，促进了“教学带动科研，科研促进教学”的良性循环，培养了学生的科学素养和创新思维方式，促进了学生科研创新能力的全面提高。

第4篇：微生物培养的方法范文

【关键词】 苯甲醇辅料； 微生物限度； 薄膜过滤法； 方法学验证

【Abstract】 Objective：To establish a method of microbial limit test for pharmaceutical excipient benzyl alcohol and make a applicability test for this method.Method：The test method was carried out according to the raw material and pharmaceutical excipient’s requirements in volume Ⅳ of Chinese Pharmacopoeia 2015.The membrane filtration method was applied to the tests for total viable aerobic count，total combined yeasts and molds count detection and specified bacteria.The bacteria，fungi or yeasts count method for microbial limit test was validated as described above for each of the microorganism tested.And the method for specified bacteria test was also validated.Result：The results showed that the recovery ratios of all the tested strains were in accordance with the acceptance criteria of the pharmacopoeia and the method for specified bacteria test was reliable.Conclusion：The method is suitable for the microbial limit test of pharmaceutical excipient benzyl alcohol.

【Key words】 Pharmaceutical excipient benzyl alcohol； Microbial limit test； Membrane filtration method； Method validation

First-author’s address：Jiangxi Institute for Drug Control，Nanchang 330029，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.013

微生物z查作为药品安全的重要指标，其标准制定也随着药品产业的发展及对药品质量高要求的需求而不断提高。2015年版《中国药典》对微生物限度检查法做了较大的修订，新版药典将2010年版药典附录中的Ⅺ J微生物限度检查法拆分为三个部分，分别为微生物计数法、控制菌检查法和微生物限度标准[1]。其中检验所用实验菌液、检验方法、培养基、培养温度等都做了不同程度的更改。新版药典更加关注生产过程中的微生物控制，在药品生产、储藏和流通各个环节中，药品生产企业均应严格遵循GMP的指导原则。制剂、原料及辅料、中药提取物及中药饮片的微生物限度与2010年版《中国药典》比较给出了具体的限度标准。本文按照2015年版《中国药典》的操作要求及指导原则，对苯甲醇药用辅料微生物限度检查法进行研究及适用性实验，以确定出适宜、有效的检查方法[2]。苯甲醇也称苄醇，英文名Benzyl alcohol，是最简单的含有苯基的脂肪醇，苯甲醇为无颜色透明液体，有微弱的芳香气味，稍溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂[3-4]。苯甲醇用途广泛，主要应用于环氧树脂及涂料领域，也广泛应用于日化、食品、医药等领域。近年来随着相关行业的发展，国内外对苯甲醇的需求量不断增加，2011年医药领域苯甲醇的消费量约为1200 t。由于其具有麻醉、镇痛的功效，苯甲醇在制剂中用作防腐剂和局部止痛剂，但因不良反应较大，婴儿使用时有过致死案例，目前主要用作防腐剂。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BKQP-50L型高压蒸汽灭菌器（济南博鑫生物技术有限公司）；M1-211A微波炉（美的集团有限公司）；XP-S电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；SW-CJ-2D净化工作台（苏州净化有限公司）；Heal Force-900C 生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；HWS-250恒温恒湿实验箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司）；3758CN低温培养箱（赛默飞世尔科技中国有限公司）；HH.S21-6电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）；ZW-2008智能集菌仪（温州维科生物实验设备有限公司）；薄膜过滤器（浙江泰林生物技术股份有限公司）。

1.2 主要试剂 苯甲醇，批号：20151201、20151202、20151203三个批次，由江西阿尔法高科药业有限公司提供；培养基有：胰酪大豆胨液体培养基，批号160119；胰酪大豆胨琼脂培养基，批号160128；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号160119；沙氏葡萄糖液体培养基，批号151222；肠道菌增菌液体培养基，批号：160203；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基，批号160614；麦康凯液体培养基，批号160511；麦康凯琼脂培养基，批号160511；甘露醇氯化钠琼脂培养基，批号151124；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，批号151102，以上培养基均来源于北京陆桥技术有限责任公司。实验菌种有：枯草芽孢杆菌[CMCC（B） 63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B） 10104]、大肠埃希菌[CMCC（B） 44102]、白色念珠菌[CMCC（F） 98001]、黑曲霉[CMCC（F） 98003]，以上菌种均购自中国药品生物制品检定所。

1.3 验证方法

1.3.1 实验菌株菌液制备 将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的胰酪大豆胨液体培养基置35 ℃培养24 h，分别取以上新鲜培养物各1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-3～10-7，做活菌计数备用。将白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养基置25 ℃培养2 d，取新鲜培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-4，做活菌计数备用。将黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂培养基置25 ℃培养7 d，加5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液将黑曲霉孢子洗脱，吸取出孢子悬液1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相比后，取1 mL稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-4，做活菌计数备用。

1.3.2 供试液制备 取供试品10 mL，置无菌锥形瓶中，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 mL，混匀，作为1∶10供试液，备用。

1.3.3 细菌、霉菌及酵母菌数计数适用性实验

1.3.3.1 实验组 （1）需氧菌计数：取上述1∶10供试液1 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，在最后一次冲洗液中加入不大于100 cfu的实验菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉），滤干，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂平板上，实验平板置35 ℃培养箱培养。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌培养3 d，白色念珠菌、黑曲霉分别培养5 d，逐日观察平板生长情况。（2）霉菌和酵母菌计数：取上述供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，在最后一次冲洗液中加入不大于100 cfu的实验菌（白色念珠菌、黑曲霉），滤干，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂平板上，实验平板置25 ℃培养箱培养5 d，逐日观察平板生长情况。

1.3.3.2 供试品对照组 取上述1：10供试液，以稀释液代替菌液，同实验组操作，测定供试品本底菌落数。

1.3.3.3 菌液对照组 取相应稀释液替代供试液，同实验组操作加入实验菌液并进行微生物回收实验。

1.3.3.4 判断标准 计数方法适用性实验中，实验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。

1.3.4 控制菌检查方法的适用性实验

1.3.4.1 金黄色葡萄球菌检查 实验组：取上述1∶10供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，加入不大于100 cfu金黄色葡萄球菌实验菌（将实验菌加入最后一次冲洗液中），取膜置于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24 h，取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，35 ℃培养72 h，观察平板生长情况。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照金黄色葡萄球菌检查法操作。

1.3.4.2 铜绿假单胞菌检查法 实验组：取上述1∶10供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，加入不大于100 cfu铜绿假单胞菌实验菌（将实验菌加入最后一次冲洗液中），取膜置于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24 h，取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，35 ℃培养72 h，观察平板生长情况。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照铜绿假单胞菌检查法操作。

1.3.4.3 大肠埃希菌检查法 实验组：取上述1∶10供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，滤干，取膜置于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入不大于100 cfu的大肠埃希菌液，35 ℃培养24 h，取上述培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，42 ℃培养24 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，35 ℃培养48 h。取麦康凯琼脂平板上菌落划线接种于营养琼脂平板进行分离纯化，经纯化后的培养物，接种至含5 mL MUG培养基的试管内，培养，于5、24 h在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培B基作本底对照。观察后，沿管壁加入数滴靛基质试液，观察MUG培养基颜色变化。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照大肠埃希菌检查法操作。

1.3.4.4 耐胆盐革兰阴性菌检查法 实验组：将上述1：10供试液置于25 ℃预培养2 h。取上述预培养供试液10 mL（2份），置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，分别加入不大于100 cfu的大肠埃希菌液和不大于100 cfu的铜绿假单胞菌液（将实验菌液加入最后一次冲洗液中），取膜置于100 mL肠道菌增菌液体培养基中，35 ℃培养箱中培养48 h后，上述培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，置35 ℃培养24 h，观察平板生长情况。若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，代表检出耐胆盐革兰阴性菌。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照耐胆盐革兰阴性菌检查法操作。

2 结果

2.1 需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法适用性实验结论 在三次独立的需氧菌计数方法适用性实验中，5种菌株的回收比值均在0.5～2.0范围内，符合药典规定。因此可照此方法测定苯甲醇的需氧菌总数。在三次独立的霉菌和酵母菌计数方法适用性实验中，白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均在0.5～2.0范围内，符合药典规定。因此可照此方法测定苯甲醇的霉菌和酵母菌总数。见表1。

2.2 控制菌检查方法学适用性实验结论 在进行金黄色葡萄球菌检查、铜绿假单胞菌检查、大肠埃希菌检查和耐胆盐革兰阴性菌检查四种控制菌的适用性实验中，实验组均检出阳性实验菌，阴性对照组无菌生长。因此，可照此方法进行苯甲醇的控制菌检查。见表2～5。

3 讨论

与2010年版药典相比，2015年版药典在微生物控制方面做了很大幅度的改变。新版药典将“方法验证”改为了“方法适用性”，适用性是把实验条件、供试品等因素作为一个整体来评价，更为完整科学。新版药典中的培养体系也有变化，首先是培养基的改变，需氧菌计数所使用的培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基[5-9]，霉菌和酵母菌计数使用沙氏葡萄糖琼脂培养基。培养温度也做出了适当的调整，需氧菌计数培养温度由35～37 ℃调整为30～35 ℃，霉菌和酵母计数培养温度由25～28 ℃变为20～25 ℃。测试菌株也发生了改变，采用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌三株菌进行方法适用性实验，其中铜绿假单胞菌替换了2010版药典中的大肠埃希菌。而且需氧菌计数的适用性实验中，需要使用5种菌株，相较于2010版药典的3菌株增加了白色念珠菌和黑曲霉[10-11]。此外，计数回收方法中增加了新的检测方法-MPN法，可作为平板计数法和薄膜过滤法不适用时的补充。

控制菌检查方面，新版药典控制菌检查法除梭菌和白色念珠菌外，其余检查指标在预培养和增菌培养这一步骤中都统一使用了胰酪大豆胨液体培养基，大大方便了实验操作。新版药典新增了耐胆盐革兰阴性菌的检查，替代了《中国药典》2010年版的大肠菌群的检查。在各控制菌项下，生化实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定实验”改为“采用其他适宜方法进一步鉴定”，检测方法更加灵活多变，实验室可以根据自身情况灵活选择适宜的方法，调高检验效率和结果可靠性[12-14]。

药用辅料是药品重要的组成部分，它们的质量关系到所有药品的安全性[15-16]。与原版药典相比，2015年版药典对原料及辅料的微生物限度控制更加严格规范[17-18]。《中国药典》2010年版附录ⅪJ微生物限度检查法中对“原料及辅料”的微生物限度的描述为“参照相应制剂的微生物限度标准执行”[19]。而《中国药典》2015年版四部1107非无菌药品微生物限度标准中，第5点明确规定了“非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准”[20]。其中，需氧菌总数限度为103 cfu/g或cfu/mL，霉菌和酵母菌总数限度为102 cfu/g或cfu/mL。控制菌未做统一规定，需要根据原辅料及其制剂的特性和用途、制剂的生产工艺等因素检查具有潜在危害的微生物[17-18]。由于苯甲醇为药用辅料，考虑在医药领域中苯甲醇主要作为防腐剂、局部止痛及药物溶剂作用，实验设计控制菌检查大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和耐胆盐革兰阴性菌检查。

苯甲醇作为防腐剂广泛应用于药品制剂中，为更好的控制本产品的质量，本研究建立了其微生物检查方法，并对方法适用性进行了研究。由于苯甲醇作为防腐剂具有一定的抗菌作用，采用平皿法进行需氧菌总数计数适用性实验时，发现本品对实验菌株具有较强的抑制能力，回收率比值达不到要求。为消除苯甲醇的抑菌干扰，本文采用薄膜过滤法进行菌落计数检查和控制菌检查，保证实验结果的准确性和科学性，从而保证临床用药安全有效。

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第5篇：微生物培养的方法范文

关键词：陈化烟叶；寡营养菌；细菌多样性；16 S rDNA序列；聚类分析

中图分类号：TS41+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1292-06

烟叶在制成成烟之前需要经过漫长的陈化期，烟叶陈化是卷烟工业的一种初加工方法。当年收获的新烟叶，其品质都存在不同程度的缺陷，不宜直接用于制造卷烟，必须进行陈化处理[1]。在陈化发酵过程中，烟叶主要化学成分发生变化，青、杂气和刺激性大大减轻，香气显露，气味醇和，色泽均匀并加深[2]。烟叶表面的微生物发酵作用，对烟叶的陈化起着重要的作用。新烟叶在经过漫长的陈化阶段后，烟叶的品质进一步得到改善，有害物质的含量也随着降低。这个时期一般需要2～3年，如何缩短这个时期一直是科研工作者的研究热点[1，3-5]。

烟叶表面含有丰富的微生物已有大量研究报道，如Zhao等[6]通过非纯培养的方法对多种不同陈化时期的烟叶表面微生物进行了研究，采用16S rDNA PCR-DGGE技术进行多样性分析发现，早期陈化阶段各种烟叶拥有相似的优势微生物种群结构，主要有5种细菌，其中3种为未培养微生物。Huang等[7]通过RLFP 技术构建OTUs（Operational taxonomic units）克隆文库比较陈化与非陈化烟叶细菌多样性发现，在陈化的烟叶中存在大量的未培养微生物。韩锦峰等[8]通过对未发酵、自然陈化及人工发酵期间的烤烟叶面微生物进行分离、鉴定，并对不同发酵时期微生物进行动态研究，结果表明，未发酵烤烟叶面微生物数量最多，但是随着自然陈化及人工发酵的进行，叶面微生物数量均逐渐减少，且以芽孢杆菌属（Bacillus）和梭状芽孢杆菌属（Clostridium）为优势种群。朱大恒等[9]研究也发现烤烟中以芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌为优势种群。而且大量研究表明烤烟叶面微生物中，细菌占绝对优势，放线菌和霉菌较少，细菌中以芽孢杆菌属为优势菌群，霉菌中以曲霉为优势菌群。优良品种烤烟叶面微生物的数量较大，种类也较多。因此研究不同烟草表面的微生物多样性具有重要意义。

寡营养菌概念提出时没有特指哪一类的微生物[10]。直到1979年，Kuznetsov等[11]才提出了寡营养菌是特指那些第一次培养时可以在含碳浓度为1～15 mg/L培养基中生长的细菌，并把它分为两类，一类为在寡营养和富营养条件下均能生长的细菌，称为兼性寡营养菌；另一类为只能在寡营养培养基中生长的细菌，称为专性寡营养菌。科研工作者现在已经从多种生境中分离到了寡营养菌，它广泛存在于海洋、湖泊、河流、土壤甚至饮用水中。Arthur[12]指出了寡营养菌营养偏好的原因，Button等[13]则研究了它对营养物质利用的动力学机制，发现寡营养菌的米氏常数较低，对营养物质的亲和力大于富营养菌，因而在寡营养条件下能够获得竞争优势。国内关于寡营养菌的研究起步晚，报道得也少。潘惠霞等[14]通过分离新疆沙漠中寡营养菌并对其在防风固沙方面进行研究发现，一些寡营养菌产生的胞外多糖能够对沙粒产生粘连作用。和振花等[15]对极地海水中寡营养菌多样性进行了研究。

目前尚没有研究烟叶中寡营养菌的报道，根据以往关于陈化烟叶表面微生物分离和多样性的报道推测，在漫长的陈化过程中，尤其是对于烟草品质提升有关键作用的中后期，可利用的简单营养物质几乎消耗殆尽，大部分菌株死亡，只有寡营养菌株才有可能生长。随着陈化时间的延长，烟草的等级就越高，品质就越好，最后起作用的主要是寡营养菌。因此，研究陈化烟叶中寡营养菌的多样性，对于解释传统的陈化作用如何利用微生物来改善烟叶品质有着十分重要的意义。此次试验尝试利用寡营养培养基对陈化烟叶表面的可培养寡营养菌进行分离和多样性研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 烟叶样品 2010年的广西百色烤烟K326 C3F等级，湖北恩施烤烟云85 C3F等级，湖北恩施烤烟云85 B3F等级，湖北宜昌马里兰烟马里兰1号中部一级。

1.1.2 培养基 DNG固体培养基：TSB 15 mg，去离子水100 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。DNG液体培养基：TSB 15 mg， Gellan agar 1.5 g，CaCl2溶液37.5 μmol/L，去离子水100 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉15 g/L。

1.2 方法

1.2.1 材料的预处理 取适量的烟叶在无菌条件下剪碎，用100 mL去离子水浸泡10 min，在摇床上200 r/min振荡20 min。利用无菌纱布过滤，取滤液，然后离心去上清，用1 mL无菌水重悬。

1.2.2 陈化烟叶中菌株的分离与筛选 取100 μL滤液进行10倍梯度稀释，稀释液涂布DNG固体平板，并用封口膜或者一次性PE手套密封，于25 ℃培养2～4周，每隔3 d观察1次，将获得的单菌落进行分区划线进一步分离与纯化。将已获得纯培养的菌株接种于LB固体培养基中，观察菌落的生长状态。

1.2.3 陈化烟叶中分离菌株的16S rDNA分子鉴定 提取已获得纯培养菌株的总DNA[16]，采用16S rDNA通用引物[17]进行PCR扩增，正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物为1492R： 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。按如下条件进行PCR扩增：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，54 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30个循环；72 ℃、7 min。PCR产物采用凝胶纯化试剂盒纯化，纯化步骤参照试剂盒说明书进行。纯化的PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序结果进行BLAST同源比对。

1.2.4 不同烟叶分离寡营养菌的系统聚类分析 将每种烟叶所分离寡营养菌的16S rDNA序列进行BLAST比对分析，挑选每个菌株最大一致性的同源菌株的16S rDNA序列一起利用软件Clustal W 2.0和MEGA 5.1进行聚类分析，构建系统进化树。

1.2.5 专性寡营养菌的鉴别 将筛选出的菌株再次在富营养培养基中培养，不能生长的为专性寡营养菌；能生长的菌株，为了排除污染的可能性，将可以生长的菌株进一步用寡营养培养基培养，能在寡营养培养基生长的为兼性寡营养菌。

2 结果与分析

2.1 广西百色烤烟K326 C3F等级可培养寡营养菌的分离与16S rDNA系统进化分析

通过利用寡营养和长期培养的方法，从该烟叶中共分离出12株菌株，具体见表1。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1进行聚类分析，构建系统进化树如图1所示。从图1可以看出，在C3F等级陈化烟叶中一共存在10个菌属，它们分别为泛菌属（Pantoea）、假单胞菌属（Pseudomonas）、微杆菌属（Microbacterium）、古氏库特菌属（Kurthia gibsonii）、不动杆菌属（Acinetobacter）、副球菌属（Paracoccus）、法氏沃氏菌属（Wautersiella falsenii）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、微球菌属（Micrococcus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）。通过1.2.5的方法发现菌株C3F18只能在寡营养培养基生长，由此可以看出在此种陈化烟叶中只有C3F18为可培养的专性寡营养菌，其他菌株均为兼性寡营养菌株。

2.2 湖北恩施烤烟云85 C3F等级可培养寡营养菌的分离与16S rDNA系统进化分析

通过利用寡营养和长期培养的方法，从该烟叶中共分离出10株菌株，具体见表2。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1进行聚类分析，构建系统进化树如图2所示。从图2可以看出，在恩施云85 C3F等级陈化烟叶中一共存在7个菌属，分别为假单胞菌属、古氏库特菌属、微小杆菌属、微球菌属、类芽孢杆菌属、不动杆菌属和芽孢杆菌属。C3FN7和C3FN18只能在寡营养培养基中生长，由此可以看出在此种陈化烟叶中只有C3FN7和C3FN18为可培养的专性寡营养菌，其他的菌株均为兼性寡营养菌株。

2.3 湖北恩施烤烟云85 B3F等级可培养寡营养菌的分离与16S rDNA系统进化分析

通过利用寡营养和长期培养的方法，从该烟叶中共分离出15株菌株，具体见表3。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1进行聚类分析，构建系统进化树如图3所示。从图3可以看出，该种陈化烟叶中一共存在10个属，分别为副球菌属、微球菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、肠杆菌属（Enterobacter）、节杆菌属（Brevibacterium）、欧文氏菌属（Erwinia）、盖球菌属（Kytococcus）、短小芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）以及泛菌属。分离的菌株都能在富营养培养基上生长，可见从此种烟草中分离的均为兼性寡营养菌。

2.4 湖北宜昌马里兰烟马里兰1号中部一级可培养寡营养菌的分离与16S rDNA系统进化分析

通过利用寡营养和长期培养的方法，从该烟叶中共分离出18株菌株，具体见表4。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1进行聚类分析，构建系统进化树如图4所示。从图4进化树中可以看出，该种陈化烟叶中一共存在10个属，它们分别为假单胞菌属、短波单胞菌属（Brevundimonas）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、法氏沃氏菌属、副球菌属、微球菌属、盖球菌属、考克氏菌属（Kocuria）、鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）、类香菌属（Myroides）。菌株M10和M32只能在寡营养培养基中生长，由此可以看出在此种陈化烟叶中有2种可培养的专性寡营养菌。

3 讨论

由于寡营养菌独特的生态功能，对于减少烟叶中有害物质，提高烟叶的经济价值，增加烟农收入，改善烟草存储条件，改善吸烟者的健康状况都有重要的意义。通过分离这4种烟叶的寡营养菌，结合烟叶本身的特色，发现微生物的多样性和烟叶的品种和质量有一定的内在联系，例如湖北恩施烤烟云85中的B3F和C3F两个等级烟叶中的Kytococcus schroeteri和Bacillus pumilus以及Enterobacteriaceae bacterium为湖北恩施烤烟云85中独特的微生物，又因为B3F的物质含量多些，对应的微生物种类也相应多些。而4种烟叶中由于马里兰烟叶与其他烤烟烟叶有着明显不同，微生物种类一是数量上多于其他三类，种类上也和其他三类差异很大，这一是因为马里兰烟叶本身的香气物质不一样，物质种类有差异，物质分解后产物也有差异，二是马里兰烟叶在凉棚中晾制，产生微生物也会更多。

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第6篇：微生物培养的方法范文

1.(2013·四川卷，10)普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种(过程如图甲所示)。

(1)图甲中，过程①需要的酶有________________________________。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以________作为碳源。②、③过程需重复几次，目的是____________________________。

(2)某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是______________;推测该同学接种时可能的操作失误是______________。

(3)以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种________菌的发酵罐需要先排气，其原因是________________________________________________________________________。

(4)用凝胶色谱法分离α淀粉酶时，在色谱柱中移动速度较慢的蛋白质，相对分子质量较________。

答案　(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶　淀粉　进一步筛选纯化获得分解淀粉能力强的酵母菌　(2)稀释涂布平板法　涂布不均匀　(3)工程酵母　工程酵母菌分解淀粉产生葡萄糖的能力强，导致酒精发酵产生CO2的速率更快

(4)小

解析　(1)图甲中过程①为构建基因表达载体，需要的酶有限制性核酸内切酶及DNA连接酶;欲筛选可直接利用淀粉的菌种，宜制备以淀粉为碳源的选择培养基;图示②、③过程需重复几次，其作用在于“纯化”，从而进一步筛选出分解淀粉能力更强的酵母菌。(2)图乙所示培养基平板中的菌落呈分散分布，应为采用稀释涂布平板法接种的结果，然而，该平板上菌落并非“均匀分布”而是相对集中于左侧，这可能是由于制作平板时“涂布不均匀”所致。(3)若以“淀粉”为原料，则相对于普通菌种，工程酵母菌因转入了α淀粉酶基因，其利用淀粉的能力将更强，故发酵产生CO2的能力更强，因此需要先排气。(4)凝胶色谱法分离蛋白质的原理是相对分子质量较小的分子，能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。

2.请回答下列生物技术方面的问题：

(1)测定亚硝酸盐含量的操作程序是：①配制溶液;②______________________________;③______________________;④比色。

泡菜发酵过程中产生的亚硝酸盐在盐酸酸化条件下，与对氨基苯磺酸的反应产物能与N-1-萘基乙二胺盐酸盐偶联成________色化合物。

(2)为获得一种能高效降解农药的细菌(目的菌)，向培养基中加入某种化合物，将初步筛选得到的目的菌转到固体培养基中，常采用的接种方法是______________;实验结束后，使用过的培养基应该进行处理后再倒掉，这样做是为了____________________________。

(3)研究发现，固定化强度强的酵母颗粒发酵效果好，且稳定性高、使用寿命长。某机构利用上述装置，将2%、2.5%、3%的海藻酸钠分别利用2%、3%、4%的X溶液进行凝胶化处理，所得到的固定化酵母颗粒的强度及在28 ℃下发酵48 h 后的酒精产量见下表：

海藻酸钠(%) 2 2.5 3 2 2.5 3 2 2.5 3 X溶液(%) 2 2 2 3 3 3 4 4 4 固定化强度(g/30个) 930 950 990 1 030 1 100 1 140 1 170 1 170 1 160 酒精量(%) 6.7 6.5 6.5 6.7 6.4 6.2 6.7 6.4 6.3 由表格内容可以看出，随着X溶液浓度的增加，________________增加;凝胶固定化效果较好和酒精产量较大的海藻酸钠与X溶液浓度分别是________、________。

答案　(1)制备标准显色液　制备样品处理液　玫瑰红　(2)平板划线法　防止造成环境污染　(3)固定化强度　2%　4%

解析　在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。常用的接种方法有两种，平板划线法和稀释涂布平板法;一般来讲在固体培养基上直接进行纯化的，需要用平板划线法;用液体培养基培养后再纯化的，需要稀释涂布平板法。实验结束后，使用过的培养基应该进行处理后再倒掉，这样做是为了防止致病微生物威胁人体健康和对环境的污染。固定化细胞操作更容易，对酶活性影响更小，且能更新，容易回收，可连续性生产，成本自然更低。

3.从自然菌样中筛选理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样选择培养纯种分离性能测定。

(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。若培养噬盐菌的菌样应从____________环境中采集。

(2)选择培养指创设特定环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然菌样中分离到所需特定微生物的培养方法。人们对富含耐高温淀粉酶的微生物选择培养应选择以____________为碳源的选择培养基，并在________条件下培养。

(3)实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌的效果。高温灭菌的原理是高温使微生物的________________等物质发生变性。________灭菌法是微生物研究中应用最广、效果的湿热灭菌法。

(4)下图甲表示在平板培养基上的第一次和第二次划线，请在图乙中画出第三次划线。划线后在恒温培养箱中培养时，培养皿须倒置，目的是__________________。

(5)植物组织培养过程中也要十分注意灭菌及避免被杂菌污染。在配制好的MS培养基中，若要促进愈伤组织的生长，需要进行的处理是__________________________。

答案　(1)高盐　(2)淀粉　高温　(3)蛋白质和核酸　高压蒸汽　(4)如右图　避免水滴污染培养基　(5)添加比例适中的生长素和细胞分裂素

解析　(1)嗜盐菌就生活在高盐环境中，如海滩等环境。(2)耐高温淀粉酶应存在于以淀粉为碳源且在高温环境中生存的微生物体内。(3)实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌的效果。高温灭菌的原理是高温使微生物的蛋白质和核酸等物质发生变性，高压蒸汽灭菌法是微生物研究和教学中应用最广、效果的湿热灭菌法。(4)每划一个新区域前都要对接种针进行灭菌处理。(5)培养基配制时应先溶化，再调整pH值，然后灭菌。添加比例适中的生长素和细胞分裂素可促进愈伤组织的生长。

4.下图为某工厂设计的芦柑加工工艺流程，请分析回答：

(1)为提高出汁率，过程②可使用________酶处理，该酶是一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、__________________酶，为提高该酶的利用率常采用________技术;过程③常常接种的菌种是________，并且需要严格控制氧分压。

(2)芦柑果皮可用来提取香精油，过程④采用的方法是________法。为提高出油率，材料需经过石灰水________处理，然后漂洗。

(3)现获得一株无子突变芦柑，研究人员要在较短时间内获得大量突变植株，采用______________的方法，该过程中需要对外植体进行________处理。在上述过程中，所用到的培养基及器材都需要严格灭菌，工作台需要用__________擦拭。培养基中除基本营养成分之外，还需要添加____________。

答案　(1)果胶　果胶分解酶和果胶酯　固定化酶　酵母菌

(2)压榨　浸泡　(3)植物组织培养　消毒　70%的酒精　植物激素

解析　果胶酶能够分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清;工业上为提高该酶的利用率常采用固定化技术;植物芳香油的提取方法有蒸馏、压榨和萃取等，过程④采用的方法是压榨法;要在较短时间内获得大量突变植株，采用植物组织培养的方法。

5.家庭中泡菜的制作方法是：新鲜的蔬菜经过整理、清洁后，放入彻底清洗并用白酒擦拭过的泡菜坛中，然后向坛中加入盐水、香辛料及一些“陈泡菜水”，密封后置于温度适宜的地方。有时制作的泡菜会“咸而不酸”或“酸而不咸”，前者是用盐过多，后者是用盐过少。

(1)用白酒擦拭泡菜坛的目的是________。密封泡菜坛的原因是：①________________________________________________________________________;

②________________________________________________________________________。

(2)若制作的泡菜“咸而不酸”，最可能的原因是__________________。

(3)加入“陈泡菜水”的作用是____________________。

(4)制作泡菜的过程中，有机物的干重将__________;菜坛内有机物的种类将________。

(5)乳酸菌与酿制果醋的菌种在代谢方式上的主要区别是________________________________________。

(6)有位同学在家制作泡菜时，为避免杂菌污染而向泡菜坛中加入了青霉素，结果发酵失败，原因可能是____________________。

(7)若要获得大量乳酸菌菌种，应选用培养基培养，培养基中应有________、________、________和________等营养物质。

答案　(1)消毒　①乳酸菌是厌氧生物，密封后造成缺氧环境　②防止杂菌进入　(2)大量的食盐抑制了乳酸菌发酵(大量的食盐杀死了乳酸菌)　(3)提供乳酸菌菌种(接种)　(4)减少　增加　(5)乳酸菌是厌氧型细菌，醋酸菌是好氧型细菌　(6)青霉素杀死了乳酸菌　(7)碳源　氮源　水　无机盐

解析　(1)用白酒擦拭泡菜坛的目的是消毒。乳酸菌是厌氧生物，泡菜坛密封后造成缺氧环境，同时密封可以防止杂菌进入。(2)制作泡菜时，若放入的食盐过多，抑制了乳酸菌发酵造成泡菜“咸而不酸”。(3)“陈泡菜水”中含有大量的乳酸菌菌种，制作泡菜时加入“陈泡菜水”可以实现接种乳酸菌菌种的目的。(4)制作泡菜的过程中，由于乳酸菌呼吸作用的消耗有机物的干重将减少，但坛内有机物的种类将增加。(5)乳酸菌是厌氧型细菌，醋酸菌是好氧型细菌。(6)青霉素可以杀死乳酸菌，故制作泡菜时加入了青霉素，会造成发酵失败。(7)若要获得大量乳酸菌菌种，应选用培养基培养，培养基中应有碳源、氮源、水和无机盐等营养物质。

6.微生物和人们的生产生活密切相关，请完成下列相关问题。

(1)有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。请分析回答：

①培养基中加入的化合物A是________，为微生物的生长提供________，这种培养基属于________培养基。

②为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，应向培养基中加入____________。

③在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前，可用液体培养基培养，增加微生物的浓度。若获得纯净的菌株，常采用平板划线的方法进行接种，此过程所用的接种环应采用________的方法进行灭菌;还可用______________法进行接种操作。

(2)微生物与果汁饮料的贮存及果醋的生产密切相关。请回答：

①果汁饮料的包装瓶上写着105 ℃高温瞬时灭菌，这样做的目的是既保证________________________________，又不会________________。

②苹果醋是欢迎的饮料之一，其生产过程中利用了________的发酵作用，该过程需控制的温度条件是________。

③在传统发酵技术中，果醋的制作往往在果酒制作基础上进行，请用相关反应式表示：____________________________。

答案　(1)①纤维素　碳源　选择　②刚果红　③灼烧　稀释涂布平板　(2)①杀死引起果汁变质的病原微生物　破坏果汁品质　②醋酸菌　30～35 ℃　③C2H5OH+O2CH3COOH+H2O

解析　(2)果汁高温瞬时灭菌后，既保证果汁中无病原微生物，又不会使果汁中营养物质被破坏。

7.请回答下列生物技术方面的问题。

(1)微生物接种的方法中最常用的是平板划线法和____________________，前者是通过________在琼脂固体培养基表面连续________的操作，将______________逐步________到培养基的表面。

(2)微生物在果酒、果醋、腐乳、泡菜等食品加工方面应用广泛，其中与果醋、泡菜制作密切相关的微生物分别是____________和______________。为提高果酒的品质，需通过培养基筛选得到纯净的酵母菌菌种，在微生物学上，此类培养基称作______________。

(3)在微生物的实验室培养中常常要进行消毒和灭菌的工作。灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括____________。

答案　(1)稀释涂布平板法　接种环　划线　聚集的菌种　稀释分散　(2)醋酸菌　乳酸菌　选择培养基　(3)芽孢和孢子

解析(1)微生物接种常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法;平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面

连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。(2)与果醋制作密切相关的微生物是醋酸菌;与泡菜制作密切相关的微生物是乳酸菌;选择培养基具有筛选作用。(3)消毒是指使用较温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

8.柑橘是重要的经济植物，不仅果肉的营养价值高，而且橘皮中含有的橘皮精油具有很高的药用价值。请回答下列相关问题：

(1)柑橘的果实可以用来生产果汁。生产果汁时，为了更容易地榨取柑橘汁，提高澄清度，常需要加入________酶;为了使该酶得到充分的利用，节约成本，需要控制好________。

(2)欲利用柑橘的果实制作果酒，常需要________菌来进行发酵。果酒制作是否成功，需发酵后用________来鉴定。

(3)由于橘皮精油的有效成分在用水蒸气蒸馏时会发生部分水解，使用水中蒸馏法又会产生________的问题，所以一般采用压榨法提取橘皮精油。采用压榨法提取橘皮精油时，为了提高出油率，压榨前需要将柑橘皮________，并用石灰水浸泡。

(4)利用植物组织培养技术可以快速繁殖优良的柑橘种苗。进行植物组织培养时，常用的培养基是________培养基，在配制好的此培养基中常需要添加的植物激素是______________。

答案　(1)果胶　酶的用量　(2)酵母　重铬酸钾　(3)原料焦糊　干燥去水　(4)MS　生长素和细胞分裂素

9.许多植物含有天然香料，如薄荷叶中含有薄荷油。现用薄荷叶提取薄荷油。回答问题：

(1)薄荷油是挥发性物质，提取薄荷油时应选用__________(鲜、干)薄荷叶作原料，其原因是________________________________________________________________________

______________。

(2)用萃取法提取薄荷油时，采用的溶剂是________，原理是

________________________________________________________________________。

(3)用水蒸气蒸馏法提取薄荷油时，在油水混合物中加入氯化钠的作用是______________。常用于分离油层和水层的器皿是________。分离出的油层中加入无水硫酸钠的作用是________________________，除去固体硫酸钠的常用方法是________。

答案　(1)鲜　薄荷油易挥发，鲜薄荷叶中薄荷油含量高

(2)乙醚　薄荷油能溶于乙醚，且乙醚沸点低、易蒸发

(3)使乳化液分层　分液漏斗　吸去油层中的水分　过滤

解析　(1)薄荷油易挥发，鲜薄荷叶中薄荷油含量高，更易提取。(2)薄荷油是有机物，易溶于有机溶剂乙醚，且乙醚沸点低、易蒸发，故常用乙醚作为萃取剂。(3)氯化钠的作用是使乳化液分层;用于分离油层和水层的常用器皿是分液漏斗;无水硫酸钠可吸去油层中的水分，使油层分离;除去固体硫酸钠常用过滤法。

10.(2012·海南卷，30)回答下列关于腐乳制作的问题：

(1)腐乳是豆腐经微生物发酵后制成的食品。多种微生物参与了该发酵过程，其中起主要作用的微生物是________，其产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解为__________________和________________;其产生的________能将豆腐中的脂肪水解为________和________。

(2)发酵完成后需加盐腌制，加盐还可以抑制________的生长。

(3)腐乳制作的后期可加入由酒和多种香辛料配制而成的卤汤。卤汤除具有一定的防腐作用外，还能使腐乳具有独特的________。

答案　(1)毛霉　小分子的肽　氨基酸　脂肪酶　甘油　脂肪酸　(2)微生物　(3)风味

9 胡萝卜素是一种常用的食用色素，可分别从胡萝卜或产胡萝卜素的微生物菌体中提取获得，流程如下：

(1)筛选产胡萝卜素的酵母菌R时，可选用______________或平板划线法接种。采用平板划线法接种时需先灼烧接种环，其目的是________________________________________________________。

(2)培养酵母菌R时，培养基中的蔗糖和硝酸盐可分别为酵母菌R的生长提供________________和______________。

(3)从胡萝卜中提取胡萝卜素时，干燥过程应控制好温度和________________以防止胡萝卜素的分解;萃取过程中宜采用________________方式加热以防止温度过高;萃取液浓缩前需进行过滤，其目的是________________。

(4)纸层析法可用于鉴定所提取的胡萝卜素。鉴定过程中需用胡萝卜素标准品作为____________________。

答案　(1)稀释涂布平板法　杀灭接种环上的微生物

(2)碳源　氮源　(3)干燥时间　水浴加热　滤去萃取后的固体物　(4)对照

解析　(1)接种微生物的方法主要是稀释涂布平板法和平板划线法，接种过程为了避免其他杂菌的污染，要做无菌操作，所以接种前需对接种环进行灭菌操作。(2)蔗糖主要提供碳源，当然也可以作为能源物质，硝酸盐含氮元素，可提供氮源。(3)温度过高、干燥时间过长会导致胡萝卜素分解;由于萃取剂往往有挥发性，直接加热时挥发出来的有机溶剂遇明火易爆炸;萃取后需将原料中的固体物滤去。(4)提取出来的胡萝卜素往往不是纯的，用标准样品主要起一个对照的作用。

10.请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题。

(1)植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、________和________。

(2)芳香油溶解性的特点是不溶于________，易溶于__________，因此可用______________作为提取剂来提取芳香油。

(3)橘子果实含有芳香油，通常可用________作为材料来提取芳香油，而且提取时往往选用新鲜的材料，理由是______________。

(4)对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的固体物质获得乳状液可采用的方法是________。

(5)得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的________层，原因是________________。加入氯化钠的作用是______________________。

答案　(1)蒸馏法　萃取法　(2)水　有机溶剂　有机溶剂

第7篇：微生物培养的方法范文

【关键词】 培养基 质量控制 微生物检测

食品微生物检测是不同食品标准规定的食品必检项目之一，是按照一定的检测程序和质量控制措施，确定单位样品中某种或某类微生物的数量或存在状况。而培养基质量是微生物检测工作的基础，直接决定检测结果的准确性、可靠性。由于食品微生物培养基品种较多，目前大约有数千种不同的培养基，有液态、半固体、固体几种形式。而培养基质量控制国内可以参考的资料不多，国外的起点较高，又不适宜我国国情，依据GB/T27405《实验室质量控制规范 食品微生物检测》（1），结合实验室实际情况，明确了培养基的购置、贮存、制备、性能测试等过程的质量控制措施，以确保培养基质量满足检测要求。

1 培养基的采购、验收和储存

培养基的采购应从合格供应商中选择厂商采购，每批培养基需供应商提供批号和相对应的质检报告。购买的培养基到货后，由药品管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。验收合格后，交由检测人员接受保管，并在每瓶培养基上加贴信息标签。 根据不同的培养基的特性，妥善保存。干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮，并确保在有效期内用完。需低温保存的培养基应存放在相应温度的低温柜中。

2 培养基的配制

2.1 自制培养基

自制培养基，要严格按照所检样品检测方法标准要求的配方进行准确称量配制、称量时各种不同组分，要用专用的角匙，避免交叉污染；干粉培养基易吸潮，如房间环境湿度较大时，应提高称量速度，完毕后及时盖紧瓶盖。制备培养基的水PH值在5.5―7.5之间，应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水，最好不使用离子交换器生产的去离子水。严格控制配制过程中灭菌的温度、时间，配制完成后应检查PH值，观察其颜色、透明度、杂质、凝胶稳定性等。

2.2 成品培养基

随着市场经济的发展，成品微生物培养基使用越来越多，成品培养基的特点就是方便、快捷、但成品较高。需要注意的是不同厂家，或同一厂家不同批号的相同培养基不能混用。

2.3 培养基溶解注意事项

（1）加热溶解时不能用使用铜或铁锅，防止金属离子混入培养基中，影响微生物的生长[1]；

（2）溶解培养基容器的大小需大于溶解后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基受热，体积膨胀溢出；

（3）含有琼脂类的培养基，在加热溶解前可浸泡数分钟，加热时一定要进行搅拌，以防琼脂粘在容器底部；对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，反复冻容最多只能两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去；

（4）为避免烧焦和沸腾溢出，量少的培养基最好使用水浴进行加热；

（5）烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。

2.4 培养基的灭菌

（1）常用培养基一般采用高压蒸汽湿热灭菌，通常是121℃15min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。有些菌种代谢周期较短，已配制好的培养基必须在15分钟内灭菌，可避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。为避免高温破坏培养基的营养成分，降低琼脂的凝胶强度，必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复灭菌。

（2）部分培养基（如嗜盐琼脂培养基、胆硫乳培养基等）只能煮沸灭菌。

（3）对热敏感的培养基或添加物质，应采用膜过滤方法进行过滤灭菌。

（4）即用型不需灭菌，应参见相关标准或培养基使用说明书，直接使用。

（5）常规应用指示剂监测灭菌过程；可用生物指示剂如嗜热脂肪芽孢杆菌监测杀伤芽孢的效果。

（6）灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，不能长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。并应加贴标识，标注：名称、配置日期、成分、pH值等信息。

3 培养基质量控制方法

3.1 理化试验方法

3.1.1 培养基物理性检测[2]

外包装密封性应完好，无泄漏等现象；颜色一般为浅色，状态应为干燥粉末，无吸潮结块现象；成品培养基应防止过分失水，还应注意成品培养基如平皿裂纹、充碟不均、溶血（血平板）、冷冻、过多的汽包和斑点、污染，表面凹凸不平等现象，如有上诉缺陷，应做好相应记录，并及时通知供应商，查明原因并加以纠正。

3.1.2 PH值的测定

灭菌前后都应测定其PH值，看是否满足标准要求和灭菌前后PH值的变化差异是否正常，成品培养基是否符合标签要求。注意测量时尽量使培养基温度控制在20℃-25℃。

3.1.3 凝胶强度的测定

凝胶强度表明培养基中琼脂凝固的程度。可用凝胶强度测定仪测试。灭菌条件，特别是PH值会影响凝胶强度。凝胶强度统一使用g/cm2作为标准来表示培养基的硬度。成品干燥培养基的凝胶强度450-650g/cm2之间，半固体培养基的适宜凝胶强度在90g/cm2左右。

3.2 微生物学实验方法[3]

3.2.1 无菌试验

试验用培养基在按标准或使用说明配制成新鲜的产品培养基，应与标本一致的环境条件进行培养，观察培养基应无菌落生长。

3.2.2 稳定性试验

培养基在保质期或有效期内，各项指标都应在保质期内得到保证。不同培养基，保质期不同，具体时间根据实际情况决定。

3.2.3 细菌学质控试验

一般是测试培养基的灵敏度和准确度。是培养基的重要内在质量指标，它是用已知的标准菌株按照规程和检验标准的要求测定培养基的性能是否符合，测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株，应来自国际/国家标准菌种保藏中心ATCC标准菌株。所有培养基在使用前均应进行细菌学质控试验。

3.2.4 固体培养基试验方法

（1）平板涂布法：将试验和对照培养基做成4mm厚的平板并使表面干燥，将试验和对照培养基进行系列稀释度接种，每个稀释度各取4滴，分别加入4个试验和对照培养基；从高稀释度开始涂布，培养平板，并对数量和菌落形态进行评价。

评价方法：PR（生长率）=Ns（试验培养基的菌落数）/N0（对照培养基的菌落数）

根据培养基的不同，是否为选择性培养基等具体情况，查表得出满意率。

（2）划线法：将平板按同一方向划线，开始为涂抹区，然后用火焰对接种针灭菌，经灭菌冷却后的接种针，划过涂抹区引三道线出来至干净的平板，然后继续划线，菌液浓度逐步降低，最终能分离出单个菌落。

评价方法：此法属于半定量，在实际操作中多用于定性质控，检查是否有典型菌落生长。

3.2.5 液体培养基试验方法

一般为目标和非目标微生物的定量稀释法，液体培养基一般为10ml/管待检。不同培养基，根据不同标准接种少量的目标微生物、和大量的非目标微生物到试验肉汤和对照肉汤中培养，每种肉汤接种培养后涂布到非抑制性培养基上。

4 结语

随着我国食品安全检测的不断加强，食品卫生微生物检测越来越重要，我国微生物培养基的生产、经营、和使用管理制度将日趋严格，做好食品卫生微生物培养基质控验证工作将是我们面临的重点。

参考文献：

[1]李志芬，刘锐萍，杜伟，刘珊珊.微生物检测用培养基、试剂质量控制方法研究[J].中国微生态学杂志，2013年5月第25卷第5期.

第8篇：微生物培养的方法范文

[关键词]微藻；兼养能源

中图分类号：S968.4 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）14-0291-01

随着化石能源的日渐枯竭，全球的能源危机日益加剧，目前已发生了多场以石油掠夺为目的的战争，世界安全局势因能源危机而日益紧张。与此同时，化石能源的利用所造成的环境污染不断加剧，特别是近年来由于煤炭燃烧和汽车尾气排放的增加，雾霾的出现愈发频繁。因此，对清洁可持续替代能源的开发迫在眉睫。目前的清洁能源有天然气、氢气和乙醇汽油等，这些替代能源主要由作物秸秆等材料经发酵制得，因此对农业生产的依赖比较强，而现在由于城市的发展和土壤污染可用耕地面积日益减少，使得这些能源的开发利用受到很大的制约。我们生活的地球约三分之一的面积为海洋，海洋中蕴含着巨大的生产力。因此，人类社会未来发展的方向必然是海洋，未来能源的开发也将来自于海洋。海洋藻类特别是海洋微藻是主要的生产者，也是未来能源生产的主要利用对象。

1.微藻营养方式的研究

目前对利用进行微藻生物能源生产的研究已有许多报道，研究主要集中在探索微藻产生如氢气、甲烷和油脂等代谢产物的机理和提高代谢产物产量的方法上。无论想要获得哪种微藻代谢产物均需要对微藻进行大规模培养，微藻的生物量通常与其代谢产物的量呈正相关，因此微藻的培养是进行一切其它研究的起点和重点。微藻具有多种不同的营养方式，大多数是以光合自养的形式生长，也有部分藻具有利用外加有机物进行异养生长的能力。对于大规模的工业培养，采用光合自养方式不利于获得大量的微藻生物量这主要是由于当微藻细胞密度达到一定程度时会阻挡光的照射引起光能限制。于是研究人员发现有一些微藻可以利用有机物作为唯一碳源进行异养生长，通过异养生长可以解决光抑制及二氧化碳供应的问题，它为进一步增加微藻的细胞密度和生产力提供了可能性。

但并不是所有的微藻都可以进行异养生长，针对于这种现象有研究者提出有3种可能的假说：一是由于缺少必要的酶，有些微藻由于缺少分解和利用某种有机碳的酶而不能在该种碳源培养基中进行异养生长，然而这并不代表其不能在其它碳源的培养基中异养生长，因此可以尝试其它碳源。二是由于部分微藻存在吸收有机碳的屏障，这些微藻的细胞膜上缺少转运有机碳的通道和载体，使微藻无法利用外界有机物。为了打破这一屏障有研究者通过向微藻中转入人的红细胞葡萄糖转运蛋白等基因帮助微藻建立吸收外源有机物的途径。三是在有机物分解代谢过程中产生的中间产物对微藻的影响，有些中间产物对微藻具有毒害作用使其无法继续生存。还有些中间产物虽然对微藻无害，但其代谢过程与ATP的合成不相偶联，无法为微藻生长提供能量，同样不能生存。

近年来报道的微藻培养系统有：自养、化能异养、光激活异养、光异养和兼养培养。化能异养是指在完全无光的条件下利用有机碳进行异养生长。光激活异养是每天对微藻进行脉冲式短暂照射，及施以光照又不足以支持微藻进行自养生长。光异养是在含有机碳源的培养液中加入合适浓度的光系统Ⅱ活性抑制剂二氯苯基二甲基脲（DCMU）来实现，非环式电子传递被阻止，但光系统Ⅰ仍可以起作用产生ATP。或者通过在不足以支持微藻进行自养生长的光照强度下利用有机碳进行异养生长。兼养培养是在足以支持微藻进行自养生长的光照强度下利用有机碳进行异养生长。小球藻FACHB484在不同营养方式下的生长情况为：兼养生长>光异养生长>光激活异养生长>化能异养生长>光合自养。文献报道，通常微藻兼养的比生长速率等于异养培养与自养培养比生长速率之和，兼养培养兼有光合自养与异养代谢的性质，在光合自养条件下，二氧化碳作为唯一碳源维持微藻生长，在光异养条件下，非环式电子传递被阻断，二氧化碳不能被同化吸收，微藻只能利用有机碳进行生长[1]。因此，或许会出现白天自养而夜晚异养的情况。

对于异养培养外加有机物的选择十分重要，这关乎微藻培养的成败。常用的碳源有葡萄糖、醋酸盐、乳酸盐和酵母提取物。而氮源主要有蛋白胨、玉米浆和尿素。这些物质各有优缺点，其中较好的是以醋酸盐作为碳源，醋酸盐可以调节pH值同时可污染的杂菌种类和数量有限，选用何种有机碳源进行微藻异养化取决于微藻的种类、异养化生产的终产物以及碳源成本等。以尿素作为氮源，尿素在微藻利用过程中的pH值的变化小且成本低。一般而言，氮源浓度的增加可以提高蛋白质的含量，但会降低脂类和碳水化合物的含量。因此，为了既使微藻能够有充足的碳源来吸收合成生长代谢所需的糖类物质和储存能量的脂类物质，又不至于因为氮源的不足或过量而影响蛋白的合成，在高细胞密度、高目标产物产率的异养培养中有必要确定培养基中初始的C/N。

对于微藻营养方式可以通过一些方法进行检测，DNP是一种疏水性质子载体，为氧化磷酸化的解偶联剂，DNP能轻易扩散穿过线粒体内膜，以质子化的形式将膜间隙的氢离子带回线粒体并释放到基质中，从而消除了线粒体内膜两侧的质子浓度梯度，破坏了激活ATP合成酶的质子驱动力，ATP不能被合成，使氧化和磷酸化脱偶联，氧化释放的能量全部以热的形式散发。通过处理效果可以判断微藻生长的能量来源。验证微藻是否存在呼吸代谢途径和末端氧化系统的酶，可以采用丙二酸钠和叠氮化钠对微藻进行抑制试验。琥珀酸脱氢酶是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，具有严格的立体专一性。丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶的强有力的竞争性抑制物，可以阻断三羧酸循环。细胞色素氧化酶是电子传递链末端的酶。细胞色素和P450辅基中的铁原子可以与叠氮化合物形成一个配位键，阻断呼吸链的电子传递。如果微藻对丙二酸钠和叠氮化钠的抑制都敏感[2]，则说明该微藻含有氧化呼吸的关键酶。

2.面临的问题

异养培养也面临着一些问题，首先是杂菌污染问题，由于异养培养体系中含有大量的有机物，因此特别适合微生物生长，而大部分的微生物与微藻是竞争关系，并且会产生一些有害物质抑制微藻生长。为了解决这个问题可以对微藻进行无菌化处理，纯化出无菌的微藻并在培养过程中添加抗生素抑菌，用于除菌的抗生素应具备两个特点：较强的抑菌或杀菌能力和对微藻较小的伤害性。不同的微藻种类其杂菌群落不同，所以选择的抗生素种类和给药浓度也不同。常用的抗生素有青霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素以及氯霉素等。单种抗生素给药往往难以完全除菌，所以通常将若干种抗生素联合使用以达到更好的除菌效果。由于大规模工业生产中保持绝对无菌十分困难，因此也可以人为添加与微藻可以共生又可抑制杂菌生长的微生物。另一个问题是确定有机物浓度的问题，随着培养的进行有机物的含量逐渐减少，而初始的浓度不能过高，因此需要不断的进行补料，同时及时排除多余的离子，维持相对稳定的培养环境。可以通过控制稀释率和乙酸的添加量，把残留的乙酸维持在较低的水平。同时一些盐和有毒的代谢产物可以利用小孔径的滤膜而被排除，而直径较大的微藻细胞被保留下来。由于营养方式的不同可使微藻所含的化学成分发生明显的变化，研究者发现在兼养时的叶绿素比值及类胡罗卜素的含量都有所下降，和自养的细胞相比异养状态下的细胞的总脂含量是非常低。研究发现利用葡萄糖作为唯一的碳源进行异养生长时能比自养产生更多的多不饱和脂肪酸同时脂肪酸的种类也发生了变化。

3.结论

与光合自养和单纯异养培养相比，兼养的微藻产量提高，成产成本降低，因此是未来微藻培养的主要方式。今后的研究应主要放在兼养藻种选育，通过筛选或基因改造获得适合兼养生长的微藻；碳源氮源选择，筛选成本更低更适于工业生产的碳氮源，同时产生的中间产物对微藻没有毒害作用，利于兼养生长；兼养条件优化，优化兼养培养中的光照强度及光照周期使自养与异养更加协调；培养工艺的提升，提升生物反应器的性能，采用更适于光能利用的培养形式如生物膜贴壁培养。通过以上优化将大大提高微藻的生产效率降低生产成本，微藻的培养应用会日益增多，微藻必将在未来能源、粮食、健康和环境保护中发挥重要作用。

参考文献

第9篇：微生物培养的方法范文

有助于正确鉴别标本来源和性质,排除污染,确定感染

正确留取标本,对报告结果至关重要｡如下呼吸道感染患者送检的标本是来源于呼吸道还是口腔｡除肉眼观察外,更可靠的方法是涂片染色镜检｡呼吸道标本以脓细胞､黏液丝､柱状上皮细胞为主;口腔唾液以鳞状上皮细胞为主｡涂片染色可直接反映标本留取是否合格｡

涂片染色镜检是鉴别炎性标本与非炎性标本的可靠方法,脓细胞的数量直接反映感染存在的可能性及感染的程度;另一方面,涂片染色与培养结果符合与否,可以帮我们排除污染,确定感染｡

有助于判断机体某些系统微生态是否平衡

由于细菌培养受培养基､环境因素､培养条件以及细菌本身生长速度等多种客观因素的影响,培养生长的微生物种类及数量不一定能客观反映某些系统为生态情况;而标本涂片革兰染色不受这些因素的影响,能够真实客观地反映微生物包括某些厌氧菌的生态平衡情况｡涂片染色对上呼吸道､口腔､下肠道､泌尿生殖道等有菌部位标本尤其重要｡

有助于对感染菌的判断

正常情况下,人体与常居菌形成一种稳定的微生态平衡｡由于某些原因,一旦机体的这种微生态平衡遭到破坏,某种非优势菌取得优势的时候即可引起机体的免疫反应,进而可引起感染｡脓细胞参与对感染菌的吞噬作用｡因此,脓细胞所大量吞噬的细菌即是引起感染的病原菌｡

有助于提高标本阳性检出率

标本涂片染色镜检见较多脓细胞,而找不到病原菌时,就要考虑结核杆菌､军团菌､病毒等感染的可能,并进一步有针对地做相应的特殊培养｡如果标本涂片中脓细胞伴随细菌出现,而普通培养没有相应细菌生长,应考虑厌氧､某些需氧菌､生长缓慢的细菌,对所用抗生素敏感细菌的感染以及培养失控的可能性,进一步作厌氧培养或其他特殊培养｡由于各种先进技术在微生物领域的应用,新病原菌不断发现,且都需要特殊培养才能生长,有的甚至不能体外培养｡因此,为了尽可能减少漏检,标本涂片革兰染色具有特别重要的价值｡

有利于临床早诊断､早治疗