细胞工程基本原理精选(九篇)

第1篇：细胞工程基本原理范文

关键词：生物科学；核心课程；逻辑关系

中图分类号：G633.91

文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2016）21-0130-03

1 引言

生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学、基因工程学是生物科学专业的核心课程，由于它们相互联系，交叉渗透，因此存在逻辑关系不清，课程内容重叠较多等问题，例如原核生物和真核生物基因表达调控在生物化学、细胞生物学、分子生物学都有介绍，基因工程原理在分子生物学、基因工程学中都有介绍，导致教师教学内容难以起舍，课程顺序难以安排。要理顺生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学、基因工程学的逻辑关系，确定各课程教学内容和教学顺序，必须把其定义，研究内容，发展历史动态结合起来。

2 生物科学专业核心课程概述

2.1 生物化学

生物化学是运用化学的理论和方法研究生物分子结构与功能、物质代谢及遗传信息传递与调控规律的科学。

生物化学是生命科学中最古老的学科之一。 随着生命科学的发展，各学科相互渗透。18世纪，一些从事化学研究的科学家转向生物领域，为生物化学的诞生播下了种子。19世纪末，生物化学从生理化学中独立。20世纪中后期又从生物化学分离出部分内容与遗传学部分内容结合为分子生物学，然后，分子生物学基因操作部分独立出来，形成基因工程学。

1920年以前，生物化学研究内容以分析生物体的化学组成、性质和含量为主，称为静态生物化学时期。

1920年-1950年，随着同位素示踪技术、色谱技术等物理学手段的广泛应用，生物化学从单纯的组成分析深入到物质代谢、能量转化，如：光合作用、生物氧化、糖、脂肪、蛋白质代谢等领域。这是生物化学飞速发展的时期，称为动态生物化学时期。

1950年以后，蛋白质化学和和核酸化学进展迅速，生物化学进入了分子生物学时期。分子生物学的发展揭示了生命本质的高度有序性和一致性，是人类在认识的巨大飞跃。根据生物化学的定义和历史，生物化学研究的内容包括以下几个方面。

2.1.1 生物的物质组成

生物是由一定的物质按特定的方式组成的，直到今天，新物质仍不断被发现。如陆续发现的干扰素、环核苷一磷酸、钙调蛋白、粘连蛋白、外源凝集素等都具有重要的生物学功能。另一方面，早已熟知的化合物也发现了新的功能，如20世纪50年代才知道肉碱是一种生长因子，而到60年代又发现其是生物氧化的载体。

2.1.2 物质代谢

生物体内绝大部分物质代谢是在酶催化下进行的，具有高度自动调节能力。一个小小的细胞内，有近2000种酶，在同一时间内，催化各种不同的化学反应。这些化学反应互不干扰，有条不紊地进行。表明生物体内的物质代谢有精确的调节控制系统。

2.1.3 结构与功能

生物大分子的功能与其特定的结构有密切关系。如酶的活性中心的结构决定其催化活性及其特异性；变构酶的活性还与其催化的代谢终末产物的结构有关。

核酸中核苷酸排列顺序的不同，其结构就不同，所含遗传信息不同。这些不同的构象对基因的表达具有调控作用。

生物体的糖包括多糖、寡糖和单糖。由于多糖链结构复杂，具有很大的信息容量，对于细胞专一地识别、相互作用具有重要作用。糖类将与蛋白质、核酸并列成为生物化学的主要研究对象。

在生物化学中，有关结构与功能关系的研究才仅仅开始，尚待大力研究的问题很多，其中重大的有：亚细胞结构中生物大分子间的结合，细胞的相互识别、细胞的接触抑制、细胞间的粘合、抗原与抗体的作用、激素、神经介质与其受体的相互作用等。

2.1.4 繁殖与遗传

生物典型特点是具有繁殖与遗传特性。基因是DNA分子中的一段核苷酸序列，现在DNA分子的核苷酸序列已不难测得，不但能在分子水平上研究遗传，而且还可能改变遗传，从而派生出基因工程学。

2.2 细胞生物学

细胞生物学是从显微水平、亚显微水平和分子水平研究细胞的结构及其生命活动规律的科学。

过去，细胞生物学主要是在光学显微镜下对细胞的形态结构和生活史进行研究，称为细胞学。20 世纪 50 年代以来，由于电子显微镜、放射性同位素、细胞结构组分分离技术、细胞培养等技术的广泛应用，特别是分子生物学的兴起，使细胞生物学研究的广度和深度都有迅猛发展，从宏观到微观、从平面到立体、从定性到定量、从分析到综合；从细胞、亚细胞、分子三个水平研究细胞的结构与功能、分裂与分化、衰老与死亡等生命活动规律及其调控机制，细胞与细胞、细胞与环境之间的相互关系。使原来以形态结构研究为主的细胞学转变成以生理功能研究为主、将结构与功能紧密结合起来的细胞生物学。由于细胞生物学在分子水平上的研究工作取得了深入的进展，因此细胞生物学又称为细胞分子生物学。细胞生物学研究内容如下。

2.2.1 细胞社会学

细胞社会学是细胞生物学中的一个新的领域。它是以系统论的观点研究细胞群体中细胞间的相互关系、细胞群体的社会行为；细胞识别、通讯、相互作用；整体和细胞群对细胞的生长、分化、形态发生和器官形成等活动的调控；细胞外环境对细胞的影响。

2.2.2 细胞的增殖、生长、分化与调控

研究细胞增殖、生长、分化及其调控机制，不仅是控制生物生长和发育的基础，而且是研究细胞癌变和逆转的重要途径。

2.2.3 细胞遗传学

细胞遗传学从细胞学角度来研究染色体的结构和行为以及染色体与细胞器的关系，从而探讨遗传与变异的机制等。

2.2.4 细胞化学

细胞化学：用切片或分离细胞成分，对单个细胞或细胞各个部分进行定性和定量的化学分析，研究细胞结构、化学成分的定位、分布及其生理功能。

2.2.5 分子细胞学

分子细胞学：从分子水平研究细胞与细胞器中蛋白质、核酸等大分子的组成、结构与功能及其遗传性状的表现和调控等，探讨细胞生命活动的分子机理。

2.3 遗传学

遗传学是研究生物遗传和变异规律的科学。孟德尔认为生物性状的遗传是受遗传因子控制的，并提出了遗传因子分离和自由组合的基本遗传规律。1900年，孟德尔的成果得到广泛重视，成为遗传学的基石。

20世纪初，利用光学显微镜发现了细胞有丝分裂和减数分裂过程中染色体及其行为，奠定了遗传的染色体理论基础。1910年左右，美国遗传学家摩尔根及其同事根据对普通果蝇的研究，提出了基因的连锁交换规律，并结合当时的细胞学成就，创立了以染色体遗传为核心的细胞遗传学。

遗传信息在分子水平上研究始于20世纪40年代。随着电子显微镜的发明，人们已能够直接观察遗传物质的结构及其在基因表达过程中的特征，使细胞遗传学的研究进入分子水平。

1953年，沃森和克里克提出了DNA的双螺旋结构模型，为进一步阐明DNA的结构、复制和遗传物质如何保持世代连续的问题奠定了基础，开创了分子遗传学这一新的学科领域。

遗传学研究的领域非常广泛，可划分成经典遗传学、细胞遗传学、分子遗传学和生统遗传学4个分支，各个分支领域相互联系、相互重叠、相互印证，组成了一个不可分割的整体。

经典遗传学研究从亲代到子代的遗传特性，包括遗传的分离规律；独立分配规律；连锁和交换遗传规律及机理；基因互作及其与环境的相互关系；性别决定与伴性遗传；基因及染色体变异；数量性状的特征及其多基因假说，近亲繁殖和杂种优势；细胞质遗传等。

细胞遗传学是通过细胞学手段对遗传物质进行研究。其内容包括细胞的结构和功能；染色体的形态结构；细胞的有丝分裂，减数分裂；配子的形成和受精。

分子遗传学是从分子的水平上研究遗传物质的结构及遗传信息的传递。内容包括DNA复制、转录和翻译，基因突变及修复，原核生物和真核基因表达与调控；基因、基因组及作图，遗传重组。

生统遗传学是用数理统计学方法来研究生物遗传变异规律的学科。根据研究的对象不同，又可分为数量遗传学和群体遗传学。前者研究生物体数量性状即由多基因控制的性状遗传规律，后者是研究基因频率在群体中的变化、群体的遗传结构和物种进化。

2.4 分子生物学

分子生物学是从分子水平研究核酸与蛋白质的结构与功能、遗传信息传递和调控，阐明生命本质的科学。

从19世纪后期到20世纪50年代初，确定了蛋白质是生命的主要物质基础，DNA是生物遗传的物质的载体，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。

从20世纪50年代初到70年代初，是现代分子生物学的建立和发展阶段，1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型为现代分子生物学诞生的里程碑，确立了核酸作为遗传信息分子的结构基础，提出了硷基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式，为核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。

70年代后，基因工程技术出现，人类进入认识生命本质并开始改造生命的发展阶段。

分子生物学原来是生物化学的一部分，因其太重要了，20世纪中后期从生物化学中分离出来并与遗传学结合，独立出来成为单独的学科，是生物化学的发展和延续。涉及的部分内容比生物化学更细致深入，并从整体上考虑。

分子生物学从蛋白质、核酸、基因及基因组结构开始，以中心法则为主线，阐述生物大分子在信息传导、基因表达调控中的相互作用和机理。主要内容包括蛋白质、核酸、基因和基因组的结构、DNA的复制、转录、转录后加工、基因突变与修复、蛋白质生物合成和翻译后加工、原核生物基因表达的调控、真核生物基因表达的调控。基因工程技术的原理和应用等。

2.5 基因工程学

20世纪70年代，随着 DNA的内部结构和遗传机制逐渐呈现在人们眼前，生物学家不再仅仅满足于探索、揭示生物遗传的秘密，而是开始设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。这就像工程设计，按照人类的需要（设计）把这种生物的某个“基因”与那种生物的某个“基因”进行“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物的工程技术被称为“基因工程”。

基因工程包括如下几个主要的内容：①目的基因的合成或提起分离。②载体的构建。③将载体转移到受体细胞并增殖。④重组DNA分子的受体细胞克隆筛选。⑤将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

3 课程间的逻辑关系，教学内容选择及课程顺序安排

从生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学、基因工程学的定义，研究内容，发展历史动态可知，各学科的逻辑关系是：理解细胞结构及功能需要一定的生物化学基础，理解遗传物质的结构和功能需要一定的细胞生物学基础，而分子生物学是生物化学、遗传学交叉融合的产物，研究核酸和蛋白质分子结构和功能以及相互关系，而各个分子不能孤立发挥作用，必须依赖于一定的细胞结构，因此，生物化学是细胞生物学的基础；细胞生物学是遗传学和分子生物学的基础。基因工程是利用分子生物学的理论和实验技术进行转基因操作的部分独立出来的，因此分子生物学是基因工程学的基础。所以，高校应按生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学、基因工程的顺序安排课程教学最为合适。

由以上可知，由于历史的原因，生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学、基因工程学相互联系，交叉渗透，研究内容重复较多。因此，本研究根据其定义、逻辑关系及发展历史，同时为编写教材和教学的方便，建议生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学、基因工程学教学内容如下。

（1）生物化学主要教学内容主要有：蛋白质化学、核酸化学；酶学基础；糖代谢与生物氧化；脂类代谢；蛋白质的分解代谢等内容。而将DNA复制、转录、翻译、突变、修复及原核生物和真核生物基因表达调控留在分子生物学讲授。

（2）细胞生物学的教学内容主要有：细胞的基本结构；细胞生物学研究方法；细胞膜的结构与功能及物质跨膜运输；细胞质基质与细胞内膜系统；细胞通讯与信号传递；线粒体和叶绿体；细胞核与染色体；细胞骨架；细胞增殖及其调控；细胞分化、衰老与凋亡。

（3）遗传学的教学内容主要有：遗传的分离规律；独立分配规律；连锁和交换遗传规律；基因互作及其与环境的关系；基因定位与连锁遗传图；性别决定与伴性遗传；基因及染色体变异；染色体畸变；数量性状的特征及其多基因假说；近亲繁殖和杂种优势；细胞质遗传；遗传重组。

（4）分子生物学的教学内容主要有：DNA的复制、转录、转录后加工、基因突变与修复、蛋白质生物合成和翻译后加工、原核生物基因表达的调控、真核生物基因表达的调控。

（5）基因工程学的主要教学内容有：基因工程技术的原理和应用等。

以上各门课的教学内容相对前述和我国现行教材的教学内容作了较大调整，例如；核酸和蛋白质的组成及结构只在生物化学中讲授，细胞信号传递只在细胞生物学中讲授，基因工程原理只在基因工程学中讲授，避免了课程内容的重复。

参考文献：

[1]沈振国.细胞生物学（第2版）[M].北京：中国农业出版社，2011.

[2]欧阳五庆.细胞生物学[M].北京：高等教育出版社，2010.

[3]翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学[M].北京：高等教育出版社，2007（8）.

[4]George M.Malacinski，David Freifelder.essentials of molecular biology（third edition）[M].北京：科学出版社，2003.

[5]Jeremy M.Berg，John L. Tymoczko，Lubert Stryer[J].Biochemistry，2002.

[6]徐晋麟.现代遗传学原理[M].北京：科学出版社，2000.

[7]王亚馥，戴灼华.遗传学[M].北京：高等教育出版社，1999.

[8]孙乃恩.分子遗传学[M].南京：南京大学出版社，1990.

[9]Robert H.Tamarin：Principles of Genetics[J].5th ed.，1996.

[10]朱玉贤，李 毅.现代分子生物学[M].北京：高等教育出版社，2002.

[11]杨业华.普通遗传学[M].北京：高等教育出版社，2000.

[12]Hartwell L，Hood L，Goldberg M L，et al.Genetics：From genes to Genomes（first edition）[J].McGraw-Hill Companies，Boston，2000.

[13]马建岗.基因工程学原理[M].西安：西安交通大学出版社，2001.

第2篇：细胞工程基本原理范文

关键词：细胞工程；教学改革；人才培养

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）46-0089-02

细胞工程是以细胞生物学和分子生物学为理论基础，应用于生产实践，在细胞水平和细胞器水平，根据人们的需要和设计来改变细胞内遗传物质并获得细胞产品的一门综合性应用性技术学科[1、2]。应用型地方本科院校在师资力量、实验仪器设施条件等方面相对较弱，为了适应应用型本科院校为社会培养应用型人才的需要，提高学生的学习积极性，为学生以后走上工作岗位或继续深造奠定坚实的基础，笔者在细胞工程课程教学改革方面进行了一些初步的探索，取得了一定的成效，现总结如下。

一、教学内容改革

细胞工程是生物工程专业的一门实践性和应用性很强的专业课，也是生物工程的一个重要方面，包括植物细胞工程和动物细胞工程两方面。我校是一所地方性本科院校，有生物科学与生物工程二个专业开设细胞工程专业选修课，根据我校“注重学理，亲近业界”的才培养理念和具体专业特点，教研组组织任课教师进行讨论，确定教学内容，制定教学大纲。

在教材选择上，我们选择科学出版社出版的杨淑慎主编的《细胞工程》为教材，同时参考整合其他现有教材内容，编写教学教案，并根据细胞工程发展快的特点，在教学教案中增加近期研究新进展。

在教学内容上，不同专业教学内容有所侧重[3]；生物科学专业尤其是农业生物技术专业在教学中以植物细胞工程内容为主，动物细胞工程内容以自学加讨论的形式来完成，在教学中着重讲解植物细胞工程的原理与基础，并结合实例讲解植物无性快繁技术、植物脱病毒技术、植物细胞培养与次生代谢产物的生产技术、植物胚培养技术等；生物工程专业尤其是生物制药专业以动物细胞工程内容为主，植物细胞工程内容以自学加讨论的形式来完成，在教学内容中重点讲解动物细胞体外培养技术及细胞培养中的注意事项、动物干细胞培养与诱导研究进展、动物单克隆抗体制备原理与技术、动物体外受精与胚胎移植技术、动物染色体工程等。

在教学过程中围绕细胞工程的理论基础一基本技术手段一主要应用领域一最新研究进展一发展前景的主线进行讲解，根据具体情况适当增加细胞工程的最新进展，将细胞工程领域的研究成果引入教师教案，丰富更新授课内容，如介绍近年来诺贝尔生理学或医学奖获奖成果等，这些内容可以激发学生的学习兴趣，增强其对细胞工程的认识和探索未知领域的决心。

二、教学方法改革

细胞工程是一门专业基础课，在传统的教师课堂讲授基础上，我们探索以专题形式进行课堂教学，开学公布教学方案及计划进度，提前一周布置任务，课堂上围绕专题进行以学生为主的教学讨论，教师根据课程内容及时进行补充与总结，实现学生对细胞工程基础知识的理解和掌握。如在讲述植物细胞工程时，植物脱病毒技术作为一个专题，提前一周让学生进行预习，课堂上用学生参与的形式边讲解边提问同学生一起总结植物脱病毒技术的原理、方法、应用及成就等；在讲述动物细胞工程时，单克隆抗体作为一个专题，以1975年Kohler和Milstein创立单克隆抗体生产技术，1984年获诺贝尔生理学或医学奖为引子，在课堂上让学生讲解并讨论单克隆抗体技术的理论基础、技术关键、应用及产业前景，充分激发学生的求知欲，鼓励学生积极参与到课堂教学过程中，让学生真正成为课堂的主体，变学生被动接受为主动学习。

细胞工程是近年来发展较快的一门技术性、实用性很强的专业基础课，是细胞生物学发展的实践应用，基础理论内容多，科学进展信息量大，应用性和实践性强，涉及多个实验体系和多种实验技能。根据细胞工程课程的课程特点与教学内容安排要求，为了使学生在有限的课时内充分理解领会教学内容，获得好的学习效果，在细胞工程课堂教学过程中，我们采用传统板书和多媒体教学相结合的手段，通过多媒体课件、视频和动画等现代化教学手段，展示细胞工程各种技术的原理和操作要点，把抽象的理论基础、技术关键用直观的图像演示出来，提高学生的学习兴趣，加深学生的理解，提高教学效果。

三、实验环节改革

细胞工程是一门实践性和应用性很强的课程[4]，由基本原理、基本技术、实践应用等三部分组成，根据我校实际情况，我们注重理论课教学的同时，不断完善实践教学体系，压缩原理和理论讲授学时，加大知识应用实践学时，在调整课堂理论课讲授的同时，增加了实验课和实习实训锻炼的课时，使课程结构更加适应细胞工程专业学习需求，符合我校建设服务地方的应用型本科院校的大方向。

通过多年的教学实践，在细胞工程实验教学中我们建立了包括课程实验和生产实习两个方面的实践教学体系。保留传统的基础性实验内容，如培养基配制、初代培养、继代培养、培养产物观察等内容，培养和训练学生细胞工程基础实验操作技能和细胞工程基本实验技术，并对实验内容进行整合和优化，在有限的实验课时和现有实验条件下，合理规划实验内容，使实验环节紧密衔接。结合课程内容，设计综合性实验，让学生组成团队自选实验材料、全程参与独立完成整个实验过程，从准备材料、配制试剂、高压灭菌、无菌操作到结果观察，统计分析，对学生的实验技能和实验技术进行全面的综合性训练，同时培养学生的团队协作精神和科学探究精神，也可以结合教师科研项目和大学生科技创新项目进行，提高学生的综合实验动手能力和基本的科研素质。另外组织学生观看细胞工程相关实训视频、与企业对接，参观相关企业、与企业领导和技术人员座谈交流、参加企业生产实习，真实感受细胞工程在生产中的应用，为毕业实践奠定基础。

四、考试改革

考核是教学过程中不可缺少的环节，通过考核对教学质量、教学效果的反馈进行检查，一方面，检查学生对知识的掌握程度，另一方面，教师可以在考核中发现教学中存在的问题，及时进行改进[5]。细胞工程课程考核分为三大部分，平时成绩占20%，实验成绩占30%，课程考试成绩占50%。平时成绩主要考核内容包括课堂表现（考勤，课堂提问）、专题讨论资料准备和课后作业等，是对学生平时表现的一种综合考核。实验成绩考核包括学生在实验课上的综合表现（实验报告、实验技能、实验态度等）、综合性实验和实习参观中的表现（实验实习报告、团队精神等）。期末考试在笔试试题设计上，提高主观试题的比例，降低客观试题的比例；表现为试题题型多样化，增加综合性试题和实验结果分析类题型，加强对学生分析问题解决问题能力的考核。引导学生平时加强学习，注重能力培养，防止以往教学过程中出现的期末突击复习应付考试现象，培养学生养成良好的学习态度，提高学生自主学习的能力。

细胞工程课程改革是我校生物工程专业课程体系改革的重要组成内容，其改革是一个长期的过程。我校是一所新建应用型地方本科院校，由于应用型教学师资技术基础弱、实验设施条件差，在培养应用型人才的教学目标和课程改革中对教师提出了更高的要求，在教学过程中不仅要不断学习和完善适合本校的细胞工程培养体系，更新自身的知识理论框架，而且在教学过程中要不断思考、探索和总结，与企业联姻合作，提高教学质量，为企业培养综合素质较高的具有创新能力的应用型人才。

参考文献：

[1]邵景侠，张小红，徐虹，等.《细胞工程》理论与实践教学的探索与研究[J].教育教学论坛，2015，（42）：117-118.

[2]姜振华，周大祥.地方本科院校细胞工程教学改革探索[J].教育教学论坛，2013，（27）：52-53.

[3]董丽丽.应用型本科教学背景下《细胞工程》教学改革探索[J].黄山学院学报，2014，16（3）：134-136.

第3篇：细胞工程基本原理范文

组织工程的治疗策略通常分为两类:①利用脱细胞基质(acellularmatrixgraft，ACMG)，为新组织生长提供正确定位、定向，依靠机体自身的再生能力促进组织再生。脱细胞基质通常是应用机械和化学的方法去除组织中细胞成分后的富含胶原的基质。②利用接种细胞的脱细胞基质构建新的组织器官。

组织工程尿道重建的基础研究应用ACMG修复尿道缺损的研究已有多年，包括尿道细胞外基质(urethralextracellularmatrix，UECM)、膀胱黏膜下层(bladderacellularmatrixgraft，BAMG)、小肠黏膜下层(smallintestinesubmucosa，SIS)等，它们经过脱细胞处理后，仅保留胶原蛋白、蛋白多糖等低抗原性物质。杨嗣星等［3］应用UECM进行兔的尿道缺损修复实验。术后3周，尿路上皮完全覆盖细胞外基质，术后6周，平滑肌细胞再生，炎性细胞消失，术后24周，再生尿道组织与正常尿道组织无区别。Chen等［4］应用猪BAMG修复兔尿道缺损，术后尿路造影显示尿道连续无狭窄，术后2个月BAMG表面覆盖完整的尿路上皮细胞，术后3个月炎性细胞消失，未见瘢痕形成，术后6个月黏膜下肌纤维束基本成形。Nuininga等［5］采用SIS以镶嵌补片方式修复兔的尿道缺损，术后尿道造影显示所有试验动物尿道口径正常无狭窄，术后1个月尿路上皮细胞完整覆盖SIS，炎症细胞浸润，术后3个月炎症细胞消失，平滑肌细胞再生。尽管采用单纯脱细胞基质以补片的方式进行尿道修复已取得较好的效果，但如果尿道损伤较大甚至闭锁，单纯的全管状材料修复，疗效不佳。修复段尿道出现萎缩，尿道黏膜下出现杂乱无序的肌束，尿道造影显示尿道狭窄形成［6］，其原因可能是由于尿道的缺损过长，宿主的滋养血管延伸到缺损中心区域较为困难，缺乏血供的上皮细胞爬行能力减弱，难以覆盖整个创面，并且支架降解较早，宿主的自体细胞尚未完全覆盖其上所致，而将种子细胞接种于管状胶原基质材料修复长段管状化尿道缺损则成为一种更好的选择。DeFilippo等［7］分别用未接种细胞和接种细胞的管状BAMG修复兔尿道缺损，发现单纯用管状基质修复的尿道，重建尿道狭窄并纤维化形成，而接种了自体细胞的管状胶原基质，重建尿道连续无狭窄发生。傅强等［8-9］用植入包皮表皮细胞的BAMG修复管状化尿道缺损，术后3个月修复段尿道已全部被黏膜覆盖，黏膜光滑，管腔无明显狭窄，组织学显示术后修复段尿道上皮呈表皮细胞形态并与宿主尿路上皮存在明显分界线，经长期随访观察发现:术后6～12个月，修复段尿道黏膜出现样结构，与尿路移行上皮细胞较为相似，这表明了在长期尿路环境中，来源包皮的表皮细胞可以向移行上皮形态转化。Gu等［10］应用硅胶管以腹膜腔作为生物反应器构建自身管状尿道修复材料，组织学证实成肌纤维细胞种植于胶原基质，其外有单层间皮细胞。将此修复材料对兔的尿道缺损进行尿道重建，术后尿道造影显示尿道连续无狭窄，此项研究为我们修复管状化尿道缺损提供了新的思路。

组织工程尿道重建的临床研究Atala等［11］采用BAMG修复传统手术治疗失败的尿道下裂，新建尿道长度为5～15cm，术后1年尿道造影显示尿道连续无狭窄，组织学证实重建尿道表现为典型的尿路上皮，术后随访22个月，除1例新建尿道出现头下瘘管外，其余患者均治愈。EL-Kassaby等［12］用BAMG对28例尿道狭窄患者进行尿道修复，新尿道长1．5～16cm，术前和术后常规行排尿记录、体检、逆行尿路造影、尿流率和膀胱镜检查，术后随访36～48个月，仅有4例患者在吻合部位出现轻度狭窄，其余患者治愈，活检组织学检查显示典型的尿路上皮。Palminteri等［13］应用SIS为20例尿道狭窄患者行尿道重建，17例患者尿道狭窄治愈，术后3个月膀胱镜检显示重建尿道口径正常无狭窄，但支架部位未被尿路上皮完全替代，原因可能是尿路上皮再生完全至少需要20周才能完成。Fiala等［14］用同样材料修复50例尿道狭窄患者，成功率80%，随访期间大部分患者均未出现早期或晚期相关并发症，进一步证实SIS在组织工程尿道重建中的应用前景。Farahat等［15］近来采用内窥镜技术对10例复发性尿道狭窄患者行SIS补片修复，术后8例患者尿道狭窄治愈，仅2例患者表现为轻度的尿道狭窄复发，通过定期行尿道扩张术已获得满意的治疗效果。

目前，口腔黏膜替代已被认为是临床治疗尿道狭窄或下裂一类疾病的金标准［13］，但自体取材可导致张口受限、供体部位麻木感等诸多并发症［16-17］。因而构建组织工程化口腔黏膜是进行尿道重建的一项新选择。Bhargava等［18］将角化细胞、成纤维细胞分别从获取的口腔黏膜表皮层、真皮层分离下来，进行体外培养扩增，达到足够数量后将两种细胞种植在去表皮层的真皮上，构建组织工程化口腔粘膜。将其植入5例患者体内修复尿道狭窄，3名患者目前尿道狭窄治愈，1例因术后体部纤维化合并痛性需做全段补片切除，另1例因补片的过度增生及纤维化需做部分补片切除，该研究为组织工程化口腔粘膜的临床应用展现了新的前景。Selim等［19］将角化细胞与成纤维细胞种植在聚乳酸(polylacticacid，PLA)与聚羟基乙酸(polyg-lycolicacid，PGA)的共聚物PLGA(polylactic-co-glycolicacid)上，构建组织工程化口腔黏膜，其机械强度和弹性约为正常口腔黏膜的30%，为PLGA在尿道组织工程中的应用开创了新的前景。2干细胞的研究概况干细胞(stemcells，SC)是一类未分化的细胞，具有自我更新的能力并能进行分化以最终形成成熟的非再生细胞和效应细胞［20-21］。根据分化的不同阶段，主要分为:全能干细胞(受精卵)、多潜能干细胞(胚胎干细胞)、多能干细胞(成体干细胞)、单能干细胞(祖细胞)［22］。目前研究最多的是胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)和成体干细胞(A-dultstemcells)。

干细胞在尿道重建中的基础研究理论上ESCs依靠其多分化能力可作为理想的种子细胞，但获取胚胎干细胞往往造成胚胎的破坏，并且将其植入免疫缺陷动物时，有形成畸胎瘤的风险［23］。Otta-masathien等［24］研究表明在裸鼠的肾被膜下，胚胎干细胞在胚胎膀胱间充质(embryonicbladdermesen-chyme，EBLM)诱导下产生膀胱上皮细胞和平滑肌细胞，并无畸胎瘤的生成。Mauney等［25］应用全反式维甲酸在体外成功将胚胎干细胞诱导成尿路上皮细胞，为胚胎干细胞作为组织工程种子细胞的来源提供了可能性。Frimberger等［26］用种植人胚胎干细胞的猪小肠黏膜下层修复大鼠膀胱缺损，术后28天，膀胱上皮层、粘膜下层和平滑肌层完全再生。成体干细胞来自骨髓、肌组织、血管内皮、皮肤及脂肪等处，可避免获取胚胎干细胞时的伦理问题，同时成体干细胞不会转化为恶性表型，降低了植入体内后形成畸胎瘤的风险，所以研究者们的目光现已逐渐转移到对成体干细胞的研究。Shukla等［27］研究显示骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesen-chymalstemcells)在体外可以成功诱导为平滑肌细胞，但将骨髓间充质干细胞与SIS复合进行猪膀胱扩增替代术时，术后免疫染色和组织化学证实骨髓间充质干细胞在体内并未完全分化为平滑肌细胞，近来已有研究报道骨髓间充质干细胞用于膀胱扩增替代术时可在体内成功分化为平滑肌细胞［28］。因为膀胱构建与尿道重建在生物支架及种子细胞选材上的相似性，因此可借鉴前者指导干细胞在尿道重建上应用。黄红军等［29］用种植骨髓间充质干细胞的脱细胞尿道海绵体-尿道基质(Acellularspongybodyofurethra-urethralmatrix)修复兔海绵体尿道缺损，术后仅1例发生尿瘘，其余排尿通畅。组织学检查:术后2周见少量毛细血管及平滑肌细胞生长，再造尿道腔面完整覆盖单层尿道上皮，术后24周，平滑肌细胞增多，排列规则，尿道黏膜层由七八层上皮细胞构成，尿道腔面光滑、完整。但是，由于骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低，需体外扩增较长时间才能达到构建的细胞数量;同时由于存在着骨髓抽取过程患者较痛苦等问题，使骨髓来源的干细胞在应用中存在较大的局限性。相对而言，脂肪组织来源丰富，只需要简单的吸脂手术即可获得足够数量的脂肪组织，且脂肪组织中脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)含量丰富，仅需要少量的脂肪组织即可获得足够的ADSCs。ADSCs已经证明与骨髓间充质干细胞有相似的多潜能和自我更新能力［30］，可以诱导分化为具有正常收缩舒张功能的平滑肌细胞［31-32］。Brzoska等［33］实验表明脂肪干细胞经体外全反式维甲酸诱导培养可分选出大于80%的上皮细胞，Liu等［34］研究进一步表明，将人ADSCs与尿路上皮细胞混合培养，可以诱导ADSCs向尿路上皮细胞转化。

以上结果表明脂肪干细胞可诱导分化出上皮和平滑肌细胞从而可能作为种子细胞应用于尿道组织工程的修复重建。张亚等［35］应用ADSCs复合多孔丝素膜(poroussilkfibroinscaf-fold，PSFS)修复兔的尿道缺损，术后2周丝素膜结构完整，表面无尿路上皮细胞形成，膜基底部有血管、胶原组织生长，少量淋巴细胞浸润。术后4周丝素膜表面形成3～4层排列欠规则的尿路上皮细胞，黏膜下见大量血管、平滑肌细胞沿丝素膜孔隙生长。术后6周丝素膜表面见排列规则的6～7层尿路上皮细胞，丝素膜被分解成小块状。与单纯应用多孔丝素膜修复尿道缺损相比，ADSCs复合PSFS能加快血管生长、促进尿路上皮及平滑肌细胞生长和加速丝素膜的分解。该研究进一步证实了以干细胞作为种子细胞构建组织工程化尿道是可行的。Wu等［36］应用尿液样本中获取的尿源性干细胞(urine-derivedstemcells，USC)经体外诱导培养传代3次，50%～70%尿源性干细胞分化为平滑肌细胞，超过90%尿源性干细胞分化为尿路上皮细胞。每200ml尿液样本获取的尿源性干细胞在培养传代4次时即可产生至少3．2×108个活性细胞，足以用来构建工程化的尿道组织。

第4篇：细胞工程基本原理范文

【关键词】 软骨组织工程种子细胞源

多种原因造成的关节软骨病变比较常见，软骨损伤后缺乏自愈能力，软骨缺损的修复一直是临床的难题。随着细胞生物学和材料科学的迅速发展，应用组织工程学技术修复软骨病损已成为可能，而优化种子细胞源是应用这一技术的前提和关键［1］。本文就有关软骨组织工程种子细胞源的优化获取、存在的问题及其解决等研究进展作一综述。

1 软骨组织工程对种子细胞源的要求

组织工程软骨的种子细胞应符合下列要求：来源丰富，取材方便；有较强的增殖传代能力；与载体材料接种后能保持增殖能力和较高的黏附率，植入受区后能保持修复组织的表型；对机体或供区损伤小，临床应用的生物安全性和无明显的免疫排斥和其他潜在危险［2］。

2 软骨组织工程的种子细胞源

2.1 自体软骨细胞

理论上讲自体软骨细胞是软骨组织工程最理想的种子细胞源，不仅功能相同，不存在免疫排斥反应，而且不需要诱导分化培养。但研究表明种子细胞浓度为(5～6)×107/ml时，形成的新生软骨形态最佳，但是自体软骨组织取材受限，软骨细胞增殖能力低，难以达到应有的细胞数量，体外培养扩增容易发生去分化而失去原有的表型［3］，因此直接源于自体软骨组织的种子细胞，体外单层培养难以获取大量的细胞以满足组织工程对种子细胞的需求。

为解决上述难题，使用生物反应器三维培养可使软骨细胞快速扩增，建立能够长期培养、表型稳定的永生化软骨细胞。生物反应器能控制pH、机械能力、营养供给条件等，为细胞的生长、分化提供最适宜的环境。根据自体软骨细胞培养所需的条件，仿生性地设计接近体内环境的软骨生物反应器，模拟了体内的细胞外基质微环境。相同容积的生物反应器比普通培养方式，多出数10倍甚至上100倍的细胞。可减少细胞去分化现象，有利于细胞表型的维持，提高种子细胞的质量。有利于软骨细胞的培养、扩增及表型维持。

2.2 同种异体软骨细胞

与体内其他组织相比，软骨有其独特的结构和免疫学特点。软骨无血管、淋巴管和神经，细胞包埋在由软骨基质形成的软骨囊内，可阻挡免疫细胞直接与其接触，不易被机体免疫系统攻击，软骨基质抗原性低，一般不引起或仅有轻微的免疫反应，获取种子细胞时要经过消化分离和体外培养等一系列处理，软骨细胞表面抗原可被进一步消弱。同种异体软骨来源广，易获取，一次可获取大量软骨细胞，所以同种异体软骨是值得研究的种子细胞来源［5］。应用同种异体软骨细胞作种子细胞，在具有免疫力动物体内形成同种异体工程化软骨，并用于软骨缺损修复的实验报道，未发现明显的免疫排斥反应［6］。研究表明胚胎来源的软骨细胞较成体软骨细胞引起的异体排斥反应微弱，提示在同种异体软骨组织工程中，胚胎来源的软骨细胞作为种子细胞是最佳选择［7］。对同种异体软骨细胞生物学特性和相关免疫反应问题的进一步研究，将为建立软骨组织工程种子细胞库奠定基础。

2.3 骨髓间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs)

骨髓中存在具有向多种细胞系分化潜能的BMSCs。Friedenstein发现骨髓中存在少量可以贴壁繁殖的BMSCs，条件培养液诱导可分化成为软骨细胞。Cancedda等［8］对BMSCs和骨膜细胞修复兔股骨髁软骨全层缺损进行了比较，发现两者均能形成软骨和软骨下骨。

ButnariuEphrat等［9］用BMSCs复合聚合物支架，自体和异体移植修复股骨负重区软骨缺损，结果自体BMSCs早期形成类透明软骨，异体BMSCs的免疫反应导致后期纤维化和骨关节炎改变。Gao等［10］分别用成骨和成软骨条件培养液诱导培养大鼠BMSCs，复合不同材料的双层支架植入裸鼠背部皮下，术后1周检测新生组织中含有Ⅰ、Ⅱ型胶原，认为BMSCs在不同生物活性因子的作用下，结合相应的生物材料可以构建出工程化的骨软骨复合体，因此，目前认为BMSCs是一种比较理想的种子细胞源。尽管BMSCs只有较强的增殖能力和多向分化潜能性，但其数量在全骨髓中仅占1／105～1/104，并且随传代次数的增加，其软骨分化潜能逐渐降低，必须通过适当的控制条件和诱导因素，使BMSCs保持增殖并分化为软骨细胞，也有研究表明重症骨关节炎病人BMSCs的成软骨能力明显降低［11］，并且最近研究证实当BMSCs培养传代90次后细胞发生癌变，声称这符合肿瘤细胞源于干细胞的假说，因此对BMSCs应用的生物安全性必须引起高度重视和深入研究［12］。

2.4 BMSCs与软骨细胞共培养

基于BMSCs和软骨细胞均不能完全满足组织工程对种子细胞的要求，那么将2种细胞优势互补，进行共培养来优化和扩大软骨组织工程的种子细胞源就成为可供选择的方式。Tsuchiya等［13］用不同比例的人BMSCs和牛软骨细胞共培养发现，BMSCs数量比例愈高软骨细胞表达的Ⅱ型胶原和糖胺多糖愈高，并且能保持共培养前的细胞比例，因此BMSCs能促进软骨细胞的增殖和基质形成，其原因是共培养系统中BMSCs分泌的活性生长因子(TGF)，通过软骨细胞介导自分泌或旁分泌上调了软骨细胞基质的合成。Goldberg等［14］用添加TGF β的培养基培养去分化的软骨细胞，结果表明添加TGFβ能使去分化的软骨细胞重新分化，从而维持了软骨细胞的表型。在构建工程化软骨组织中，利用BMSCs增殖能力强的特点，少量软骨细胞的微环境能诱导BMSCs分化为软骨细胞，比单纯软骨细胞构建的软骨组织更为成熟，也避免了软骨细胞长期培养传代而导致的老化和去分化，并且节省了软骨细胞的用量。因此BMSCs和软骨细胞共培养对优化和扩大种子细胞源可能是一种实用的策略。

2.5 软骨膜细胞或骨膜细胞

骨膜和软骨膜生发层含未分化的间充质细胞，在低氧张力、无血供的关节腔内分化为软骨细胞、关节滑液和使用CPM是促使间充质细胞向软骨细胞分化的有利因素。Wakitani等［15］培养兔胫骨膜细胞，修复兔股骨髁全层软骨缺损，24周时软骨下骨完全形成，新生软骨组织无骨化现象。Chu等［16］用异体肋软骨膜细胞和PLA支架修复兔股骨髁软骨缺损，96％的缺损6周时为软骨填充，Ⅱ型胶原比例随时间延长而升高，说明关节内环境刺激新生组织向透明软骨方向发展，黏多糖含量12个月时降低，软骨下骨厚度为正常的50％，认为异体移植的免疫反应和PLA降解产物的酸性环境影响了软骨下骨结构的形成，导致新生软骨生物力学性能下降和纤维化。

2.6 肌肉源性基质干细胞(musclederived stromal cells)

Pate等［17］使用冻融方法和地塞米松诱导培养兔肌源性基质干细胞，形成了软骨结节和含有硫酸黏多糖的细胞外基质。青年和老年人的肌细胞经诱导培养出现同样的结果［18］。Adachi等［19］用关节软骨细胞或肌源性干细胞复合II型胶原凝胶修复兔股骨髁软骨缺损区，24周后可见缺损区呈软骨样修复，优于不含细胞的I型胶原凝胶对照组，认为肌源性干细胞取材方便，细胞倍增时间短，可以作为修复软骨损伤的种子细胞源和基因治疗的靶细胞。

2.7 脂肪源性基质干细胞(adipose tissuederived stromal cells，ADSC)

为提供更多间充质细胞的自体组织，Erickson等［20］用Ⅰ型胶原酶消化人吸脂术中的皮下脂肪，经梯度密度离心获取基质干细胞，使用普通和软骨诱导培养液(含TGFβ1和地塞米松)三维培养2周后植入裸鼠背部皮下4～12周取材，免疫组织化学和RTPCR检测表明：软骨诱导培养液体外培养1周和植入裸鼠体内的标本均有明确的成软骨特征，而使用普通培养液的对照组则阴性，类似结果亦见于大鼠脂肪来源的干细胞［21］。源于脂肪组织的基质干细胞，因脂肪组织在体内广泛存在，取材方便，对人体造成的创伤相对较小，是目前获取种子细胞的新途径，也是研究的热点，其细胞表型与BMSCs非常相似，均表达CD29、CD44、CD90、CD105，且缺少HLADR及Ckit表型，同时其增殖能力优于BMSCs［22］。然而Hui等［23］在修复软骨缺损的研究发现，在相同的实验条件下其修复效果不如BMSCs。由于该细胞为诱导性干细胞，体外培养时必须在持续诱导条件下才能分化为软骨细胞，培养难度相对较大并且其成软骨机制尚不完全清楚。如能掌握脂肪组织基质干细胞的成软骨机制和性能，在体外培养持续向软骨细胞分化，则不失为一种优秀的种子细胞源［24］。

2.8 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)

胚胎干细胞来自早期胚胎的内细胞团或尿生殖嵴，胚胎干细胞是全能干细胞，可分化为3个胚层的细胞，种植于体内可形成包含三胚层细胞的畸胎瘤。改变体外培养条件，可使胚胎干细胞向不同的细胞系分化，文献报道胚胎干细胞在BMP2和BMP4的作用下可分化为软骨细胞［25］，胚胎干细胞与已分化的成熟软骨细胞相比，除具有更强的增殖能力外，还具有再生潜能，可维持整个生命过程中细胞的更新和正常的功能，因而胚胎干细胞作为种子细胞可能更为优势。但使用胚胎干细胞作为组织工程的种子细胞，体外培养要求严格，自发分化难以控制，分化多具致瘤性，安全性难于把握，临床使用尚存在伦理学问题。

3 基因修饰的种子细胞

多种细胞因子有促进软骨修复的作用。通过基因重组技术，将细胞因子基因导入软骨细胞或相关细胞，使之在病损部位分泌生长因子并维持所需的浓度和时间，有效促进软骨的修复，这就是基因修饰的组织工程技术(gene modified technology)。如TGF、IGF、EGF、GF等均可刺激软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原与蛋白多糖的合成。绿色荧光蛋白基因转染软骨细胞可标记软骨细胞的示踪。研究表明，在骨形态发生蛋白-2和BMP-4的调控下，可在体外诱导ES细胞向软骨细胞分化，同时保留其分泌Ⅱ型胶原等的特性。Sellers等［26］用含rhBMP2的I型胶原海绵修复兔膝关节软骨缺损，24周时新生软骨厚度达到正常软骨的70％和潮线形成，rhBMP2组与单纯胶原海绵和旷置组间的差异只有统计学意义，但是外源性生长因子半衰期短，需较大剂量或连续给药才能发挥作用，增加了治疗成本。Baragi等［27］以腺病毒携带lacZ作为报告基因，人白介素-1受体拮抗物(hIL-1ra)cDNA作为治疗基因，用骨关节炎软骨标本体外培养软骨细胞和小软骨薄片，结果表明转染hIL-1ra基因可抑制IL-1引起的软骨基质变性，认为基因修饰后的软骨细胞表现出更强的生物学功能，在一定程度上弥补了自体软骨细胞供量不足的缺陷，缩短体外培养时间，更好地维持其表型。

多项研究表明以腺病毒、逆转录病毒或脂质体等作为载体，转染软骨细胞、骨膜细胞或直接注入病变部位是可行的，基因工程技术应用于组织工程领域可以使转染的细胞持续、稳定表达促进软骨修复的生长因子，但病毒类载体潜在的致畸性、免疫源性以及脂质体对种子细胞的毒性和转染率低等尚需进一步改进。

4 展望

种子细胞是构建组织工程化软骨和应用研究中的首要环节和基本要求，也是保证软骨组织工程学持续性深入研究的前提。影响优化软骨种子细胞源的因素众多，目前研究的种子细胞各具优缺点，尚没有一种细胞能够完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求，今后需要开发和挖掘更多的种子细胞源，并在模拟体内的微环境中进行培养，建立种子细胞的评价系统，优化出理想的种子细胞，为软骨组织工程的研究和临床应用提供可靠保证。BMSCs相关研究和技术比较成熟，今后的研究重点是如何保证细胞能在特定的时间内定向扩增到临床治疗所需的数量，并避免致瘤性的产生。BMSCs和软骨细胞共培养可能为解决上述问题提供了一种实用的策略，但两种细胞间的相互作用机制尚需进行深入研究。目前脂肪基质细胞和胚胎干细胞的临床应用研究相对滞后，但随着科学技术的不断发展，对其成软骨机制和性能也会不断了解，优势会逐渐显现。当然，种子细胞的优化只是软骨组织工程学研究的第一步，今后还要解决细胞所需载体及细胞与载体相容性及相互作用等问题，当最终运用到临床尚需考虑免疫排斥性问题。 参考文献

［1］ Landis WJ，Jacquet R，Hillyer J， et al.The potential of tissue engineering in tissue engineering in orthopedics［J］.Othop Clin N(Am)，2005，36(1)：97-104.

［2］ Vats A，Tolley NS，Polak JM.The stem tell in orthopaedics surgery［J］.J Bone Joint Surg(Br)，2001，86(2)：159-163.

［3］ Marlovits S，Hombauer M，Truppe M，et al.Changes in the ratio of typeI and typeII collagen expression during monolayer culture of human chondrocytes［J］.J Bone Joint Surg(Br)，2004，86(5)：286-295.

［4］ Steimberg N，Viengchareun S，BiChlmann F，et al.Dedifferentiated adult articular　chondrocytes：a population of human multipotent primitive cells［J］.Exp Cell　Res，2001，249(2)：248-259.

［5］ Alford JW，Cole BJ.Principles of cell mechanics for cartilage tissue engineering［J］.J Sports Med(Am)，2005，33(3)：295-306.

［6］ Akmal M，Singh A，Anand A，et al.Cell origin and differentiation in the repair of fullthickness defects of articular cartilage［J］.J Bone Joint Surg（Br)，2005，87(6)：1143-1149.

［7］ Hegert C， Kramer J， Hargus G， et al. Differentiation plasticity of chondrocytes derived from mouse embryonic stemcells［J］.J Cell Sci， 2002， 115(23):4617-4628.

［8］ Cancedda R， Dozin B， Giannoni P， et al. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone［J］. Matrix Biol， 2003， 22(1):81-91.

［9］ ButnariuEphrat M， Robinson D， Mendes DO， et al.Tissue engineering:current challenges and expanding opportunities［J］.Clin Orthop， 2001， 630(2):234-243.

［10］Gao J， Dennis JE， Solchaga LA， et al. Repair of osteochondral defect with tissue engineered twophase composite material of injectable calcium phosphate and hyaluronan sponge［J］.Tissue Eng， 2002，8(5):827-837.

［11］Murphy JM， Dixon K， Beck S， et al. Reduced chondrogenic and adipogenic activity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis［J］. Arthritis Rheum， 2002， 46(4):704-713.

［12］Rubio D， GarciaCastro J， Martin MC， et al. Spontaneous transdifferentiation of mesenchymal stem cells［J］.Cancer Res， 2005， 65(8): 3035-3039.

［13］Tsuchiya K， Chen G， Ushida T， et al. The effect of cocultureof chondrocyteswith mesenchymal stem cells on their cartilaginous phenotype in vitro［J］.Materials Sci Eng， 2004， 24(2):391-396.

［14］Goldberg AJ， Lee DA， Bader DL， et al. Autologous chondrocyte implantation: culture in a TGFβcontaining medium enhances the reexpression of a chondrocytic phenotypein passaaed human giondrocytes in pellet culture［J］.J Bone Joint Surg(Br)， 2005，87(1):128-134.

［15］Wakitani S， Goto T， Prneda SJ， et al. Multipotent mesenchymal stem cells from　adult rabbits synovial membrane［J］.J Bone Joint Surg(Am)，2004，76(3):579-592.

［16］Chu CR， Dounchis JS， Yoshioka M， et al. Rib perichondrial autografts in　fullthickness articular cartilage defects in rabbits［J］.Clin Orthop， 2001(2):220-229.

［17］Pate DW， Southerland SS， Grande DA，et al. Cartilage tissue differentiation from　mesenchymal cells derived form mature muscle in tissue culture［J］.Surg Forum， 2003，44(3):587-589.

［18］Williams JT， Southerland SS， Souza J， et al. Generation of different fates from multipotent muscle stem cells［J］.Sura(Am)，2003，65(1):22-26.

［18］Adachi N， Sato K， Usas A， et al. Muscle derived， cell based ex vivo gene therapy for treatment of full thickness articular cartilage defects［J］.J Heumatol， 2002，29(9):1920-1930.

［20］Erickson GR， Gimble JM， Franldin DM， et al. Chondrogenic potential of adipose　tissuederived stromal cells in vitro and in vivo［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2002，290(2):763-769.

［21］Huana JI， Beanes SR， Zhou M， et al. Genetic analysis of adipogenesis through　peroxisomc proliferatoractivated receptor isoforms［J].Plast Reconstr Surg，2002，109(6):1033-1041.

［22］Lee RH， Kim B， Choi I， et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］.Cell Physiol Biochem，2004，14(4-6):311-324.

［23］Hui JH， Li L， Teo Ytt， et al. Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cellbased therapies［J］. Tissue Eng，2005，11(5-6):904-912.

［24］Zuk PA， Zhu M， Mfzuno H， et al. Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cellbased therapies［J］.Tissu Eng，2001，7(1):211-228.

［25］Kramer J， Hegert C，Guan K. Embryonic stem cellderived chondrocytes differentiation in vitro:activation by BMP2 and BMP4［J］.Mech Dev，2000，92(1):193-205.

第5篇：细胞工程基本原理范文

例1 下列能说明某细胞已经发生分化的是（ ）

A.进行ATP的合成

B.进行mRNA的合成

C.存在血红蛋白

D.存在纤维蛋白原基因

解析 ATP的合成发生在所有活细胞中，A不能说明；在没有分化的细胞中也进行mRNA的合成，B不能说明；存在血红蛋白的细胞一定是红细胞，是已经分化的细胞，C能说明；所有的正常细胞中都存在纤维蛋白原基因，D不能说明。

答案 C

点评 细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。因此，所有细胞共有的生理活动、物质及现象都不能说明细胞已经发生了分化。

例2 由细胞形态判断，下列细胞中最可能连续分裂的是（ ）

A B C D

解析 本题考查对不同细胞形态特征的识别与分化程度的判断。A为，C为肌细胞，D为神经细胞，皆为高度分化的细胞，不具备分裂能力。

答案 B

点评 细胞分化是一种永久性变化，它发生在生物的整个生命进程中，但在发育的不同阶段，细胞分化程度不同，在胚胎时期分化达最大限度。分化程度与分化限度是不同的概念，如胚胎时期分化限度（即分化前途）达最大，分化程度却不高。我们可以参照自己来进行理解，我们将来可能从事不同的工作，但我们都是学生，因此分化限度最大，但分化程度最低。

例3 某实验室做了下图所示的实验研究，下列相关叙述，正确的是（ ）

[甲小鼠的纤维母细胞][诱导干细胞][肝细胞、神经细胞、上皮细胞等][Z细胞][单抗][X细胞][Y细胞][将H1N1病毒外壳蛋白注入乙小鼠][诱导基因][①][②][③][④]

A.与纤维母细胞相比，过程①形成的诱导干细胞的全能性较低

B.过程②是诱导干细胞的结构和遗传物质发生稳定性差异的过程

C.每个Y细胞只产生一种抗体，故过程③不需要选择性培养基进行筛选

D.过程④产生的单抗，不需细胞膜上载体蛋白的协助就能释放到细胞外

解析 因过程①形成的诱导干细胞能分化成肝细胞、神经细胞等，故其全能性高，A错。过程②是细胞的分化过程，分化时遗传物质不会发生变化，B错。过程③要用选择培养基才能选出杂交瘤细胞，C错。过程④产生的单抗是一种分泌蛋白，通过胞吐过程分泌，不需载体蛋白协助，D正确。

答案 D

点评 在生物体内，细胞分化是一种稳定的程序性变化，这种变化是不可逆转的，因此细胞分化的不可逆性是指在自然条件下的特性。但在人工实验条件下，分化的组织细胞能脱分化，脱分化的组织细胞由于含有发育成完整生物体的全部遗传物质，因而经一定人工培养后可发育成一个完整生物体。

细胞全能性和细胞核全能性是两个不同的概念。植物体细胞具有全能性，可以通过植物组织培养进行验证；低等动物的细胞和高等动物早期胚胎细胞具有全能性，可以通过胚胎分割和胚胎工程进行验证；高等动物的体细胞核具有发育全能性，可以通过动物克隆进行验证。

1.高等动物体细胞不能完全表达其全能性。这是因为细胞内基因在特定时期和空间条件下选择性表达，从而使细胞分化为不同的组织、器官。

2.植物体细胞在离体的情况下，在一定的营养物质、激素和其他适宜外界条件下，细胞方能表现其全能性。

3.植物细胞的全能性容易表现，动物细胞核的全能性也较易表现，但整个动物细胞的全能性，目前仍难以得到验证。

由上述内容可知，我们在学习过程中要善于总结，并构建细胞分化的基本知识框架，加强加深对该专题的理解。

1.胚胎干细胞是哺乳动物或人早期胚胎中的细胞，可以进一步分裂、分化成各种组织干细胞，再进一步分化成各种不同的组织。下列叙述不正确的是（ ）

A.各种组织干细胞分化形成不同组织细胞是基因选择性表达的结果

B.胚胎干细胞有细胞周期，神经干细胞分化形成的神经细胞没有细胞周期

C.造血干细胞分化形成红细胞、白细胞的过程是不可逆的

D.肝脏干细胞分化成肝脏细胞的过程体现了细胞的全能性

2.关于细胞分化的说法正确的是（ ）

①在人体内分化是稳定的，而且一般是不可逆的，一旦细胞沿一定方向分化，便不会再脱分化到原先的状态 ②细胞分化后，细胞中mRNA不同，tRNA相同 ③分化的结果是赋予不同种类的细胞特异的结构和功能 ④一般不会出现细胞核遗传物质的改变 ⑤细胞分化的实质是基因选择性表达

A.②③④⑤ B.①②④⑤

C.①②③⑤ D.①②③④⑤

3.2009年6月，成都9路公交车纵火案中烧伤病人皮肤的修复成为一大医疗难题。皮肤干细胞的研制有利于解决皮肤移植，请完成下列问题：

（1）患者本人皮肤干细胞能 成为其皮肤细胞，既易采集，又避免了移植后的 。

（2）皮肤干细胞还可以诱导成各种体细胞，其根本原因是 。但皮肤干细胞在体内无法形成其他细胞，原因是 。

4.观赏植物蝴蝶兰可通过改变CO2吸收方式以适应环境变化，长期干旱条件下，蝴蝶兰在夜间吸收CO2并贮存在细胞中。

[正常和长期干旱条件下蝴蝶兰CO2吸收速率的日变化][时间][干旱][正常] [8

6

4

2

0][2∶00 4∶00 6∶00 8∶00 10∶00 12∶00 14∶00 16∶00 18∶00 20∶00 22∶00 24∶00 ][CO2吸收速率（μmol/m2・s）]

（1）依上图分析，长期干旱条件下的蝴蝶兰在0～4时 （填“有”或“无”）ATP和[H]的合成，原因是 ；此时段 （填“有”或“无”）光合作用的暗反应发生，原因是 ；10～16时无明显CO2吸收的直接原因是 。

[正常和长期干旱条件下蝴蝶兰的干重增加量][干旱][正常][20

15

10

5

0] [干重增加量（mg/株・天）]

（2）从上图可知，栽培蝴蝶兰应避免 ，以利于其较快生长。此外，由于蝴蝶兰属阴生植物，栽培时还需适当 。

（3）蝴蝶兰的种苗可利用植物细胞的 ，通过植物组织培养技术大规模生产，此过程中细胞分化的根本原因是 。

1.D 2.D

第6篇：细胞工程基本原理范文

[关键词]甲状腺素；软骨组织工程；软骨细胞；细胞外基质；细胞聚集体

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码] [文章编号]1008-6455（2012）08-1324-04

软骨组织工程为软骨缺损修复提供了一种新的治疗方法[1]。软骨细胞是软骨组织工程种子细胞的一个重要来源，目前应用软骨细胞为种子细胞在体内外已经能够成功构建出精确形状的成熟软骨组织[2-3]。但是体外构建的组织工程软骨的生化和力学质量与生理软骨仍具有一定的差距[4]。在目前软骨细胞常规培养方案（主要为DMEM添加10%胎牛血清）基础上寻找新的优化成分是软骨组织工程的课题之一。

1 材料和方法

1.3 软骨细胞pellets培养：第二代软骨细胞（P2）聚集体（pellets）根据培养基的不同分为2组，常规组培养基：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素。100nM甲状腺素组：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素，100nM甲状腺素。体外外培养1周，2周，3周分别取材进行大体、组织学及相关基因表达的检测。

1.4 组织学检测：取材后将标本放入4%多聚甲醛中固定24h，经脱水、石蜡包埋、切成5μm厚切片进行甲苯胺蓝染色观察细胞外基质中糖胺多糖（Glycosaminoglycan，GAG）分泌情况。应用鼠抗II型胶原单克隆抗体（Sigma）检测II型胶原表达情况。

1.6 统计学分析：计量指标均以均数±标准差的形式表示，所测数据采用t检验（Student's t-test）进行统计分析，P

2 结果

2.4 Col II和Col X免疫组化染色结果：两组pellets在第3天以及第1，2，3周的纵切面Col II和Col X染色见图4。第1周两组开始明显表达Col II，在培养3周时常规培养组Col II染色略强于100nM甲状腺素组。两组在培养第3天起即有Col X表达，在培养的3周过程中两组的ColX染色相当。

3 讨论

本实验观察了药物浓度（100nM）甲状腺素对于体外组织工程软骨形成的作用。实验发现，高浓度的甲状腺素能抑制软骨细胞肥大以及成骨相关基因的表达，但同时使形成的软骨样组织减小，细胞外基质糖胺多糖和二型胶原的表达减少。

甲状腺素是机体内调节生长板软骨的生长和骨骼成熟的重要系统内分泌因子，甲状腺素直接刺激生长板软骨细胞的生长和成熟[11]。研究显示，甲状腺素低下的小鼠会出现骨骺板内软骨细胞增殖层和肥大层细胞减少，导致骺板厚度的降低，补充T4可以逆转这种生长板的紊乱，而补充生长激素则不能逆转这种紊乱，提示甲状腺素对软骨细胞增殖和成熟的作用[12]。在体外研究中也发现，低于或者近于生理浓度的甲状腺素（0.1～1.0nM）能够促进生长板软骨细胞转化为肥大软骨细胞，肥大标志基因碱性磷酸酶（ALP）的表达增加了130%[8]。甲状腺素对于软骨细胞形成典型的柱状排列的形态也有重要作用[13]。因此甲状腺素被认为是能够诱导软骨细胞成熟为肥大细胞的激素之一[14-15]。

研究显示，生理浓度甲状腺素对软骨细胞的克隆形成和增殖具有明显的抑制作用[16]，这一结果与本实验的MTT结果相似。本实验中，1nM甲状腺素组和100nM甲状腺素组的MTT值无统计学差异，说明甲状腺素对软骨细胞增殖的作用并无明显剂量依赖关系。生理浓度甲状腺素能够抑制小鼠软骨细胞pellets的Sox9基因的表达，并且促进软骨细胞肥大分化[17]。本实验发现，高浓度的甲状腺素抑制Sox9的作用仍旧存在，提示高浓度的甲状腺素引起软骨细胞改变的途径与与生理浓度下甲状腺素通过核受体引起软骨细胞相应改变的途径相同；但是与生理浓度不同的是，高浓度的甲状腺素反而抑制了软骨细胞的肥大分化，这一点与Guangyao Liu等[8]的研究结果相似：高于100nM的T3可以明显地抑制软骨细胞体外培养时的去分化和肥大分化，软骨肥大相关基因（ColX，MMP13）的表达均低于常规培养组。但是在Guangyao Liu等[8]的研究中，甲状腺素与胰岛素和骨形态发生蛋白2联合应用取得了较好的培养效果，而本实验单独应用了高浓度的甲状腺素并且发现抑制了软骨特异细胞外基质基因和蛋白的表达，因此推测高浓度甲状腺素是通过与胰岛素、骨形态发生蛋白2的信号通路相互作用而发挥药物作用的，联合应用后可能会有较好的效果。

本文探讨了高浓度甲状腺素对组织工程软骨形成的影响，显示高浓度甲状腺素能够抑制软骨细胞肥大及成骨分化，但同时也抑制了软骨细胞的增殖和分泌基质，从而为甲状腺素在软骨组织工程中的应用提供了参考。

[参考文献]

[1]Langer R， Vacanti JP. Tissue engineering [J]. Science， 1993， 260（5110）： 920-926.

[2]Cao YL， Vacanti CA， Upton J， et al. Transplantation of chondrocytes utilizing polymer-cell constructs to produce new cartilage in the shape of a human ear[J]. Plast Reconstr Surg， 1997， 100： 297-302.

[3]Liu Y， Chen F， Liu W， et al. Repairing large porcine full-thickness defects of articular cartilage using autologous chondrocyte-engineered cartilage[J]. Tissue Eng， 2002， 8（4）：709-721

[4]Steinert AF， Ghivizzani SC， Rethwilm A， et al. Major biological obstacles for persistent cell-based regeneration of articular cartilage[J]. Arthritis Res Ther，2007， 9（3）：213.

[5]Mello MA， Tuan RS. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation： in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells[J]. J Orthop Res， 2006， 24（11）：2095-2105.

[6]Gauthier K， Plateroti M， Harvey CB， et al. Genetic analysis reveals different functions for the products of the thyroid hormone receptor alpha locus [J]. Mol Cell Biol， 2001， 21（14）：4748-4760.

[7]Hidaka K， Kanematsu T， Takeuchi H， et al. Involvement of the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B signaling pathway in insulin/IGF-I-induced chondrogenesis of the mouse embryonal carcinoma-derived cell line ATDC5[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2001， 33（11）：1094-1103.

[8]Liu G， Kawaguchi H， Ogasawara T， et al. Optimal combination of soluble factors for tissue engineering of permanent cartilage from cultured human chondrocytes[J]. J Biol Chem， 2007， 282（28）：20407-20415.

[9]Ibold Y， Lübke C， Pelz S， et al. Effect of different ascorbate supplementations on in vitro cartilage formation in porcine high-density pellet cultures[J]. Tissue Cell， 2009，41（4）：249-256.

[10]Jefferies D， Farquharson C， Thomson J， et al. Differences in metabolic parameters and gene expression related to osteochondrosis/osteoarthrosis in pigs fed 25-hydroxyvitamin D3[J]. Vet Res， 2002， 33（4）： 383-396.

[11]King DB， May JD. Thyroidal influence on body growth[J]. J Exp Zool， 1984， 232（3）：453-460.

[12]Lewinson D， Harel Z， Shenzer P， et al. Effect of thyroid hormone and growth hormone on recovery from hypothyroidism of epiphyseal growth plate cartilage and its adjacent bone[J]. Endocrinology， 1989， 124（2）：937-945.

[13]Ballock RT， Reddi AH. Thyroxine is the serum factor that regulates morphogenesis of columnar cartilage from isolated chondrocytes in chemically defined medium[J]. J Cell Biol， 1994， 126（5）：1311-1318.

[14]Bohme K， Conscience-Egli M， Tschan T， et al. Induction of proliferation or hypertrophy of chondrocytes in serum-free culture： the role of insulin-like growth factor-I， insulin， or thyroxine[J]. J Cell Biol， 1992， 116（4）：1035-1042.

[15]Chen KS， Tatarczuch L， Ahmed Y， et al. Identification of light and dark hypertrophic chondrocytes in mouse and rat chondrocyte pellet cultures[J]. Tissue Cell， 2010， 42（2）：121-128.

[16]Robson H， Siebler T， Stevens DA， et al. Thyroid hormone acts directly on growth plate chondrocytes to promote hypertrophic differentiation and inhibit clonal expansion and cell proliferation[J]. Endocrinology， 2000， 141（10）：3887-3897.

第7篇：细胞工程基本原理范文

关键词：对虾细胞 永生性转化 研究进展

中图分类号：R73 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）04（c）-0248-02

随着对虾人工养殖集约化的发展，对虾病毒病日益频繁爆发，对虾细胞系是分离和纯化对虾病毒、研究病毒的致病机理、发展有效的诊断试剂和防控技术以及生产高效的病毒疫苗等的有利工具和研究技术。为建立对虾细胞系，国内外专家学者进行了大量的探索和不懈的努力，对虾细胞难以脱分化和有丝分裂寿命短是对虾细胞一直未能成功建系的两个制约性问题。人们逐渐意识到，仅仅靠改进对虾细胞培养基和培养条件可能难以实现对虾细胞的永生性转化。因此随着分子生物学的发展，逐渐有人开始尝试采用物理、化学和生物学方法来诱导转化对虾的原代细胞，以期望获得永生化的对虾细胞系。

1 物理方法诱导对虾原代培养细胞永生性转化

X-射线、电离辐射和60Co射线处理可以诱导细胞遗传物质发生变异，从而干扰细胞的衰老机制，激活细胞永生性相关基因的表达，是哺乳动物细胞常用的行之有效的永生性转化物理诱导手段。1990年，Crane最早尝试采用γ射线、x-射线和电离辐射处理原代培养的对虾细胞以使之发生变异成为永生性的细胞系，但是没有成功。虽然失败了，但这是对虾细胞永生性转化道路上的一次很好的探索[1]。

2 化学方法诱导对虾原代培养细胞永生性转化

5-溴尿嘧啶（BU）、甲基磺酸乙酯（EMS）、和N-甲基-N′-亚硝基胍类化合物（MNNG）等化学诱变剂都可引起细胞癌变，发生永生性转化。2001年，郎刚华等应用MNNG对中国明对虾淋巴组织原代培养细胞进行多次化学诱变处理，虽然诱变后的细胞呈现多层生长，并出现由成纤维样变为上皮样等转化特征，但没有实现连续传代[2]。

3 生物学方法诱导对虾原代培养细胞永生性转化

3.1 生长因子

细胞生长因子具有刺激细胞生长和繁殖，抑制细胞分化的生物学特性。1995年，Hsu等首次采用碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对斑节对虾的淋巴细胞进行诱导转化，发现经诱导处理后的淋巴细胞不需饲养层就可生长繁殖，并传代超过90代[3]。但随后该细胞系被证实为污染的单细胞真核生物（Thraustochytrids）。2002年，樊廷俊等在对虾细胞培养基中同时添加了bFGF和胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-II）以诱导中国明对虾淋巴细胞转化，转化后的细胞在报道时已传代培养4代，但并未见到成功建系的后续报道。虽然已有不少研究发现在添加生长因子的情况下，对虾细胞的生存和增殖能力获得了不同程度的改善，但是目前还未发现哪一些生长因子能支持对虾细胞发生自发性转化并获得无限增殖能力。

3.2 细胞融合

通过细胞融合有可能获得具有两种亲本细胞生物学特性的杂交细胞。将已成系的永生性细胞与对虾细胞融合，有可能获得具有无限增殖能力的对虾细胞。2001年，樊廷俊和史振平将已成系的牙鲆鳃细胞（FG）与中国对虾淋巴组织原代培养细胞，通过聚乙二醇（PEG）诱导融合法进行杂交，筛选出可继代培养的杂交细胞，并将杂交细胞传代培养12次，但未见有该对虾杂交细胞成系的后续报道[4]。2010年，Claydon等同样采用PEG诱导融合法分别将鲤鱼上皮瘤细胞系（EPC）和草地夜蛾蛹卵巢细胞系（Sf9）与对虾血淋巴原代培养细胞进行融合，并成功筛选得到杂交细胞系，但是该细胞系缺乏甲壳纲动物细胞体外病毒复制的关键成分不能用于对虾病毒的研究，因而不能解决对虾细胞建系的根本目的。

3.3 病毒癌基因

猿猴病毒40（SV40）是简单的真核细胞病毒，SV40的大T抗原（SV40LT）可抑制肿瘤抑制因子p53蛋白的活性，因而将SV40LT基因导入哺乳动物细胞中，可成功诱导细胞的永生性转化[5]。1995年，Tapay等首次采用脂质体转染法成功将SV40LT基因转染到南美蓝对虾原代培养淋巴细胞中，发现转染后淋巴细胞呈圆形，聚集成葡萄样细胞团，贴壁不紧，生长速度加快，可传代18～44次以上；而未转染的淋巴原代细胞呈成纤维样，贴壁紧，不能传代。遗憾的是，最终也没有成功建立对虾淋巴细胞永生性的细胞系。2006年，胡国斌等利用复制缺陷型-泛嗜性逆转录病毒作为载体，也成功将SV40LT基因转染到中国对虾原代培养淋巴细胞中，转基因细胞呈现了转化特征，但传代细胞由于真菌污染未能保留下来。

人状多瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的E6和E7基因编码的E6和E7蛋白可分别与抑癌基因p53和Rb结合，从而影响细胞的增殖、转移和细胞周期，诱发细胞永生性转化。2008年，Claydon将HPV的E6和E7基因转染到红螯螯虾的原代培养细胞中，结果发现转染细胞可存活4个月，但存活的对虾细胞不分裂[6]。

4 前景展望

成功建立对虾连续性细胞系的关键问题之一是对虾培养细胞的永生性转化。哺乳动物细胞中端粒酶活性的有无决定了细胞寿命的长短。肿瘤细胞的端粒酶常常被激活而获得永生性。Lang等（2004）报道，对虾细胞中可检测到端粒酶活性，而且日本对虾淋巴组织原代培养细胞的端粒酶的活性可以维持30天[7]。但Jayesh（2012）在对虾原代培养细胞中却并未检测到端粒酶活性。因此，通过转染端粒酶基因是否能够提高体外培养对虾细胞的寿命，以获得永生性对虾细胞系尚有待进一步实验验证。

分子重编程技术是近年来发展起来的一种通过在细胞中过表达多能性因子来实现分化细胞向多能干细胞逆转的技术。2006年，山中伸弥领导的研究小组利用逆转录病毒基因转移技术，将4个多能性转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）共转染到小鼠成纤维细胞中，成功诱导成纤维细胞的去分化，并重编程为多能干细（即iPS细胞），而且所获得的iPS细胞有高达50%的动物致瘤性。因此，将分子重编程技术应用于对虾细胞，以实现对虾细胞的脱分化与永生性转化，不失为今后对虾细胞建系的一个新的研究方向和突破口。

对虾永生性细胞系的建立是一个不断探索的过程，可能需要漫长的时间。目前，尽管对虾细胞永生性转化未取得成功，但实验中的尝试和探索为最终实现体外培养对虾细胞的永生性转化奠定了基础，并为以后的研究和发展提供了经验和借鉴。

参考文献

[1] Crane，M St J.Mutagensis and cell transformation in cell culture[J].Methods in Cell Science，1999，21：245-253.

[2] 郎刚华，王勇，陈西广，等.中国对虾淋巴组织的长期原代培养和化学诱变初探[J].青岛海洋大学学报，2001，31（3）：411-414.

[3] Hsu Y-L，et al.Development of an in vitro subculture system for the oka organ（Lymphoid tissue）of Penaeus monodon[J].Aquaculture，1995，136： 43-55.

[4] 樊廷俊，史振平.牙鲆鳃细胞与中国对虾淋巴细胞杂交细胞的体外培养[J]. 水产学报，2001，25（1）：11-15.

[5] Berthon P，Goubin G，Dutrillaux B，et al.Single-step transformation of human breast epithelial cells by SV40 large T oncogene[J].Int J Cancer， 1992，52（1）：92-97.

第8篇：细胞工程基本原理范文

一、教学目的要求

(一)要求学生比较系统地掌握关于细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等方面的基础知识，以及这些知识在农业、医药、工业、国防上的应用。

(二)通过生物学基础知识的学习，使学生受到辩证唯物主义和爱国主义思想的教育。

(三)要求学生掌握使用高倍显微镜，做简单的生理实验等的基本技能。

(四)培养学生自学生物学知识的能力，观察动植物的生活习性、形态结构、生殖发育的能力，分析和解释一些生物现象的初步能力。

二、确定教学内容的原则

(一)从学生今后进一步学习和参加社会主义现代化建设的需要出发，认真选取生物学基础知识：选取生物的结构和生理的知识。结构知识是理解生理知识的基础。生理知识是阐明生物的新陈代谢，生长、发育和生殖等的基础知识。因此，必须重视选取形态结构和生理的知识。

(二)选取生物学基础知识，必须做到理论密切联系实际。

1.选取生物学基础知识，要密切联系工农业生产实际。生物学是农业、畜牧业和医学等方面实践的理论基础，通过学习生物学知识，要使学生知道生物与生产的关系十分密切，应该利用和改造有益的生物，防除有害的生物。

2.要密切联系各地的自然实际。由于我国幅员广大，各地的生物种类有很大差别。因此，所选取的植物和动物，既要重视其典型性，又必须尽可能是各地比较常见的，以便学生可以直接观察到这些动植物和了解这些动植物的生活规律。

3.选取的生物学基础知识，要密切联系学生的日常生活实际，使学生加深对生物学知识的理解，同时更加深刻地认识学习生物学的意义。

(三)适当选取反映现代生物科学水平的生物学基础知识。

现代生物科学发展很快，生物课必须重视用现代生物科学的观点来阐述教学内容，并且适当地增加反映现代生物科学水平的知识内容，使学生对生物科学发展的现状有个初步的认识，为他们进一步学习现代生物科学知识和参加工农业生产打下必要的基础。

三、班级现状分析

本学期我任教高二（2）、（3）、（4）三个班级，三个班级人数分别为：46、45、46人，虽然通过班主任，我对个班的现状有了一点了解，但由于生物是从高二开始的起始课程，所以具体情况还不能下定论。

四、教学进度安排

高中阶段学习的生物学知识，是在初中生物教学内容的基础上进行的，学习生物的基本特征，侧重于生命活动的共同规律的内容。主要包括细胞、新陈代谢及其调节、生殖和发育、遗传和变异的知识。初中和高中两个阶段所学的生物学基础知识，既有所分工、又互相衔接，高中生物学是初中生物学知识的综合、概括和提高。

高中二年级开设的生物必修课（第一学期），每周2课时，共计34课时。讲述细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等生物学基础知识。

五、教学内容及其课时安排

高中生物必修课教学进度

单元

知 识

学生实验

课时

要 点

教学要求

项 目

绪论

生物的基本特征

生物科学的新进展

高中生物课学习的要求和方法

b

a

a

2

生命的物质基础

组成生物体的化学元素

组成生物体的化合物

b

c

实验：显微镜的结构和使用；生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定。

2+1+1

生命的基本单位-细胞

细胞主要的亚显微结构和功能

细胞周期

细胞分裂

b

c

a

实验：

1．颤藻和水绵细胞的比较观察

2．植物细胞的有丝分裂。

生物的新陈代谢

光合作用的发现，光合作用及其重要意义

根对水分的吸收和利用

植物的矿质营养

动物的营养

呼吸作用

a

b

b

b

b

实验：

1．叶绿体色素的提取和分离

2．植物细胞的质壁分离与复原。

2+5

应激性和生命活动的调节

植物生命活动的调节

高等动物的激素调节

高等动物的神经调节

a

a

b

1+1+2

生殖和发育

减数分裂和配子的形成

a

2

具体教学内容如下：

绪 论

生物的基本特征(细胞结构，新陈代谢，生长现象，应激性，生殖和发育，遗传和变异，生物与环境的相互影响)的概述。

生物学的研究对象和发展方向。学习生物学的重要意义。

说明：生物学的研究对象和发展方向，只要求学生作一般了解。

一、细胞

细胞的发现。细胞学说。原生质的概念。

细胞的化学成分：水，无机盐，糖类， 脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。

细胞的结构和功能：原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体、内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。一个细胞是一个有机的统一整体。细胞的分裂：无丝分裂。有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。

〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，初步学会使用高倍显微镜。

说明：在《细胞》中，以下内容只要求学生作一般了解。

1.细胞的发现，细胞学说，原生质的概念。

2.内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。

3.无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式有有丝分裂。

二、生物的新陈代谢

新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。

绿色植物的新陈代谢：水分代谢——细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水；细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。渗透吸水的原理。渗透作用的概念。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。

矿质代谢——植物需要的元素(大量元素和微量元素)。根吸收矿质元素的过程——交换吸附。植物对离子的选择吸收。矿质元素的利用。

光合作用——光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应，暗反应)。atp(三磷酸腺苷)的简式，atp与adp(二磷酸腺苷)的相互转变。

呼吸作用——呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。

动物的新陈代谢：体内细胞的物质交换——单细胞动物与外界环境直接进行物质交换；多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。

物质代谢——食物的消化(单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。哺乳动物的消化过程概述)。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。

能量代谢——气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。

新陈代谢的基本类型：同化作用的两种不同类型(自养型、异养型的概念和特点)。异化作用的两种不同类型(需氧型、厌氧型的概念和特点)。

〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。

(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。

(3)叶绿体中色素的提取和分离。

说明：1.在《生物的新陈代谢》中，以下内容只要求学生作一般了解。

(1)细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。*渗透作用的概念。

(2)根吸收矿质元素的过程——交换吸附。

*(3)植物对离子的选择吸收。

(4)呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。

(5)单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。

(6)单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。

三、生命活动的调节(4∶0)

植物生命活动的调节：生长素的发现。植物的向光性和向光性形成的原因。生长素的生理作用及其在实践上的意义。

动物生命活动的调节：高等动物的激素调节(甲状腺激素、性激素、生长激素的分泌部位和生理作用)。昆虫的激素调节(内激素、外激素的分泌部位和生理作用，昆虫激素在生产上的应用)。神经调节(神经系统的调节功能)。≤第一范文 网整理该文章，版权归原作者、原出处所有≥

说明：在《生命活动的调节》中，以下内容只要求学生作一般了解。

*1.生长素的发现。

*2.昆虫的激素调节。

四、生物的生殖和发育(9∶0)

生物的生殖。生殖的概念。

生殖的种类：无性生殖(分裂生殖，孢子生殖，出芽生殖，营养生殖)；有性生殖(配子生殖中的卵式生殖)。这些生殖方式的特点和概念。

减数分裂与有性生殖细胞的成熟：减数分裂的概念和意义。的形成过程。卵细胞的形成过程。受精作用的概念和意义。

生物的发育。发育的概念。

植物的个体发育(以荠菜为例)：胚的发育过程，胚乳的发育过程。

动物的个体发育(以蛙为例)：胚的发育过程(包括卵裂、囊胚、原肠胚各期)，各种组织、器官和系统的形成。胚后发育。胚的发育与环境的关系。

说明：在《生物的生殖和发育》中，以下内容只要求学生作一般了解。

*1.生殖的种类。

*2.无性生殖和有性生殖方式的特点和概念。

*3.植物的个体发育(以荠菜为例)。

1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：

（一）生命的基础

细胞的化学成分——水，无机盐，糖类，脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。

原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。

有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。

2.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：

内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。

无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。

3.〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，学会使用高倍显微镜。

(二)生物的新陈代谢(5∶2)

1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：

新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。

细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。植物需要的元素(大量元素和微量元素)。矿质元素的利用。

光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应、暗反应)。atp(三磷酸腺苷)的简式，atp与adp(二磷酸腺苷)的相互转变。

呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。

多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。

哺乳动物的消化过程概述。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。

气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。

3.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：

细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。

根吸收矿质元素的过程——交换吸附。

呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。

单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。

4.〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。

(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。

(3)叶绿体中色素的提取和分离。

(三)生命活动的调节(2∶0)

在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：

植物的向光性和向光性形成的原因。生长素的生理作用及其在实践上的意义。

第9篇：细胞工程基本原理范文

关节软骨缺乏再生能力，外伤或疾病引起的软骨缺损需利用软骨或其它材料修复。自体软骨来源有限，且容易造成供区缺损，应用受到限制。异体软骨曾广泛应用，但可引起免疫排斥反应，而导致细胞死亡及功能丧失。骨膜移植曾风行一时，但其存在远期效果不稳定的缺陷，使得人们不断探索更完善的修复方法。体外软骨细胞培养成功，引发人们尝试直接用软骨细胞修复软骨缺损。1968年，Chertman等将软骨细胞悬液注射到关节软骨缺损部位，结果表明：缺损为滑膜成纤维组织修复，镜下仅见少量新生软骨细胞结节。1977年，Green等以脱钙骨作为支架，并接种上软骨细胞，移植到缺损部位。虽未成功，可喜的是作者第一次提出：如能找到一种合适的支架材料，将软骨细胞接种于其上，即有可能形成良好的软骨组织修复。当前，在组织工程中开发为细胞培养支架的生物支架材料主要分为两类，即天然生物支架材料和人工合成的支架材料。天然生物支架材料具有细胞信号识别，促进细胞的黏附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点，显示出人工合成支架材料无可比拟的优势。本文就天然生物支架材料在软骨修复中的现状和研究进展做如下综述。

1天然脱细胞生物支架材料

天然脱细胞生物支架材料主要利用同种或异种器官／组织，经脱细胞、去除抗原处理得到脱细胞基质材料。细胞外基质(ECM)是由细胞自身分泌组成的并围绕在细胞周围主要含有胶原蛋白、纤维蛋白粘连素、层粘连蛋白，层连素等。细胞外基质不仅为细胞提供了一个支持结构和附着位点，而且对细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控有重要作用和显著影响。目前已经有研究应用同种异体脱细胞材料修复膀胱、尿道、动脉和皮肤缺损［1～3］，以及构建心脏瓣膜［4］，结果比较满意。另外关于脱细胞软骨基质和小肠粘膜下基质(SIS)这2种天然的细胞外基质材料应用也有相关的研究报道［5～7］。

脱细胞基质材料具有多种天然细胞外成分，有利于细胞的吸附，增殖和分化并具有一定的力学强度，可作为组织填充物而长期存在；并且具有较好的组织亲和性和相容性，可诱导软骨细胞向其中生长而重建软骨，在未来组织修复中它们将拥有广泛的应用前景；但其脱细胞后的孔穴大小及孔穴间的连接缝隙的大小制约着种植细胞向深层发展。

2胶原支架材料

胶原是人体内含量最丰富的蛋白，占人体蛋白总量的30％以上，其中以细胞外基质中胶原蛋白含量最高。胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在，其基本组成单位是原胶原分子，原胶原蛋白分子经多级聚合形成胶原纤维。胶原纤维与细胞外基质中其它成分形成结构与功能的复合体。胶原作为天然的生物材料，其本身无毒性，可被细胞酶类识别、标记、降解，有利于软骨细胞黏附、增殖和分化，还可刺激移植组织产生新的胶原，并且降解产物可被机体吸收。

Wakitani等用Ⅰ型胶原凝胶与软骨细胞或间充质干细胞混合后修复兔膝关节软骨的全厚度缺损，取得较为满意的结果［8,9］。Wambach等从狗甲状软骨上获得的软骨细胞种植到牛Ⅰ型胶原纤维上体外培养，结果发现甲状软骨细胞在Ⅰ型胶原基质中，通过产生Ⅱ型胶原，表达自身表型［10］。Stone等设计了一种用作半月板再生的胶原支架，经FDA批准后在10位病人身上作了初步的临床实验［11，12］。实验结果表明，胶原支架是可移植的，而且在3a的植入期内是安全的，支架支持半月板缺损的组织再生，在连续的血清学测试中未发现不良的免疫反应。术后6个月通过关节镜检查发现新生成的软骨组织替代了已被吸收的原植入物。Lee用Ⅱ型胶原作支架培养软骨细胞，结果表明细胞生长和功能表达良好［13］。这些结果表明利用胶原材料作为基质支架开发组织工程化软骨是可行的。

Ⅰ、Ⅱ型胶原由于含有特别的识别信号，有利于软骨细胞粘附、增殖、分化，可作为良好的材料包埋添加剂。缺点是缺乏一定的机械强度，难于塑形，支架材料在体内降解过快，新生软骨组织生化组成也难于评价。另外，由天然生物材料制备的胶原，每批产品之间，还存在着生化性质的差异。

3纤维蛋白支架材料

纤维蛋白凝胶在软骨组织工程中的应用仅排在聚乳酸(polylacticacid，PLA)、聚羟基乙酸(PolyGlycolicAcid，PGA)和胶原材料之后。纤维蛋白与胶原一样，本身就来自天然的细胞外基质，因此，也具有很好的生物相容性。纤维蛋白凝胶是纤维蛋白单体在凝血酶作用下聚合成的具有可塑形、可黏附性、可降解性及生物相容性的立体网状结构凝胶，它可通过减慢凝血酶的聚集，因而减慢它从液态转变为凝胶的过程，为凝胶的塑形提供充分的时间。纤维蛋白凝胶聚合时能释放血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子β(TGFβ)，有趋化性和致有丝分裂作用，能进一步促进细胞增殖、黏附和基质分泌。用这种凝胶包埋软骨细胞，为细胞的生存提供了三维空间支持。纤维蛋白凝胶的大小和形状能够根据需要而塑形，为组织工程化软骨提供了一种可选择的聚合物支架。来源于自身血液制备的纤维蛋白凝胶，避免了免疫原性问题，可直接用于临床，具有取材简单、制备方便、韧性好等优点［14］。Hendrickson等将软骨细胞-纤维蛋白原-软骨-凝血酶混合物注入马软骨缺损区，1个月后形成类透明软骨，内含大量的糖胺多糖和Ⅱ型胶原［15］。Silverman等将纤维蛋白与凝血酶混合产生纤维蛋白凝胶，再与猪软骨细胞混合，注射到裸鼠皮下，在6、12周收集新形成的软骨，通过组织学检查及糖胺多糖、DNA和胶原Ⅱ含量分析，细胞浓度为40×104／ml时在6、12周形成固体软骨，较对照组(仅注射软骨细胞或纤维蛋白胶组)有显著差异，因此认为，纤维蛋白胶对于可注射组织工程软骨是一个合适的聚合物［16］。Meinhart的研究工作也支待上述观点［17］。VanSusante等在羊的股骨髁制造全层软骨缺损，然后将兔软骨细胞和纤维蛋白胶原混悬液植于缺损处，研究显示纤维蛋白凝胶作为三维支架材料不能提供足够的生物机械支特［18］。Sims等利用血纤维蛋白单体聚合成凝胶用作基质支架，将浓度为12～15×106c

ell／ml的软骨细胞―支架复合物植入裸鼠体内，术后12周发现有新的软骨生成。作者还将人的肋骨软骨细胞接种在纤维蛋白凝胶支架上，然后植入裸鼠皮下，也取得了很好的实验结果［19］。

纤维蛋白胶可促进细胞的粘附、增殖和基质分泌，但作为三维支架材料它不能提供足够的机械强度，这也是天然生物材料的共同缺点，再者它来自血液，大量获取困难，但在非承重区的小范围软骨修复中仍不失为一种较好的支架材料。

4糖胺多糖

糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)是软骨细胞增殖、分化的标志性产物。在体内GAG与蛋白质结合成为蛋白多糖(proteoglycan，PG)，构成细胞外的四大成分之一，可促进细胞的粘附、增殖、分化。人体内存在7种糖胺多糖：透明质酸(hyaluronicacid，HA)，4硫酸软骨素(chondroitin4sulfate，CH4S)，6硫酸软骨素(chondroitin6sulfate，CH6S)，硫酸皮肤素(demaransulfate，DS)，硫酸角质素(karatansulfate，KS)，肝素(heparin，HP)和硫酸肝素(heparansulfate，HS)。

Aigner等研究半合成可吸收物质透明质酸苯甲基硫(Hyaff11)在软骨重建组织工程中人鼻中隔软骨细胞培养的支架的可能性，研究证实Hyaff11无纺网支架在软骨移植组织工程中有很好的发展前景［20］。Grigolo等用Hyaff11无纺网与软骨细胞混合培养修复软骨缺损，在第24周时，已有透明软骨生成［21］。另外研究表明透明质酸及其衍生物支架有利于软骨细胞的粘附、迁移、增殖与分化，并且促进其中生长的软骨细胞合成和分泌细胞外基质［22,23］。这种糖胺多糖支架在自体软骨细胞移植中具有一定潜力，在软骨组织工程中有较好的应用前景。

5几丁质

几丁质是一种天然高分子有机多糖，亦称甲壳质、甲壳素、壳聚糖。其化学名称为β-(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖。这类天然多聚糖有明显碱性，良好的生物相容性和生物可降解性。几丁质所有降解产物对人体均无毒性、无刺激、无免疫原性、无致突变效应［24］。该材料具有广谱的抑制细菌、霉菌的作用，能促进上皮细胞生长和创面愈合，且来源广泛、价格便宜。Lahiji等在包被和未包被几丁质的塑料盖玻片上种植人软骨细胞和成骨细胞，培养7d用荧光分子探针评价细胞活性，RT-PCR和免疫组织化学分析软骨、成骨细胞的表型表达。几丁质包被的细胞在玻片上成骨和软骨细胞表现为圆形和折光性。相反在塑料玻片上90％的细胞变长或呈纺锤形。RT-PCR和免疫染色证实在几丁质上成骨细胞表达I型胶原、软骨细胞表达Ⅱ型胶原［25］。在体外研究证实，具有生物相容性的几丁质作为基质材料可促进成骨和软骨细胞生长并保持其功能，几丁质作为组织工程支架材料，具有修复骨和软骨缺损的潜能。

6藻酸盐

藻酸是从海藻中分离出来的一类多糖聚合物。藻酸钙水凝胶可保持较好的形状，并且藻酸钙无毒性，在组织培养中用于细胞培养载体。Paige等采用藻酸钙水凝胶复合牛肩关节软骨细胞做成圆盘状移植物，移植于裸鼠背部皮下，8、12周后形成新鲜软骨［26］。Fragonas等研究了藻酸盐凝胶混合同种异体软骨细胞，体内修复全层损伤的兔关节软骨，4～6个月后，软骨细胞移植物完全修复缺损，并恢复到正常组织结构［27］。藻酸盐水凝胶与其他聚合物相比，价格低、来源丰富、易塑形、具有更好的亲水性，易于细胞吸附，营养物质易于渗透等特点；它本身不是软骨细胞外基质的天然成分，与PLA、PGA等特定形状聚合物材料相比，藻酸钙水凝胶具有亲水性好、营养物质易于渗透、可预先制成各种形状、能为细胞提供良好的三维生长环境并能保持良好形态等优点。藻酸钙水凝胶在生物体内以酶解方式生成甘露糖醛酸和葡萄糖醛酸单体，对机体无毒性、无免疫原性［28］。但藻酸钙也存在组成成分不稳定，不同成品纯度不一，藻酸钙的纯度不够会导致一定程度的免疫原性和较差的可吸收性。

7蚕丝蛋白

蚕丝蛋白直接来源于蚕的腺体蛋白，经分离和鉴定，它是一种多肽，Inoue等研究发现，家蚕分泌的丝蛋白包括一个重链，一个轻链和一个精蛋白P25，重链和轻链由二硫键连接，P25以二硫化合物通过非共价键形式结合。蚕丝蛋白定量酶联免疫吸附试验显示，重链、轻链、P25的克分子比为6：6：1［29］。Inouye等检测了动物贴壁细胞在蚕丝蛋白、胶原、聚苯乙烯3种材料包被的培养皿中生长情况，发现蚕丝蛋白和胶原蛋白包被的培养皿，细胞生长情况基本一致，均较在聚苯乙烯包被的培养皿中生长的细胞高出30％～50%［30］。Santin等评价蚕丝纤维膜的炎症反应，并与2种物理-化学性质完全不同的物质聚苯乙烯、2-羟乙基一甲基丙烯酸酚作对比，蚕丝膜引起的炎性反应要少于高分子材料［31］。天然材料本身包含很多生物信息，能够使细胞更容易附着，并促进细胞的分化、增殖，保持细胞的表型，但天然材料在生产、加工过程中，质量难以控制，性能发生变化。蚕丝已是天然成品可避免其它天然生物材料需进一步加工形成的缺点。蚕丝具有良好的表面活性和很好的组织相容性。所以蚕丝是软骨细胞立体培养的良好天然支架，其来源丰富，价格便宜处理简单，在软骨组织工程领域中将有广泛的应用前景。

8复合天然聚合物支架材料

体内细胞生长的基质非常复杂，单一材料较难适应细胞培养的要求，通过共混调整不同材料之间的比例，使共混材料具有更适合细胞培养的力学性能、降解性和生物学性质等。天然可降解生物材料既可以与天然的生物材料共混，也可以与人工合成的生物材料共混。Yamane等用几丁质和硫酸软骨素混合制得水凝胶，在其中接种关节软骨细胞，发现细胞能很好地贴附于材料上，并且细胞能保持一些软骨细胞特殊的表型，如细胞呈圆形，存在有限的有丝分裂，能生成Ⅱ型胶原及蛋白聚糖等。这些结果证实硫酸软骨素-几丁质可能是一种很好的自体软骨移植载体材料或用于组织工程中类软骨组织的骨架［32］。透明质酸

与藻酸盐、胶原蛋白或者几丁质混合包埋，将会对软骨细胞的吸附、增殖、分化产生更好的促进作用，最终导致特异性软骨基质形成［33］。天然高分子生物材料还可作为高分子聚合物的包埋剂以增强高分子材料的亲水性及对细胞的粘附、增殖、分化作用［34］。

9天然生物支架材料存在的问题和展望

理想的软骨组织工程支架材料应具有以下特性：（1）具有良好的生物相容性。在体外培养时无细胞毒性，植入体内，无论其本身或其降解产物都应对机体无毒性，都不会导致机体炎症反应和引起宿主的移植排斥反应；（2）具有三维立体结构。必须是高度多孔的类似泡沫状，孔隙率应达到90％以上，并具有很大的内表面积，这样既有利于细胞的植入、粘附，又有利于细胞营养成分的渗入和代谢产物的排出；（3）具有良好的表面活性。应能够促进软骨组织粘附和增殖，并且能很好维持和促进软骨细胞的表型表达；（4）具有生物可降解性和降解率。支架在组织形成过程中应逐渐被降解，并且不影响新生成组织的结构和功能。材料支架的降解速率必须与种植入的细胞组织形成的速率相匹配，当材料支架完成为组织再生提供模板的功能后，可被完全地降解吸收掉；（5）具有可塑性。可被加工成所需要的形状并具有一定的机械强度，在植入体内后的一定时间内仍可保持其形状，并使新形成的组织具有符合设计的外形。

天然生物支架材料来源于生物体本身，具有组织相容性较好，毒性较小，易降解，且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点，所以在组织工程中作为细胞培养的支架材料具有人工合成材料所不可比拟的优势。但天然生物材料也存在一些需要解决的问题：(1)天然可降解的生物材料每批产品的质量都不一样，故其产品质量比较难控制。天然高分子材料在力学性能及降解速度、通透性等方面存在矛盾，即高分子量通常有高强度，但是它的降解速度和通透性就难以满足组织工程中细胞培养支架的要求。因此需要统一材料的质量标准，严格控制其质量，加强材料的性质和结构等基础理论的研究；(2)共混生物材料的研究开发，可以取长补短，来满足组织工程中不同组织的要求，生产出具有合适降解速度、良好通透性、弱免疫原性的细胞培养支架材料，所以应加强对共混膜的性质及制备方法的研究；(3)对现有天然生物材料，包括其衍生物也有待于进一步的研究开发，如对几丁质和透明质酸进行化学修饰，产生多种衍生物，使其更适合作为细胞培养的支架材料；(4)天然可降解生物材料与细胞之间的粘附问题也有待于进一步的研究，选择有利于细胞粘附的材料，同时可以对作为细胞培养支架材料进行表面修饰。

总之，当前软骨组织工程支架材料研究重点是改进现有材料和制备工艺，并探索新材料和新的制备方法。在改进材料的基础上，将生长因子与支架复合或配以更合理的工程化细胞培养体系以提高软骨质量，并由动物实验逐步向临床应用过渡将是今后研究的方向，并将推动软组织工程研究向成熟阶段迈进。

参考文献：

［1］SchanerPJ,MartinND,TulenkoTN,etal.Decellularizedveinasapotentialscaffoldforvasculartissueengineering［J］.JVascSurg.2004，40(1):146-153.

［2］NgKW,KhorHL,HutmacherDW.Invitrocharacterizationofnaturalandsyntheticdermalmatricesculturedwithhumandermalfibroblasts［J］.Biomaterials,2004,25(14):2807-2818.

［3］JemiganTW,CroceMA,CagiannosC,etal.Smallintestinalsubmucosaforvascularreconstructioninthepresenceofgastrointestinalcontamination［J］.AnnSurg，2004，239(5):733-740.

［4］CebotariS,MertschingH,KallenbachK,etal.Constructionofautologoushumanheartvalvesbasedonanacellularallograftmatrix［J］.Circulation.2002,24;106(12Suppl1):163-168.

［5］LiF,LiW,JohnsonS,etal.Lowmolecularweightpeptidesderivedfromextraceularmatrixaschemoattractantsforprimaryendothelialcells［J］.Endothelium,2004,11(3-4):199-206.

［6］FoxDB,CookJL,ArnoczkySP,etal.Fibrochondrogenesisoffreeintraarticularsmallintestinalsubmucosascaffolds［J］.TissueEng，2004,10(1-2):129-137.

［7］ZhangF,ZhuC,OswaldT,etal.Porcinesmallintestinalsubmucosaasacarrierforskinflapprefabrication［J］.AnnPlastSurg,2003,51(5):488-492.

&n

bsp;［8］WakitaniS,GotoT,YoungRG,etal.Repairoflargefullthicknessarticularcartilagedefectswithallograftarticularchondrocytesembeddedinacollagengel［J］.TissueEng,1998,4(4):429-444.

［9］WakitaniS,GotoT,PinedaSJ,etal.Mesenchymalcellbasedrepairoflarge,fullthicknessdefectsofarticularcartilage［J］.JBoneJointSurg(Am),1994,76(4):579-592.

［10］WambachBA,CheungH,JosephsonGD.CartilagetissueengineeringusingthyroidchondrocytesonatypeIcollagenmatrix［J］.Laryngoscope,2000,110(12):2008-2011.

［11］StoneKR,SteadmanJR,RodkeyWG,etal.Regenerationofmeniscalcartilagewithuseofacollagenscaffold.Analysisofpreliminarydata［J］.JBoneJointSurg(Am),1997,79(12):1770-1777.

［12］StoneKR,RodkeyWG,WebberR,etal.Meniscalregenerationwithcopolymericcollagenscaffolds.Invitroandinvivostudiesevaluatedclinically,histologically,andbiochemically［J］.AmJSportsMed,1992,20(2):104-111.

［13］LeeCR,GrodzinskyAJ,SpectorM.BiosyntheticresponseofpassagedchondrocytesinatypeⅡcollagenscaffoldtomechanicalcompression［J］.JBiomedMaterResA,2003,64(3):560-569.

［14］PerettiGM,RandolphMA,ZaporojanV,etal.Abiomechanicalanalysisofanengineeredcellscaffoldimplantforcartilagerepair［J］.AnnPlastSurg,2001,46(5):533-537.

［15］HendricksonDA,NixonAJ,GrandeDA,etal.Chondrocytefibrinmatrixtransplantsforresurfacingextensivearticularcartilagedefects［J］.JOrthopRes,1994,12(4):485-497.

［16］SilvermanRP,PassarettiD,HuangW,etal.Injecbrtissueengineeredcartilageusingafibringluepolymer［J］.PlastReconstrSurg,1999,103(7):1809-1818.

［17］MeinhartJ,FusseneggerM,HoblingW.Stabilizationoffibrinchondrocyteconstructsforcartilagereconstruction［J］.AnnPlastSurg,1999,42(6):673-678.

［18］VanSusanteJL,BumaP,HommingaGN,etal.Chondrocyteseededhydroxyapatiteforrepairoflargearticularcartilagedefects［J］.Apilotstudyinthegoat.Biomaterials，1998,19(24):2367-2374.

［19］SimsCD,ButlerPE,CaoYL,etal.Tissueengineeredneocartilageusingplasmaderivedpolymersubstratesandchondrocytes［J］.PlastReconstrSurg,1998,101(6):1580-1585.

［20］AignerJ,TegelerJ,HutzlerP,etal.Cartilagetissueengineeringwithnovelnonwovenstructuredbiomaterialbasedonhyaluronicacidbenzylester［J］.JBiomedMaterRes,1998,42(2):172-181.

［21］GrigoloB,RosetiL,FioriniM,etal.Transplantationofchondrocytesseededonahyaluronanderivative(hyaffo11)intocartilagedefectsinrabbits［J］.Biomaterials,2001,22(17):2417-2424.

［22］YooHS,LeeEA,YoonJJ,etal.Hyaluronicacidmodifiedbiodegradable

scaffoldsforcartilagetissueengineering［J］.Biomaterials,2005,26(14):1925-1933.

［23］NettlesDL,VailTP,MorganMT,etal.Photocrosslinkablehyaluronanasascaffoldforarticularcartilagerepair［J］.AnnBiomedEng,2004,32(3):391-397.

［24］NettlesDL,ElderSH,GilbertJA.Potentialuseofchitosanasacellscaffoldmaterialforcartilagetissueengineering［J］.TissueEng,2002,8(6):1009-1016.

［25］LahijiA,SohrabiA,HungerfordDS,etal.Chitosansupportstheexpressionofextracellularmatrixproteinsinhumanosteoblastsandchondrocytes［J］.JBiomedMaterRes,2000,15;51(4):586-495.

［26］PaigeKT,CimaLG,YaremchukMJ,etal.Denovocartilagegenerationusingcalciumalginatechondrocyteconstructs［J］.PlastReconstrSurg,1996,97(1):168-178;179-180.

［27］FragonasE,ValenteM,PozziMucelliM,etal.Articularcartilagerepairinrabbitsbyusingsuspensionsofallogenicchondrocytesinalginate［J］.Biomaterials,2000,21(8):795-801.

［28］CatersonEJ,LiWJ,NestiLJ,etal.Polymer/alginateamalgamforcartilagetissueengineering［J］.AnnNYAcadSci,2002,961:134-138.

［29］InoueS,TanakaK,ArisakaF,etal.SilkfibroinofBombyxmoriissecreted,assemblingahighmolecularmasselementaryunitconsistingofHchain,Lchain,andP25,witha6:6:1molarratio［J］.JBiolChem,2000,22;275(51):40517-40528.

［30］InouyeK,KurokawaM,NishikawaS,etal.UseofBombyxmorisilkfibroinasasubstratumforcultivationofanimalcells［J］.JBiochemBiophysMethods,1998,18;37(3):159-164.

［31］SantinM,MottaA,FreddiG,etal.Invitroevaluationoftheinflammatorypotentialofthesilkfibroin［J］.JBiomedMaterRes,1999,5;46(3):382-389.

［32］YamaneS,IwasakiN,MajimaT,etal.Feasibilityofchitosanbasedhyaluronicacidhybridbiomaterialforanovelscaffoldincartilagetissueengineering［J］.Biomaterials,2005,26(6):611-619.