细胞凋亡精选(九篇)

第1篇：细胞凋亡范文

1神经元凋亡的慢性炎症学说

近年的免疫组织化学研究表明，许多神经疾病尤其AD患者脑内有强烈的局灶性炎症反应，组织培养及分子生物学方法也证明脑细胞可产生许多炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β等)、补体蛋白及其他免疫分子。这些炎性蛋白质及小胶质细胞(microglia,Mi)活化同AD病变间的密切关系，使人们提出了神经元退化的炎症学说。近年来有关β-淀粉样蛋白(amyloidproteinβ，Aβ)激活免疫炎症过程而间接造成神经退行性病变的假说获得了不少新的证据。AD患者脑内的Aβ类不溶性大分子以及胞外的NFTs,极易被吞噬细胞发现，因而作为慢性刺激物质而逐渐积累，并刺激炎症反应不断加强，造成AD的慢性炎症状况。

AD的许多促发因素如遗传、年龄、环境因素等均可诱发初始病变(如AD的SP及NFT)，这些病变即使引起某些神经元死亡，也是较为轻微的，因而病变进展缓慢；然而这些初始病变可激发炎症反应，后者发展至一定程度则导致更多神经元死亡，造成更多的病变，进而激发更严重的炎症反应，如此形成一个不断加强的自身毒性环路(autotoxicloop)。这个正反馈环路导致了临床所观察到的AD及其类似疾病在起始阶段进展较缓，到某个时期病情才急剧恶化。由此可见，慢性炎症可能是AD发病机制的必要因素。AD是一种由Aβ沉积，通过激活周围Mi产生细胞因子和神经系统免疫炎症应答，加速神经细胞死亡，而致记忆减退和认知障碍的疾病。而记忆与颞叶海马CA1区神经元活性有关，提示AD发病机制之一可能是Aβ等启动CA1区神经元细胞凋亡。

2神经元凋亡的诱导

细胞凋亡(PCD)是由细胞基因控制的一种主动死亡过程，特定基因由于种种原因编码自杀性蛋白而致DNA裂解。愈来愈多的证据表明，大多数动物细胞皆能自我致死，而且这种普遍性的自杀程序能由发自其他细胞的信号所激活或抑制。例如许多发育中的脊椎动物神经元的生存依赖于与其连接的靶细胞分泌的神经营养因子(NTF)，若NTF缺乏可致神经元发生PCD。细胞的PCD也受外源性因素的影响，但诱导PCD的内源性与外源性因素都必须通过特定基因而发挥作用。

2.1淀粉样蛋白与神经毒越来越多的证据表明，Aβ是各种原因诱发AD的共同通路，是AD形成和发展的关键因素［5］。分子克隆研究证明，Aβ来自一分子量更大的β-淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein,APP)。目前多数学者认为，Aβ在大脑皮层内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件，超前于其他脑区损伤和临床症状数年［6］。在发生顺序上，Aβ的出现早于神经纤维缠结、轴索缺乏营养等病理变化以及临床症状。最为直接的证据是Aβ在一定条件下能表现出神经毒性。90年代初，Yankner等首先观察到较高浓度的Aβ能引起神经元退化和死亡，并证实引起毒性的必需结构是其25～35位的氨基酸序列(Aβ25～35)。最近发现，Aβ的神经毒性包括两个方面［7］，一是增强或放大各种伤害性刺激如低糖、兴奋毒素、自由基等的细胞损伤效应，一是直接的细胞毒性。实验发现，多数细胞与Aβ接触后就能表现出细胞肿胀、染色质浓缩、核内DNA断裂等细胞凋亡典型的形态和生化特征［8］，仅在少数细胞内或与兴奋毒素共存时才表现出神经元肿胀、膜溶解、乳酸脱氢酶释放等坏死(necrosis)的特征［9］。Aβ的神经毒性涉及到复杂的分子机制，主要包括促进自由基的形成、破坏细胞内的Ca2+稳态［7］，降低K+通道的功能［10］，增强致炎细胞因子(cytokine)引起的炎症反应［11］。由于多种因素相互影响给研究带来了相当大的难度。

2.2炎性细胞因子和神经毒

2.2.1白细胞介素6(IL-6)：在中枢神经系统(CNS)，IL-6主要由Mi和星形胶质细胞(astrocyte,As)产生，其受体也广泛存在于丘脑、海马、皮层等脑区的神经元膜上。IL-6的神经元毒性作用主要在转基因小鼠脑内得到证实。Campbell［12］报道，IL-6转基因小鼠具有严重的神经疾病症状，表现为瘦小、行为异常、震颤、共济失调和癫痫。神经病理特征为，海马与小脑出现明显的神经元退化，尤其是海马CA1区域树突萎缩，树突空泡化和树突数目减少，并且伴随着高表达的IL-6mRNA和高水平的IL-6。这些结果表明，脑内IL-6水平的升高是导致转基因小鼠神经元退化的主要原因。此外IL-6转基因小鼠研究还发现，隔一海马胆碱能通路的功能受到严重损害［13］，由于隔一海马通路参与记忆印迹的形成，因此脑内高水平的IL-6有可能影响学习与记忆功能。

有关IL-6与Aβ或APP关系的研究已有报道［14］。在原代培养的大鼠皮层神经元实验中，IL-6200ng/mL与神经元接触6h之后，APPmRNA的表达增加了大约一倍。由于IL-6与APP或Aβ共存于AD的SP内，提示IL-6对APP的表达具有直接调控作用，可以促进APP产生，进而导致Aβ沉积，诱发AD。α2-M是已知最强的蛋白酶抑制剂，与IL-6共存于AD皮层与海马SP内。曾有报道［15］，在培养的人神经元细胞株内，α2-M可抑制APP的正常分泌，导致Aβ形成增加。在人SH-SY5Y神经元细胞培养实验中，α2-M的基础合成很低，但用IL-6刺激后其合成被强烈诱导，α2-M水平大约增加了20倍［16］。这些结果提示，IL-6与α2-M在AD脑内的共存具有功能性联系，IL-6可能通过诱导α2-M合成，进而抑制APP的正常酶解，导致Aβ生成与沉积异常增加，从而诱发AD病理发生。

2.2.2肿瘤坏死因子-α(TNF-α)：LPS可刺激Mi产生TNF-α，As也可能产生少量TNF-α。在人胚胎原代神经元培养中发现，TNF-α有增强N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体介导的神经毒性作用［17］，且对人神经元细胞HN33.1有细胞毒作用。大鼠神经细胞培养中，TNF-α通过作用于As间接发挥了细胞毒性而引起神经元的损伤。直接将TNF-α注射到小鼠小脑，可引起普遍性损伤。TNF-α可引起牛及啮齿类动物的Mi通过PCD机制发挥细胞毒作用。但这一作用在人类尚没有被发现。

2.2.3转化生长因子-β(TGF-β)：TGF-β是具有多功能作用的细胞因子，它可由多种细胞产生，在胚胎发生期的神经细胞发育过程及免疫炎症反应过程中，TGF-β都具有重要作用。大鼠新皮层神经细胞培养中，TGF-β可减少由细胞毒物、缺氧、缺血或谷氨酸引起的细胞损伤，而起到了神经保护作用［18］。使用人类胚胎皮层细胞培养，也发现了TGF-β可减轻由Aβ引起的神经细胞损伤。TGF-β对神经细胞的这些保护机制目前并不清楚。相反的结果也发现，TGF-β可能具有细胞损伤作用。由于其抑制了星形细胞谷氨酰胺合成酶的活性而增加了外源性谷氨酸造成的神经细胞损伤。也有报道TGF-β伴随Fos-Iacz的表达而参与细胞凋亡过程。

2.3一氧化氮(NO)与神经毒在人的中枢神经系统，As是产生NO的主要细胞，IL-1β是一个关键性因子，可直接刺激人As产生NO［19］。TNF-α及IFN-γ可加强IL-1β的作用。实验也证明这些白细胞介素处理过的As能产生足够量的NO，而造成神经细胞损伤［19］。Mi产生的NO具有细胞毒性作用，它可能参与神经损伤及神经退行性疾病的病理过程。NO合酶抑制剂或能抑制Mi活性的物质均可减轻Mi介导的神经元损伤。此外，能释放NO的硝普钠(sodiumnitroprusside,SNP)能直接杀伤培养中的人类胚胎皮层神经元。炎症条件下，脑内的胶质细胞可以表达诱生型一氧化氮合酶(inducibleNOS,iNOS)，产生大量NO，导致神经元坏死或凋亡。一般情况下，持续与低水平的NO或过氧亚硝酸盐接触引起神经元凋亡，而短暂与高水平的NO或过氧亚硝酸盐接触则引起神经元坏死。

此外目前的研究结果也证实，前列腺素E2(PGE2)直接与海马神经元接触引起了神经元凋亡性死亡［20］。一些神经递质如多巴胺(DA)，谷氨酸盐(glutamate,Glu)等可使某些神经元细胞凋亡。Glu是Mi激活后产生的一类神经毒物质，它是一种兴奋性氨基酸(EAA)。目前认为，神经细胞的缺血缺氧、退行性病变、变性、炎性损伤等都可能与EAA的神经毒性有关。Yamada和Hatanaka报道［21］，在20d胎大鼠海马神经元培养中，Glu与神经元接触15min，可引起海马神经元显著退化。

3神经元凋亡的基因调控

PCD是受遗传基因调控的，在调控PCD的过程中常有新基因表达，合成新的蛋白。在调控的信号中有的是起正调节作用，也有的是起负调节作用。不同的细胞由不同的基因诱导PCD。这些基因有：ced-3/ced-4、nedd2、TRPM-2、Fas(Apo-1)、c-fos、c-jun、c-myc、野生型p53等。抑制PCD的基因有：ced-9、bcl-2、突变型p53等［22］。此外，IL-1β转化酶家族是一些新发现的细胞“死亡蛋白”，与ced3、nedd2具有高度同源性，在炎症因子诱导的神经元PCD中起重要作用。

IL-1β转化酶(IL-1beta-convertingenzyme,ICE)是存在于许多哺乳动物细胞内的一种蛋白酶，是近年来研究较多的“死亡蛋白”之一。人类ICE最初是在单核细胞中发现的一种半胱氨酸蛋白酶，可使非活性的前体IL-1β(相对分子质量为33000)在116位天冬氨酸和117位丙氨酸之间酶解为具有活性的相对分子质量为17000的IL-1β细胞因子。ICE与线虫细胞死亡基因ced-3有高度同源性［23］。Kumar等先克隆出鼠nedd-2基因，长3.7kb,其基因编码的蛋白可促进鼠细胞的凋亡，LinWang以nedd-2为模板通过PCR扩增制备探针从人胎脑cDNA文库筛选出人nedd-2基因，其编码的氨基酸序列和ICE/ced-3顺序同源。转染小鼠ICE基因或ced-3基因，使其过度表达均可引起小鼠纤维母细胞出现凋亡。另外，在发生凋亡的细胞中可见成熟的IL-1β分泌增多。这一结果提示，ICE/ced-3基因可能是决定细胞死亡基因之一［24］。目前认为ICE在由Fas、TNF及一些炎症因子等诱导的细胞凋亡中起重要作用。ICE是Fas、TNF及炎症因子介导的主要通路，其研究的重要性可想而知。AD患者神经细胞退行性改变有ICE参与。由于细胞死亡基因ced-3与nedd-2和ICE为同种物质，是引起细胞凋亡的重要酶，多种因素均可激活该基因，ICE产生可在细胞内产生一种细胞死亡蛋白，而ced-3、nedd-2和ICE为同种物质，是引起细胞凋亡的重要酶，多种因素均可激活该基因，ICE产生的IL-1β对神经细胞起直接或间接毒性作用，导致神经元凋亡。证明ICE表达促进神经细胞凋亡，而对ICE表达的调节，寻找一些抑制ICE活性的药物，对一些凋亡过多的疾病如AD及Parkinson病有重要的治疗潜力。

4抗炎药物抑制神经元凋亡的可能性

20世纪的神经科学已获飞速发展，但造成神经元死亡的原因尚未明了，以致许多全球性致死性神经疾病一直缺乏有效的防治手段。AD发病的炎症学说启发人们用抗炎药物减缓或阻止AD发病。它不同于近10多年惯用的两种治疗方法，即基于胆碱学说的各种AchE抑制剂如他克林(tacrine)、新斯的明等和以吡烷酮醋胺为代表的促智药(nootropicdrugs)，被用来试图改善大脑皮层的代谢能力，进而减轻痴呆程度［25］。上述治疗方法并不能减缓皮层神经元的急剧损毁，因而无消除病变的根本原因。人们转而思索用抗炎疗法来抑制神经元死亡。这个设想已被临床试验所证实，有人在用非甾体类抗炎药物(NSAID)吲哚美辛(indomethacin,IM)治疗AD的一项有安慰剂对照的双盲试验中发现，接受100～150mg/kgIM治疗的患者，其认知功能的改善明显优于安慰剂对照组［26,27］，然而尚需要更大规模的临床试验及进一步研究，以筛选出选择性调节免疫炎症反应和抑制神经元死亡的新药。

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第2篇：细胞凋亡范文

自从1972年病理学家Kerr首先对细胞凋亡进行描述以来，经过20余年的研究， 人们认识到细胞凋亡在组织的自动平衡中起着重要作用。细胞凋亡是通过正常的方 式在多细胞生物中消除不需要的、衰老的和受损的细胞，使机体细胞有丝分裂的速 度与凋亡的速度相平衡。任何情况的异常凋亡对机体都是有害的，都会产生不良后 果，肝脏也不例外。目前人们认识到异常凋亡在肝病的发生、发展起着重要作用: 一方面，肝细胞过度凋亡可以导致严重的肝脏损伤;另一方面，诱导凋亡机制的丧 失可以导致肝癌的发生。因此，对肝病患者需抑制肝细胞的凋亡，对肝癌患者需选 择性的诱导肝细胞的凋亡。 1细胞凋亡的定义和检测方法 1.1定义细胞凋亡是一个主动过程，是机体在生理或病理条件下受到刺激后 ，导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起的程序性细胞死亡（program medcelldeath，PCD）。细胞凋亡的特点:（1）细胞变小，核固缩，细胞膜完整 。（2）核碎裂，DNA断裂成180～200bp，而且有蛋白质和mRNA的合成。（3）膜包 绕的凋亡小体形成（在肝细胞称为Councilman小体）。（4）凋亡小体被邻近巨噬 细胞吞噬，这整个过程进展非常快，由数分钟到几个小时［1］。（5）一般周 围无炎症反应，但如果凋亡速度大于清除速度，则组织结构被破坏 而且伴随炎症反应［2］。与凋亡不同，坏死是一个被动过程，坏死细胞变大， 核溶解，膜通透性改变，线粒体结构变化，DNA随机断裂，其间没有蛋白质和mRNA 的合成，坏死周围有炎症反应。 1.2检查方法（1）对细胞凋亡形态学的观察有HE染色光镜观察以及电子显微 镜、相差显微镜、共聚焦激光扫描显微镜检查。（2）对DNA降解片段的分析有琼脂 糖凝胶电泳检测DNA以及SouthernBlotting方法。（3）荧光标记膜蛋白V的检测 ［3］。（4）流式细胞技术（FCM）可以对活体或已固定的凋亡细胞进行定量分 析。（5）末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术（TUNEL） 。（6）免疫组化。 2凋亡机制 细胞凋亡的生化特点包括质膜磷脂排列方向改变、细胞内离子环境自稳改变、 蛋白酶和核酸内切酶激活分别致细胞蛋白质裂解和DNA断裂、细胞内产生神经酰胺 （ceˉramide）、线粒体功能障碍、谷胱甘肽耗竭以及转谷氨酰胺酶（transglut aminase）激活［1，4］。 参与引发细胞凋亡的蛋白酶有多种，包括半胱氨酰天门冬氨酸特异蛋白酶（C ASPSE，cysteingylaspartasespecificproˉtease）家族成员和组织蛋白酶等 ［5］。特别是caspase家族成员与细胞凋亡关系最为密切，至少有14种哺乳动物 caspase已获克隆，但仅对caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在细 胞凋亡中发挥启动作用;caspase-3在细胞凋亡中发挥效应作用［6］。由于各c aspase可相互激活，所以caspase蛋白酶级联反应（caspaseproteasecascade） 是导致细胞凋亡结构改变的主要环节。线粒体功能障碍在细胞凋亡发生机制中起关 键作用［6］，能促进线粒体功能障碍的因素很多，包括各种有害刺激和信号传 递过程，其中某些配体/受体相互作用最为重要。配体与靶细胞表面受体相结合， 就导致复杂的多蛋白复合物（multiproteincomplex）形成，即将凋亡信号传递给 效应蛋白酶FLICE（Fas-associatedproˉteinlikeinterleukin-1βconvertin genzyme，Fas相关性蛋白样白细胞介素1β转化酶），FLICE与caspase-8相互反应 可激活caspase-8，caspase-8激活后就通过某些不明的机制引发线粒体功能障碍。 线粒体功能障碍导致细胞色素C释放，细胞色素C与凋亡激活因子-2（apoptosisa ctivatingfactor-2，Apaf-2）相结合，使caspase-3激活［7］。caspase-3又 激活DNA断裂因子（DNAfragmentationfactor），导致静息状态的核酸内切酶激 活，最终引起DNA断裂。从线粒体功能障碍到DNA断裂，是细胞凋亡生化途径的共同 途径。 在肝细胞凋亡发生机制中，以Fas配体/Fas受体引发凋亡信号级联反应研究得 最多。此外，转化生长因子β1（TGF-β1）及其受体（TGF-β1R）［8］、肿瘤 坏死因子（TNF）及其受体（TNFR）［9］在肝细胞凋亡发生机制中均起重要作 用。细胞毒性T细胞（CTL）释放的穿孔素（perforin）和颗粒酶B也是介导肝细胞 凋亡的重要因素。 DNA断裂分两型。首先发生的DNA断裂片段较大，为300kbp或500kbp的倍数，此 型DNA断裂在细胞凋亡中发生频繁，但并非都有。继之DNA在核小体（nucleosome） 间断裂成许多100～200bp的小片断，或呈100～200bp的倍数出现，称为DNA断裂梯 状模式（ladderpattern）［10］。两型DNA断裂是由不同的核酸内切酶切割而 形成的。也有人认为这两型DNA断裂可能单纯代表一种动力学现象，即必须先有足 够大的DNA片段形成，方可发生小分子DNA断裂，用凝胶电泳技术、原位细胞化学技 术或原位组织化学技术检测DNA断裂，是确定细胞凋亡的常用 方法。 细胞凋亡的主要调节因子是B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-celllymphoma/l eukemia-2protein，Bcl-2）家族的成员［11，12］。Bcl-2，通过抑制凋亡以 延长细胞存活时间，是哺乳类动物细胞凋亡的一种强大抑制因子。与Bcl-2关系密 切的同源物是Bcl-x，有两个RNA拼接变种，长Bcl-X（Bcl-XL）是较大的拼接变种 ，短Bcl-X（Bcl-XS）是短拼接变种。此外还发现一些其它的Bcl-2同源物。Bcl-2 蛋白家族细胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Bcl-XS、Mcl-1、Bfl-1、 Brag-1、Al;细胞凋亡促进因子有:Bax、Bak、Bag、Bid、Bad、Hrk、Bik。 细胞凋亡促进因子和细胞凋亡抑制因子的相对优势决定着细胞对致凋亡刺激的 反应性。Bcl-2及其同源物主要定位于细胞膜，包括内质网膜、核外膜和线粒体外 膜。当细胞接受凋亡刺激时，Bcl-2可能通过防止线粒体功能障碍或阻断线粒体细 胞色素C、Apaf-2释放而抑制细胞凋亡。Bcl-XL似乎在不表达Bcl-2的肝细胞承担这 一功能。Bcl-2家族成员的表达在肝脏病和胆管细胞癌的发生中可能起重要作用， 并参与调控肝再生反应。

3肝脏疾病中的凋亡现象 近年来研究表明肝细胞的死亡方式包括坏死和凋亡两种。凋亡在肝脏疾病发展 过程中的重要作用得到了人们的重视，现将有代表性的几种肝脏疾病中的凋亡现象 分述如下。

3.1病毒性肝炎Fas系统介导的细胞凋亡在肝炎发生发展过程中起着重要作 用，在不同条件下，穿孔素、颗粒酶、TNF-α、TGF-β等也参与了肝细胞的凋亡 ［13，14］。1998年Galle等［15］报道乙型肝炎时肝细胞Fas表达增强，致 敏的细胞毒性T细胞（CTL）表达Fas配基（FasL），CTL经过免疫途径介导肝细胞凋 亡，参与病毒的清理和肝炎的病理生理过程。若该反应过强，则可能诱发暴发性肝 功能衰竭。这已经得到大家的公认。 3.2肝纤维化肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，有研究表明各种类型的 肝纤维化中都存在凋亡。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生的中心环节。 1998年Gong等报道HSC向肌成纤维细胞（MFB）的转变与sFasL介导的凋亡增强相平 行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表达高于晚期HSC和MFB，Bax则相反。这说明调 节HSC的凋亡易感性在肝纤维化发生机制中起重要作用。故认为促进HSC的凋亡有可 能成为抗纤维化的措施之一。 3.3肝硬变凋亡现象在肝硬变病例的肝细胞、胆管细胞、单核细胞中普遍存

在。1999年Frommel等［16］对照研究了正常肝组织、丙型肝炎和肝硬变标本，

发现对Bcl-2的表达逐渐增强，肝硬变患者中表达最强，提出了一种解释肝硬变患

者中肝癌高发生率的新机制。

3.4肝癌肝细胞癌形成过程中，不仅癌细胞异常增生，而且突变的细胞凋亡

减少，肝癌细胞对凋亡诱导反应明显缺陷［17］，1998年Jodo等报道肝癌血清

中sFas水平升高，切除肿瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌剂如:硒、类维生素A、

化疗药物等可促进鼠肝的潜在恶性细胞的凋亡，从而降低肝癌的发病率，这从一个

侧面反映了凋亡在肝癌发病机制中的地位。1997年CrasL等报道在非基因毒性致癌

物nafenopin所致的原发性肝癌中，正常肝细胞和肝肿瘤细胞都会受到抑制。当na

fenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋

亡率都高于前者。因此，采取促进肝癌细胞凋亡的措施，将有可能成为未来治疗肝

癌的有效手段之一。

3.5酒精性肝病凋亡可发生在临床和实验性的酒精性肝病中，酒精诱导肝细

胞出现凋亡的机制有:（1）表达细胞色素P4502E1的HepG2细胞暴露于花生

四烯酸导致了脂质过氧化和凋亡增加;（2）肝铁水平的升高也促进了脂质过氧化和

肝细胞凋亡发生;（3）酒精性肝病中TNF及其受体的水平都升高，二者结合导致凋

亡增加;（4）肝细胞CD95L的水平升高与肝组织中的CD95结合诱导凋亡;（5）CTL细

胞也通过CD95与CD95L的结合促进凋亡的发生。

3.6自身免疫性肝病细胞凋亡对于清除潜在的自身反应性淋巴细胞以及免疫

应答后剩余的效应细胞或突变细胞具有重要意义。若该机制发生障碍，则可能导

致自身免疫性疾病的发生。自身免疫性肝病中具有代表性的是原发性胆汁性肝硬变

（PBC），它是一种免疫介导的肝内小胆管进行性损害为特征的自身免疫病。1997

年Harada等报道［18］PBC受损胆管上皮细胞高表达CD95L，CD95/CD95L途径的

凋亡导致了胆管上皮细胞的破坏。

总之，细胞凋亡在某些肝脏疾病的发生、发展、转归中可能起着重要的作用，

其具体机制有待进一步研究证实。

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第3篇：细胞凋亡范文

【关键词】骨关节炎；软骨细胞；细胞凋亡；综述

Abstract：CartilageapoptosisfunctionsalotinOAoccurrence.ItsapoptosishastwowaysofNOandFas,mainlycontrolledbyBcl2genefamily,Bax,P53,ICEandcmycgenefamily;thedegenerationofcartilagecellbasecaninduceapoptosis.ItshowscartilageapoptosisfunctioninOAoccurrence,helpfultopreventionandtreatmentofOA.

Keywords：OA;cartilagecell;apoptosis;review

骨性关节炎（osteoarthritis,OA）是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为主要病理特征的慢性骨关节疾病,临床上以缓慢性关节疼痛、僵硬、肿大伴关节功能障碍为主要表现。细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制并依赖ATP供能的细胞自主性死亡方式。随着细胞分子生物学的发展，国内外许多学者研究发现软骨细胞凋亡在OA的发生发展中起到关键作用［12］。本文就近年来骨关节炎关节软骨细胞凋亡的研究综述如下。

1软骨细胞凋亡的分布及比例

细胞凋亡即程序性细胞死亡，于1972年首次被Kerr描述，通常认为导致细胞凋亡的程序在机体内、外因素作用下被启动，导致细胞凋亡的发生。研究表明多种因素可引起关节软骨细胞的凋亡，关节软骨细胞凋亡参与了骨关节炎的发病［3］。Kim等［4］应用TUNEL法分析，结果显示OA组软骨细胞凋亡明显高于正常组，细胞凋亡在OA病变区高于非病变区。而对关节软骨细胞凋亡进行观察，发现OA关节软骨细胞凋亡位于软骨表层和中层，而正常关节软骨细胞也可出现凋亡，但检出率低，且主要位于表层［5］。OA软骨的表面有许多类似溶酶体和基质小泡样空的腔隙，是软骨细胞破碎及细胞核固缩所致。Pellettier和Herard的研究也表明，大部分凋亡软骨细胞位于OA软骨受损区的浅表层和中层［67］。此外，对连续切片观察发现关节软骨细胞凋亡表现为病灶性。Blanco等［8］研究也表明软骨细胞凋亡主要位于浅层和中层，但发现细胞凋亡并不是在所有的软骨细胞中同时发生，且发生率并不是很高，这和OA软骨退化是一个缓慢的过程相符合。软骨细胞凋亡的比例各家报道不太一样。Hashimoto用流式细胞仪检测到OA软骨细胞22.3%发生凋亡，而正常软骨细胞为4.8%［5］。胡建华等［9］发现OA病人软骨细胞凋亡发生率为4%～14%，而正常对照组则为0%～2%。Heraud等［6］发现，OA软骨细胞中有18%～21%软骨细胞表现出凋亡特征，而正常关节软骨中只有2%～5%凋亡细胞。在家兔膝关节OA模型中同样发现软骨细胞凋亡增加，OA侧关节软骨有28.7%的软骨细胞凋亡，而非OA侧正常软骨只有6.7%软骨细胞凋亡［10］。

2软骨细胞凋亡的途径

2.1NO途径Pelletier等给予实验性骨性关节炎狗服用N-亚氨基L赖氨酸（LNIL，一氧化氮合酶抑制剂），发现服用LNIL组骨关节炎的病理表现明显低于对照组。LNIL显著降低IL1β及基质金属蛋白酶（MMP）水平，降低Caspase3的活性，减少软骨细胞的凋亡数量［6］。由于NO可诱导软骨细胞的凋亡，故应用NO供体硝普钠（SNP）诱导建立软骨细胞凋亡模型已成为一种常用的实验手段。有研究发现前列腺素E2（PGE2）是一种软骨细胞生长抑制剂,如将其加入培养的牛关节软骨中，可诱发软骨细胞的凋亡。然而PGE2并不诱生NO，其生成也不需要NO的诱生,而硝酸钠可诱生高水平的PGE2，L单甲基精氨酸可减少PGE2的水平，提示PGE2可能为NO诱发软骨细胞凋亡级联反应中的下一激活物［11］。

2.2Fas途径Kim对比正常人及OA患者的关节软骨，发现正常人的软骨几乎看不到凋亡细胞，而在OA患者中，受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区，Fas表达的结果与其相符。Fas及FasL在细胞表面的表达受细胞密度的影响，低密度区细胞（细胞处于未融合状态）Fas及FasL的表达，要高于高密度区细胞（细胞处于融合状态），但后者被主动性抗体诱导而凋亡的软骨细胞数目却是前者的15倍［12］，提示在低密度培养时，保护性的抗凋亡机制被激活，使得软骨细胞对Fas途径介导的凋亡敏感性下降，但其具体机制尚不清楚。

3关节软骨细胞凋亡相关癌基因表达

3.1Bcl2基因家族Erlacher等［13］在转录和蛋白水平研究OA患者及健康成人关节软骨中Bcl2的表达发现，OA患者Bcl2mRNA表达水平较高，邻近软骨缺损区的软骨细胞高表达Bcl2蛋白。这反映了机体对凋亡的调控，通过上调Bcl2表达保护软骨细胞免遭凋亡。Kim等也发现，OA患者Bcl2在软骨受损区表达增加，而Bcl2在正常软骨中有更高程度的表达。Bax为编码Bcl2相关蛋白X的基因,它具有诱导细胞凋亡的功能。同其他细胞一样,软骨细胞的存活依赖于癌基因之间的平衡,如Bax过量,形成Bax二聚体,细胞即趋于凋亡。Bax在正常软骨、OA软骨受损区与未受损区中表达并无差异，提示软骨细胞的凋亡主要通过Bcl2调控。

3.2P53基因Okazaki等［14］发现p53mRNA水平、凋亡细胞数量在兔膝OA组中明显高于正常组，从而提示p53在关节软骨细胞凋亡中发挥了重要作用。野生型p53基因可促进NO诱导的软骨细胞的凋亡，其机制可能在于p53基因表达产物的聚集使Bax的表达增加，进而释放细胞色素C并激活Caspase，导致细胞发生凋亡［15］。

3.3cmyc基因Yatsugi等［18］对正常人关节软骨与OA关节软骨细胞比较发现，OA关节软骨细胞凋亡的程度与软骨退变的程度呈正相关，且cmyc参与了软骨细胞凋亡的全过程。cmyc引起细胞凋亡的机理可能是由于正常细胞周期不平衡，在细胞生长受到抑制的情况下，cmyc不成比例的表达导致细胞凋亡。

4软骨细胞凋亡与基质崩解的关系

细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）各成分平衡是维持各层软骨细胞活性的重要条件，凋亡与基质崩解密切相关。连续切片显示，OA患者关节软骨富含凋亡细胞的区域伴有大量蛋白多糖降解，表层软骨细胞凋亡最多，且基质降解最严重［19］。Ⅱ型胶原缺陷的转基因小鼠内可见关节软骨细胞大量凋亡，推测Ⅱ型胶原缺乏的软骨细胞间基质不能供养软骨细胞，而促进其凋亡。Gibson等认为肥大细胞表型X型胶原的表达是引起软骨细胞凋亡的原因。而骨关节炎时X型胶原的表达增加。这可能是软骨细胞凋亡增加的发病机制之一。

在骨性关节炎中，软骨细胞外基质的降解,可使细胞生存环境及生存信号丧失而导致软骨细胞凋亡，而细胞结构的破坏可使基质合成减少，增殖细胞随之发生的凋亡，也限制了基质的修复。ECM的降解产物亦可影响凋亡，蛋白多糖聚合物的降解产物之一G1结构域由于与透明质酸的结合不易进入循环系统，易在滑液中及软骨中积累,通过降低细胞间粘附诱导软骨细胞凋亡［20］。另外，一些物质具有诱发凋亡和激活基质降解的双重作用，如IL1既可诱导前列腺素、NO的合成，又可抑制、X胶原、蛋白多糖的合成。

5总结

近年来从分子水平乃至基因水平研究显示,骨关节炎关节软骨降解的发生除因软骨基质降解和（或）基质合成受到抑制外,软骨细胞凋亡异常也是一个重要原因。随着对软骨细胞凋亡研究的深入,发现细胞凋亡和骨关节炎的发生发展较为密切，其发生机制以及各种因素之间相互作用的关系仍不十分清楚，所以对这些问题的进一步探讨将会对OA的发病机制更加明确，同时为临床治疗OA提供了新的理论依据。

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第4篇：细胞凋亡范文

    Role of DR5 in TRAIL induced apoptosis of Jurkat cells

【Abstract】 AIM: To study the role of DR5 in TRAIL apoptotic signal transduction in Jurkat cells. METHODS:  cDNA containing fulllength extracellular domain of human DR5 was cloned into pGAPZα. Recombinant Pichia pastoris clone generated via homologous recombination secreted high levels of sDR5. BALB/c mice were immunized with sDR5 in CFA to prepare antiDR5 mAb. The binding of antiDR5 mAb was measured for surface expression of TRAIL receptor by flow cytometric analysis. Jurkat cells were tested for their susceptibility to apoptosis induced by TRAIL with TRAIL apoptosis kit so as to study the correlation between DR5 expression level and TRAIL sensitivity. The level of DR5 expression on Jurkat cell line was examined by flow cytometry. The rates of TRAILinduced apoptosis and antiDR5 mAb blocking on Jurkat cells were tested by flow cytometry with TRAIL apoptosis kit. RESULTS:  The killing role of TRAIL was blocked in Jurkat cells pretreated with antiDR5 mAb. The average percentage of blocking was 90.49%. CONCLUSION:  AntiDR5 mAb can specifically bind to DR5 and DR5 is expressed at high levels on Jurkat cells. DR5 plays a very key role in TRAIL induced apoptosis in Jurkat cells. DR5 expression is important for the induction of apoptosis by TRAIL.

【Keywords】  Jurkat cells; TRAIL; apoptosis; DR5;   antibodies, monoclonal

【摘要】 目的： 探讨DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中的作用. 方法： 用含人全长DR5细胞外全长结构域重组DR5免疫BALB/c小鼠，制备抗DR5 mAb. 将96孔U型细胞培养板加1×105/孔Jurkat细胞和5 mg/L抗DR5 mAb，采用TRAIL试剂盒检测细胞凋亡率. 结果： 抗DR5 mAb与Jurkat细胞表面的DR5作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎被抗DR5 mAb完全阻断，阻断率高达90.49%. 结论： DR5在TRAL诱导的Jurkat细胞凋亡中起关键作用.

【关键词】 Jurkat细胞；TRAIL；细胞凋亡；DR5；抗体，单克隆

0引言

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL）是近几年新发现的TNF 超家族成员，TRAIL与其受体结合可以诱导大多数肿瘤细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响. 已经发现，TRAIL有5种受体，即2种死亡受体（DR4, DR5）、2种诱骗受体（DcR1, DcR2）及可溶性受体OPG(osteoprotegerin). 其中只有DR4［1］和或DR5有胞内死亡结构域，诱导细胞凋亡. DR4和DR5在诱导细胞凋亡方面具有相同的作用，但哪一种受体在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡方面更为重要仍不清楚. 发展和应用TRAIL 不同受体的特异性抗体是分析这两种不同受体所参与的死亡途径的关键. 我们用特异性抗DR5 mAb阻断DR5的功能，并应用流式细胞仪检测TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡情况，以探讨DR5在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡中的作用.

1材料和方法

1.1材料

含有人DR5细胞外结构域全长cDNA的毕赤酵母表达载体菌株由美国宾夕法尼亚大学医学院病理医学实验室陈有海教授馈赠. Jurkat细胞为本室保存细胞株传代培养于含2.0 mmol/L L谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠、10.0 mmol/L HEPES, 1.0 mmol/L丙酮酸钠、100.0 mL/L FBS, 1×105 U/L 青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基. DMEM/HAT和DMEM/HT选择培养基（Sigma公司）. TRAIL凋亡检测试剂盒（Upstate biotech）. FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）.

1.2方法

1.2.1抗DR5 mAb制备及特异性鉴定

1.2.1.1抗DR5 mAb制备参照文献［2］制备抗DR5 mAb. 抗DR5 mAb类型经ELISA法测定mAb的类型分别为IgG1(YM 366, YM 369)和IgM (YM 362, YM 363, YM 367 )，两者均可与sDR5结合，经流式细胞仪分析发现仅IgG能与Jurkat 细胞表面的DR5结合.

 

第5篇：细胞凋亡范文

论文摘要：就近年来中药抑制细胞调亡的文献进行整理，从中药调控细胞凋亡途径、影响凋亡信号传导、调控凋亡相关基因表达、调控细胞因子4个方面进行系统综述。认为中药在抑制细胞凋亡方面有较好的作用。

细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞生理性死亡的形式，是多细胞有机体为保持身体组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞自动性死亡过程，在机体的生长发育、衰老、免疫调节、内环境稳定以及肿瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理过程中均有重要意义。机体通过凋亡过程来清除体内不需要或有害细胞，或通过抗凋亡过程维持细胞功能。抑制凋亡在维护生命个体的稳定、抗衰老等过程中有很重要的作用。近年来有关中药抑制细胞凋亡的研究日渐增多，研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中医药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节，进而抑制细胞凋亡，维持机体内平衡，阻止组织病理过程的恶化。

1通过调控细胞凋亡途径抑制凋亡

机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径，其中内源性的线粒体细胞色素C途径和外源性的死亡受体途径所介导细胞凋亡是目前研究较多的途径。

1．1通过调控线粒体细胞色素C途径抑制凋亡许多研究结果均表明，线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用，是最重要的途径之一，其通过Cyt－C途径诱导细胞凋亡。在细胞凋亡信号的刺激下，会使caspases激活，胞质Ca2+水平升高，产生ceramide，诸如此类的改变会直接或间接地引发线粒体通透性转变孔道(PTP)开放，使能量产生中断，线粒体内膜跨膜电位(ψm)的下降，并导致外膜破裂，释放出Cyt－C等各种活性蛋白，Cyt－C从线粒体内释放是关键的一步。胞浆内的Cyt－C在dA7P存在下，与凋亡蛋白酶活化因子－1(Apaf－1)结合，诱导caspase－9前体的寡聚化，并形成凋亡体。凋亡体的形成可激活caspase－9，继而活化Caspase－3，启动Caspase的级联反应，引起细胞凋亡。

有研究以缺氧／缺糖再给氧为模型，观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。结果发现清开灵注射液能显著降低细胞内Ca2+浓度，抑制细胞凋亡，提高线粒体膜电位和活性，认为清开灵注射液可抑制缺氧一缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低、抑制神经细胞内钙超载与抑制细胞凋亡有关。

1．2通过调控死亡受体途径抑制凋亡凋亡还可以通过死亡受体通路介导，现知死亡受体途径主要包括Fas／FasL途径和TNFa／TNFR途径。死亡受体家族成员包括7NFRl、TNFR2、Fas／CD95、TRAlL－Rs等，当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后，将凋亡信号由胞外传人胞内，在连接分子的媒介下，激活Caspase，导致细胞凋亡。1．2．1通过调控Fas／FasL途径抑制凋亡中药可以通过调控Fas／FasL的表达，抑制受损细胞的凋亡。参附注射液对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧／复氧时凋亡相关基因Fas／FasL蛋白表达影响研究发现，结果缺氧4.5h及10.5h后，心肌细胞Fas／FasL蛋白的阳性表达指数(positiveexpressionindex，PEI)参附注射液组明显低于缺氧组；参附注射液可通过下调Fas／FasL蛋白表达，参附注射液组还见到caspase-3活性下降，提示参附注射液抑制乳鼠心肌细胞凋亡是通过Fas／FasL-caspase-3途径实现的。

1．2．2通过调控TNFa／TNFR途径抑制凋亡研究还发现中药通过调控7NFa／TNFR途径抑制细胞凋亡。枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达研究发现，枸杞多糖可以下调促凋亡的TNFRl基因mRNA表达并上调抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表达，降低老年大鼠T细胞的过度凋亡，从而改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态。

2通过影响凋亡信号传导抑制凋亡

细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下，激活多种信号偶联途径的信号转导过程。常见的凋亡信号传导途径有磷脂酰肌醇－3－激酶(P13K)／蛋白激酶B(PKB或称为AKT)途径，RAS－MAPK途径，NF－κB途径，N()途径等。2．1P13K／PKB途径P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，PKB是P13K的靶蛋白之一，P13K与PKB是促进凋亡作用的重要调节因子；其过量表达可抑制细胞的凋亡。黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠肾组织胰岛素信号分子表达的研究发现，认为黄芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物－1(IRS－1)、P13K水平，增加组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素信号转导有关。

2．2RAS－MAPK途径丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)参与细胞凋亡的信号转导过程。MAPKS级联反应包括MAPKKK，MAPKK与MAPK等3个顺序的活化过程。每一种激酶又由不同成分组成。MAPK包括ERK，jNK／SAPK，P38。有研究探讨肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(HSCsMAPK)通路中ERK、JNK的活化情况，以及丹参药物血清对磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P－ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P－JNK)表达，肝纤维化大鼠经丹参药物血清干预后较对照组均显著降低，正常大鼠经丹参药物血清干预后较正常大鼠对照组也均显著减少。表明活化的HSCs中ERK、JNK保持着较高的磷酸化水平，两者介导的信号转导通路是HSCs活化和增殖的重要途径之一；阻断MAPK信号通路可能是丹参治疗肝纤维化的重要作用途径之一。

2．3NF－κB途径在大多数细胞类型中，NF－κB在胞浆中与抑制亚单位lκB结合形成无活性的复合物。在TNF诱导的细胞凋亡过程中，可刺激lκB的磷酸化作用及降解作用。使NF－κB能从复合物中释放并活化，活化的NF-κB迅速转位进入胞核，继而作用于靶基因，诱导基因表达，编码前炎性蛋白，如IFN，细胞因子，生长因子，细胞黏附因子，红细胞生成素与MHC－I类分子等，抑制NOS的生成，并诱导编码凋亡抑制蛋白C－IAPl，C－IAP2基因表达，诱导抗凋亡基因Bcl－2，Bcl－x1的表达。探讨人参皂甙对心血管疾病的保健和防治机制的研究发现，结果显示内毒素脂多糖(LPS)促使HUVECNF－κB向细胞核内转移，人参皂甙则能阻止LPS诱导的NF－κB核内转移；能完全阻止LPS致内皮细胞核提取物NF－κBDNA结合活性；IJs能使HUVl3CPAl－1蛋白及mRNA表达显著增强，人参皂甙则使LPS的这种作用明显减弱。认为人参皂甙对心血管疾病的防治机制之一可能是通过NF－κB途径拮抗LPS致HUVECPAI－1的表达。

2．4NO途径NO对细胞的增殖与存活有双重效应。它可以通过多种机制诱导细胞的凋亡，但在一些特定环境中，NO又可在一些细胞类型中作为凋亡的潜在抑制剂。川芎嗪对多巴胺诱导PCI2细胞凋亡的保护作用的研究发现，认为川芎嗪可抑制DA引起的PCI2细胞凋亡，此作用可能与降低NO生成有关。NO的抗凋亡作用还与caspase水平有关。在死亡配体依赖与配体非依赖的凋亡中，NO均能抑制caspase的活性。黄芪、当归注射液可通过促进NO的生成、诱导caspase3表达促进体外培养的血管平滑肌细胞凋亡。同时还可通过上调bcl－2表达而抑制其阻止氧自由基破坏细胞结构，起抗细胞凋亡作用，通过抑制粘着斑激酶的表达，调节其对细胞增殖和凋亡的影响。已发现，NO在某些细胞类型的线粒体中起抗凋亡作用。如在鼠肝线粒体中，生理浓度的NO能可逆性的抑制PTP的开放，机制是通过膜的去极化与Ca2+的积聚作用。

2．5其他胞浆中游离的Ca2+作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用；细胞核内钙离子浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。细胞凋亡时最显著的变化是DNA的断裂，钙离子可直接激活核酸内切酶促进DNA断裂，也可通过激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶，导致染色质结构完整性的丧失。葛根素及由红参和麦冬有效成分制成的参麦注射液对脑缺血／再灌注中神经细胞均有一定的抑制作用。作用机制可能是阻断Ca2+内流和／或胞内钙库的释放。从抑制神经细胞内钙超载。

目前发现在某些细胞中，cAMP是引起细胞凋亡的信号。细胞内cAMP浓度的上升可激活cAMP依赖性蛋白激酶，使靶细胞上某些丝氨酸和苏氨酸磷酸化，从而影响这些蛋白的生物学功能，引起细胞凋亡。黄精多糖对正常小鼠血糖水平无明显影响；但可显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值；其机制可能是降低肾上腺素模型小鼠肝脏中cAMP的含量，通过抑制凋亡减轻高血糖肝脏的损害。

3通过调控凋亡相关基因表达抑制凋亡

Bcl－2基因家族是最重要的细胞凋亡调控基因。抗凋亡基因bcl－2和bcl－xL是Bcl－2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl－2家族中重要的促凋亡基因。另外，p53、c－myc、Fas、c－fos等基因均是参与调控细胞凋亡的重要基因。有研究用黄芪注射液进行治疗贫血小鼠，提示黄芪注射液可通过上调抗凋亡蛋白Bcl－XL表达减轻骨髓有核细胞的凋亡，并促进红系、巨核系造血。丹参对持续性非卧床式腹膜透析(CAPD)相关性腹膜硬化模型大鼠腹膜间皮细胞凋亡有抑制作用，其机理是下调Fas基因的蛋白表达，上调Bcl－2基因的蛋白表达。c－los是一种转录调节因子，正常情况下在脑内水平极低。c－fos不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能，导致细胞凋亡。有实验表明。c－fos可能诱导脑缺血一再灌流时海马CAl区细胞晚期促凋亡基因的表达，共同调控细胞凋亡，而中药有效成分葛根素可通过下调凋亡相关基因c－fos的表达，减少神经细胞的凋亡，从而具有保护神经的作用。

4通过调控细胞因子抑制凋亡

细胞因子(cytokine，CK)是机体细胞分泌调节细胞增殖、分化与死亡的一大类因子。与凋亡有关的细胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些细胞因子等。清热解毒方泻心汤可显著降低实验性AS大鼠血清MAD水平，增强SOD活性，降低OX2LDL及N()水平等，从而抑制血管细胞过度凋亡。细胞因子如TNF(Tumomecrotiefactor)具有多种生物学功能，TNF在体外可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡，其中TNF-α与凋亡的关系更为密切，能与TNF受体结合，引起细胞内贮存Ca释放，引起细胞内游离Ca2+浓度升高，从而激活Ca2+依赖性核酸内切酶，引起DN段断裂和细胞凋亡。此外，与凋亡有关的细胞因子还有IL-2、IFN-γ、TGFβ1，NK细胞、IL-3、IL-4、IL-6、LAF-1(白细胞黏附因子)、CAM-1(细胞内黏附分子)、GM-CSF(粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子)、NGF(神经生长因子)、SCF(干细胞因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)、核转录因子xu等。黄芪对脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤(AIJ)后大鼠肺组织细胞有保护作用，其机制是减少促炎因子TNF-α、IL-1β的释放，抑制肺泡上皮细胞凋亡。地黄饮子对阿尔茨海默病动物模型细胞凋亡抑制的机制，与上调核转录因子κB、hsp70mRNA的表达，抑制线粒体释放细胞色素C，控制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活有关。

第6篇：细胞凋亡范文

一、心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的实验依据

虽然目前有多项研究显示缺血再灌注可诱发心肌细胞凋亡，但是关于凋亡是由心肌缺血性损伤所诱发还是由再灌注损伤所诱发的问题仍然存在有争议。Kajstura 等[2]发现，在体大鼠心肌缺血2～3h 后即可出现凋亡细胞，缺血4.5h 后凋亡细胞的数量达到高峰，然后逐渐降低。采用在体大鼠心肌缺血再灌注模型发现，持续缺血 2.25h或缺血45min后再灌注1h均有凋亡细胞的产生，并且随着再灌注时间的延长，凋亡细胞的数目增加[3]。与上述研究结果不同，采用在体家兔心肌缺血再灌注模型发现，单纯缺血30min、4.5h 和缺血5min 再灌注4h 的心肌细胞均未出现凋亡现象，而缺血30min再灌注4h的心肌细胞则出现了凋亡，因此认为凋亡是心肌对缺血再灌注损伤的一个特殊反应[4]。Zhao等[5]采用犬冠状动脉完全性梗阻7h或梗阻1h后再灌注6h模型进行研究发现，尽管长时间缺血后可出现明显的心肌坏死，但是原位TUNEL 染色显示坏死区的凋亡细胞极少，而且缺乏特征性“DNA 梯状条纹”。相比之下，缺血1h 再灌注6h 则可诱发凋亡细胞数目明显增加和出现典型的特征性“DNA 梯状条纹”，而且凋亡细胞大多是出现在坏死心肌的周围区域，即缺血后血管再通的相关部位和梗死灶的收缩带区域。该研究结果提示，缺血再灌注后的心肌细胞凋亡主要是由再灌注过程诱发的。综合上述文献，目前认为长时间持续性缺血和再灌注均可诱发心肌细胞发生凋亡，尤其是再灌注后细胞内ATP 水平迅速恢复、胞浆和线粒体内钙超载以及自由基大量生成，更是加速了不可逆性细胞凋亡的发生[1]。

二、心肌缺血和再灌注过程中细胞凋亡及坏死的时程变化关系

在缺血后再灌注期间，心肌细胞的凋亡过程可分为几个阶段：①再灌注早期的起始阶段；②中性粒细胞浸润的中间阶段；③数天、数周或数月之后的延迟阶段，该阶段可能与心室重塑和心功能衰竭的发生有关[6]。

对于心肌缺血和再灌注过程中细胞凋亡及坏死的演变规律，目前同样存在着较大的争议。Kajstura等[2]采用在体大鼠心肌缺血模型研究发现，心肌缺血2h后，凋亡细胞和坏死细胞同时出现；随着缺血时间延长，在凋亡细胞增多的同时亦演变为坏死细胞。Zhao 等[7]采用犬心肌局部缺血1h 再灌注 6h、24h、48h 或72h 模型研究发现，心肌坏死的程度在再灌注24h时最为严重，此后一直保持着相对恒定的状态。相比之下，随着再灌注时间延长，凋亡细胞在坏死组织周围区进行性增多，至再灌注72h 时达到高峰。这提示细胞坏死和细胞凋亡在再灌注期间可同时发生，并且在再灌注早期坏死的发生率相对较高，而在再灌注后期凋亡的发生率较高。

三、细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中的作用

由于再灌注期间凋亡细胞主要是出现在坏死心肌的周围区域，所以提示凋亡可能在缺血再灌注后心肌梗死范围的扩大中发挥着一定的作用[5]。为此，有人采用核酸内切酶抑制剂—金精三羧酸（ATA）分析了凋亡在缺血再灌注后心肌梗死中的作用[7]。结果显示，在犬冠状动脉梗阻1h 再灌注24h 模型上，再灌注开始时采用ATA处理可明显减少坏死组织周围区凋亡心肌细胞的数目，同时伴有特征性“DNA梯状条纹”的缺失。这种凋亡程度的降低主要是与Bcl-2 上调以及Bax 和细胞凋亡蛋白酶（Caspase-3）活性降低有关。更为重要的是，ATA 所致的心肌凋亡抑制可明显缩小心肌梗死的面积。采用小鼠心脏特异性细胞凋亡蛋白酶过度表达模型的研究发现，在缺血后心肌细胞凋亡加重的同时，亦出现了心肌梗死面积的扩大和心功能的恶化 [1]。这说明细胞凋亡和细胞坏死之间存在着一定的交叉和联系，因此抑制心肌细胞凋亡可能是临床上有效防治心肌缺血再灌注损伤的一条重要途径。

四、心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的信号转导通路

目前认为，各种促凋亡的损伤因素一般是通过激活死亡受体（death receptor， DR）依赖性信号转导通路和线粒体依赖性信号转导通路诱发细胞凋亡[8]。死亡受体被其相应的促凋亡配体激活后，可导致凋亡调控基因（主要是Bcl-2 家族）表达失衡和胞浆蛋白酶（即Caspase 家族）活化。而线粒体依赖性途径被激活后，可诱发线粒体释放细胞色素C（cyto C）和凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1），并与半胱天冬酶9 的前体形成复合物，激活下游的半胱天冬酶。半胱天冬酶是细胞凋亡过程的执行器，通过上述两条途径激发半胱天冬酶家族的级联反应是细胞发生凋亡的一个中心环节[9]。

（一）由死亡受体介导的细胞凋亡

肿瘤坏死因子（TNFα）、Fas配体（FasL）和TNF-相关性凋亡诱导配体（TRAIL）均可诱导细胞发生凋亡，因此被称为死亡因子（death factor）。介导它们诱导凋亡作用的受体被称之为死亡受体。位于细胞膜表面的死亡受体主要包括TNFR1（亦称为 p55 或CD120a）、Fas（亦称为CD95 或Apo1）、DR3、DR4 和DR5，它们的共同特征是胞内部分有一大约80 个氨基酸残基构成的死亡功能域（death domain，DD）。死亡因子可分别激活相应的受体，启动导致凋亡的信号转导通路。激活的死亡受体可与细胞内的多种亦具有死亡功能域的受体接头蛋白相结合。其中，激活的Fas 和DR3 可与Fas相关性死亡功能域（FADD）相结合，而激活的TNFR1和DR4可与TNFR相关性死亡功能域（TRADD）相结合。此外，通过TRADD 和FADD 之间的相互作用，来自 TNFR1的激活信号亦可与Fas 信号转导通路发生联系[10]。

死亡受体激活后，可通过一系列反应激活胞浆内的胱门蛋白酶。一般认为，胱门蛋白酶的活化是凋亡执行过程中的最后通路。胱门蛋白酶家族属于白介素-1β转化酶（ICE）类蛋白，因可在天冬氨酸残基之后将底物裂解，故目前被称之为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶。根据胱门蛋白酶在细胞凋亡中的作用及其N 端的长度，可将其分为启动子胱门蛋白酶（包括胱门蛋白酶-8、9 和10）和效应子胱门蛋白酶（包括胱门蛋白酶-3、6 和7，能被启动子胱门蛋白酶所激活）。在正常情况下，胱门蛋白酶是以无活性的酶原形式存在。在心肌缺血性损伤和再灌注损伤的刺激下， Fas-FADD 和TNFα-TRADD 可诱导启动子胱门蛋白酶-8 和10 的激活，然后酶解激活下游的效应子胱门蛋白酶-3、6和7而导致细胞凋亡。效应子胱门蛋白酶（尤其是胱门蛋白酶-3）是细胞凋亡的执行器，活化后可裂解破坏细胞的必需成分（例如细胞骨架和核蛋白）和抑制受损伤DNA 的修复，从而诱发细胞凋亡。研究显示，促凋亡配体与死亡受体结合后诱发细胞凋亡的反应可在数小时内迅速发生，无须RNA 或蛋白质合成，而且亦不依赖于线粒体[11]。也有研究发现，死亡受体TNFR1 被激活后还可进一步激活核转录因子κB（NF-κB）和丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）/c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）信号转导通路来调控心肌细胞凋亡，但是激活后的信号转导通路目前尚未被完全阐明[9]。

（二）由线粒体损伤启动的细胞凋亡

在死亡信号到达线粒体之后，首先引起线粒体膜通透性转运孔开放，然后线粒体内外膜间的凋亡诱导蛋白被释放进入胞浆，主要包括cyto C、凋亡诱导因子（AIF）和半胱天冬酶-2、3、9的前体。在dATP的存在下，线粒体释放的cyto C 可与Apaf-1 形成三聚体。该复合体可将半胱天冬酶-9 的前体直接裂解为线粒体依赖性凋亡信号转导通路中最上游的半胱天冬酶[11]。随后，活化的半胱天冬酶-9 可将半胱天冬酶-3 的前体裂解为半胱天冬酶-3。而AIF可通过直接激活半胱天冬酶-3而诱发细胞凋亡。一般认为，凋亡的整个过程通常分为3 个阶段：①决定死亡阶段：细胞表面的促凋亡信号与细胞内的抗凋亡信号发生联合，促使细胞作出生与死的决策；②执行死亡阶段：如果细胞内的平衡状态倾向于凋亡，则可激活半胱天冬酶家族酶级联反应或AIF 核转位而诱发DNA 降解。③残体清除阶段：包括邻近细胞对凋亡细胞的包围和吞噬消化。由于细胞发展成为不可逆性凋亡的时间需数分钟至数小时或更长，所以在凋亡过程执行前可通过操纵有关因素而影响结局。这就为损伤后治疗干预提供了一个“机会窗”，在这个机会窗内采用一定的措施挽救走向凋亡的心肌细胞，可起到心肌保护作用[12]。

（三）线粒体与半胱天冬酶在诱导细胞凋亡中的相互关系

线粒体与半胱天冬酶在诱导细胞凋亡的过程中均具有重要作用，而且它们之间可互相独立又可互相促进。总体来讲包括下列三种情况：①C半胱天冬酶直接诱导细胞凋亡，没有线粒体的参与，例如Fas 诱导的凋亡；②线粒体直接诱导细胞凋亡，半胱天冬酶不参与。这种情况主要见于Bax 或Bax 类似蛋白大量表达而抑制半胱天冬酶，使DNA 发生凝集（而半胱天冬酶可使DNA 发生降解）和线粒体膜通透性转运孔开放；③线粒体和半胱天冬酶共同参与细胞凋亡，以实现死亡信号的级联放大，加快凋亡的发生[11]。

目前，线粒体损伤和半胱天冬酶活化在缺血再灌注过程中诱发心肌细胞凋亡的作用已经得到了证实。采用培养的心肌细胞缺氧/复氧模型、在体大鼠局部心肌缺血再灌注模型以及氧化应激介导的犬心室功能障碍模型进行的研究均发现，cyto C 释放以及半胱天冬酶-3 和半胱天冬酶-9 活化可诱发心肌细胞凋亡。能够阻断cyto C 释放和半胱天冬酶活化的药物和处理措施均可明显减轻心肌细胞凋亡的程度，而加入外源性细胞色素C 和dATP 则可激活足以诱发心肌细胞凋亡的半胱天冬酶[6，11]。而且，在原发性心肌病患者心肌中检测到的心肌凋亡细胞亦可能是由线粒体cyto C 释放所致的半胱天冬酶-3 活化引起的。在犬心肌缺血再灌注损伤模型的研究显示，缺血心肌内存在活化型半胱天冬酶-3 的高度表达[7]，并且抑制半胱天冬酶的活性可明显减轻心肌细胞凋亡的程度和缩小心肌梗死的面积[13]。

五、心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生机制

（一）心肌细胞凋亡的基因调控

细胞凋亡的调控基因分为诱导基因（死亡基因）和抑制基因（生存基因）。在生理条件下，心肌细胞有序而协调地激活凋亡诱导基因（Bax、Fas、p53 等）和/或凋亡抑制基因（Bcl-2 等），共同调控细胞代谢而维持细胞内环境稳定。但是在缺血再灌注过程中，凋亡相关基因及其表达产物发生了变化，从而导致心肌细胞凋亡的发生。在调控凋亡的基因中，目前研究较多的是Bcl-2基因家族。

Bcl-2家族包括一组抗凋亡基因（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Bag-1和BI-1）和一组促凋亡基因（Bax、Bak、Bad、Bid和Bim）。Bcl-2是最主要的抗凋亡基因，而Bax 的作用则正好相反，Bcl-2/Bax的比值将决定细胞是否发生凋亡。研究发现，长时间缺血诱发心肌细胞发生凋亡之后，心肌内Bcl-2 表达减少而Bax 表达增多[14]。据报道，在梗死区周围的存活心肌中有Bcl-2 的阳性表达，而在心肌梗死区内则有Bax 的过度表达。在Bcl-2过度表达的转基因小鼠，缺血和再灌注所致的心肌细胞凋亡、心肌梗死和心功能均明显减轻。

通常认为Bcl-2 具有抗氧化自由基的作用，可通过减轻脂质过氧化和增强细胞对活性氧的耐受而预防凋亡的发生。另外，Bcl-2还可防止细胞内酸中毒、抑制细胞内钙超载、抑制TNFα的合成和释放、减轻促凋亡基因Bax的细胞毒性作用以及稳定线粒体膜电位和抑制线粒体释放cyto C 和AIF 等。这些作用均有助于减轻缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡的发生[14]。

（二）心肌细胞凋亡的外部诱发因素

1．中性粒细胞浸润 研究发现，中性粒细胞在再灌注心肌中聚集增加可加重心肌细胞凋亡的程度，并且危险区中性粒细胞聚集与凋亡细胞数目的增加呈线性关系，提示中性粒细胞与心肌细胞凋亡的发生密切相关[5，15]。关于中性粒细胞如何介导心肌细胞凋亡的发生目前尚不十分清楚，可能是由于中性粒细胞聚集堵塞微血管而导致无复流现象，亦可能与中性粒细胞活化后释放大量的炎性介质（例如自由基和细胞因子）有关[16]。

2．巨噬细胞活化 采用离体和在体心肌缺血再灌注损伤模型的多项研究显示，巨噬细胞诱发的炎症反应可能是促发心肌细胞凋亡的重要因素[16，17]。离体实验研究显示，巨噬细胞可通过释放细胞因子和细胞毒性介质（例如TNFα和NO）而诱发细胞凋亡。在大鼠离体心肌细胞进行的研究发现，巨噬细胞释放的细胞因子可呈时间依赖性诱导心肌细胞凋亡。近年来也还有研究发现，缺血再灌注心肌内的大部分巨噬细胞在再灌注6～24h内一直维持着较为完整的形态，直到48h后才发生明显的脱颗粒。再灌注48h 和72h 后聚积在危险区内的巨噬细胞数和凋亡细胞数呈明显的线性关系，提示活化的巨噬细胞可能参与了再灌注诱发的延迟性心肌细胞凋亡[5，17]。

3．非炎症细胞激活 在心肌缺血再灌注过程中，除了上述炎症细胞之外，被激活的血管内皮细胞和心肌细胞亦可合成和释放大量的炎症介质，然后通过死亡受体依赖性信号转导通路而诱发心肌细胞凋亡[15]。

4．氧化应激增强 多项研究显示，氧自由基是启动凋亡的重要因子，采用抗氧化剂和自由基清除剂可有效抑制细胞凋亡的发生。氧自由基诱发凋亡的机制可能为：①氧化破坏内质网和线粒体膜的完整性而导致细胞内钙超载；②促使线粒体膜通透性转运孔开放而释放cyto C；③激活转录因子AP-1 和NF-κB，后者可通过上调TNFα和白介素-6而诱导心肌细胞凋亡的发生[18]。

5．细胞因子与黏附分子大量表达 在心肌缺血再灌注期间，活化的巨嗜细胞、肥大细胞、中性粒细胞以及心肌细胞本身可产生大量的细胞因子和黏附分子。细胞因子不仅可促进心肌炎症，而且还可与黏附分子相互作用而加重心肌细胞凋亡[15]。在缺血和再灌注期间，心肌细胞内的TNFα表达明显上调，TNFα可通过下列机制诱发心肌细胞凋亡：①与其受体TNFR1 结合后，直接激活心肌细胞凋亡的信号转导通路；②激活酸性鞘磷脂酶，通过产生脂质信使神经酰胺而介导细胞凋亡的发生； ③诱导内皮细胞和部分心肌细胞表达IL-1、IL-2、IL-6、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血小板活化因子，促进中性粒细胞与内皮细胞的黏附和脱颗粒，并激活NADPH 氧化酶而释放氧自由基，从而间接地调控凋亡过程[19]。

6．细胞内钙超载 细胞内钙超载是各种损伤因素的最后共同通路。在缺氧诱导的心肌细胞凋亡中，无论是阻断细胞外Ca2+内流还是减少细胞内Ca2+释放，均能有效减少心肌细胞凋亡的发生[20]。细胞内Ca2+浓度升高后可激活内源性Ca2+-Mg2+依赖性核酸内切酶，使细胞核内染色体DNA降解成寡核苷酸片段。此外，Ca2+还可激活Ⅱ型转谷酰胺酶，使大量蛋白质发生交联，在脂质膜下形成蛋白质网，防止胞浆内成分外漏，避免了像坏死所致的炎症反应。而且，转谷酰胺酶还参与了胞浆膜的修饰，从而有利于吞噬细胞识别形成的凋亡小体而将其吞噬。

7．细胞内酸中毒 在心肌缺血再灌注时，无氧代谢可导致细胞内、外H+浓度增加而引起酸中毒。细胞内酸化可使细胞趋向凋亡，可能与凋亡过程中的一些酶例如核酸内切酶的最佳pH

8．一氧化氮与细胞凋亡 一氧化氮（nitric oxide，NO）是体内一种重要的生物信号分子，在心血管生理学和病理学过程中发挥着重要调节作用。研究发现， NO具有细胞毒性作用，可增强氧化应激（尤其是iNOS的激活和过氧亚硝基阴离子的大量生成）、干扰能量代谢、直接损害DNA、激活多聚ADP 核糖聚合酶[PARP]或扰乱细胞内Ca2+稳态，从而诱导包括心肌细胞在内的多种细胞发生凋亡；但是亦有研究报道，NO是一种细胞保护因子，可通过抑制中性粒细胞的黏附和聚集、上调cGMP、抑制Bcl-2降解和线粒体释放cyto C以及降低半胱天冬酶的活性而抑制细胞凋亡的发生[21，22]。至于NO 在心肌缺血再灌注过程中是发挥促进细胞凋亡还是抑制细胞凋亡的作用，可能取决于NO在心脏内发挥作用的浓度和心脏的氧化还原状态。

六、缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡的防治

目前，防治心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡发生的措施包括：消除诱发细胞凋亡的因素、切断细胞凋亡信号转导途径、提高心肌细胞内源性保护机制和瓦解细胞凋亡信号。由于心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生是多因素和多途径的，所以阻断细胞凋亡级联反应中的关键环节和抑制参与多信号途径的介质是防治细胞凋亡的最有效方法[15]。

研究发现，β受体阻断剂可抑制高浓度儿茶酚胺促发的细胞凋亡[23]，血管紧张素转换酶抑制剂亦可抑制血管紧张素Ⅱ引起的心肌细胞凋亡。针对氧化应激[18]、细胞内钙超载[24]和改善心肌血流灌注[15]的方法亦具有同样的效应。采用可溶性死亡受体或受体拮抗剂清除死亡因子，可减轻死亡受体介导的心肌细胞凋亡[1]。

采用抗凋亡基因Bcl-2产物和可溶性存活因子例如胰岛素样生长因子1（IGF1）能够抑制缺血所致的细胞凋亡[25]。IGF1 过度表达可减少非梗死区细胞凋亡和促进梗死后有利的心肌重构。细胞凋亡的执行包括线粒体扩大和半胱天冬酶激活在内的一系列信号途径的活化。内源性半胱天冬酶抑制剂能抑制缺血再灌注刺激所致的细胞凋亡。抑制半胱天冬酶的药物亦可短期抑制心肌细胞凋亡的发生。研究发现，L-肉碱可抑制半胱天冬酶和降低TNFα，从而防止心肌细胞凋亡的发生[19]。

第7篇：细胞凋亡范文

【摘要】 目的：研究墨旱莲水煎剂对不同药物诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型细胞凋亡的影响。方法：制作以环磷酰氨诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型和以氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型;用不同浓度的墨旱莲水煎剂对其治疗，用电镜或荧光显微镜观察其形态变化;用流式细胞仪等检测胸腺细胞凋亡情况。结果：以环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型组小鼠和以氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型组小鼠，胸腺均出现典型细胞凋亡表现;用不同浓度的墨旱莲水煎剂对其治疗，均使细胞凋亡情况得到一定抑制，且有计量依赖性。环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.15%;环磷酰氨组胸腺细胞亡凋率30.25%;各治疗组(3～7组)依次分别是28.76%、26.14%、12.06%、3.24%、3.6%。氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型组，流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.33%;氢化可的松组胸腺细胞亡凋率22.78%;墨旱莲各组(2～4组)依次分别是2.33%、2.31%、2.31%;治疗各组(6～8组)分别是16.52%、9.74%、4.26%。结论：环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功;氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功。墨旱莲水煎剂可以抑制以环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡，也可以抑制氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡，而对正常细胞几乎没有影响。故墨旱莲水煎剂对小鼠免疫功能有调节作用。

【关键词】 墨旱莲; 环磷酰胺; 氢化可的松; 小鼠; 胸腺; 细胞凋亡

墨旱莲为菊科植物鳢肠的干燥地上部分。墨旱莲很早就应用于临床，有扶正固本、滋补肝肾、凉血止血的功效[1]，主要用于出血性疾病、牙齿松动、须发早白、阴虚血热、肝肾亏损等。本研究探讨墨旱莲对以环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡和以氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的免疫调节作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

昆明种小鼠，3～4周龄，体重18～22g，雌雄各半，150只，由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2 药品和试剂

墨旱莲干燥全草，购自锦州市成大方圆药店，制成浓度为1g/ml的水煎剂。磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)的配制：Nacl 4g、Kcl 0.1g、KH2PO4 0.1g、Na2HPO3，12H2O 1.442g三蒸水定容至500ml，4℃保存。吖啶橙染色液的配制：吖啶橙10mg溶于10mlPBS中(PBS的pH

1.3 主要仪器

透射电子显微镜(日本JEM1200EX型);超薄切片机;(日本LKB5型);流式细胞仪(美国B.D公司FACScan Cell Quest分析系统);高速冷冻离心机(TGLL18G型)等。

1.4 动物模型的制作

1.4.1 环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型的制作：将70只小鼠隋机分成7组，正常对照组、环磷酰胺组、5个墨旱莲治疗组(简称治疗组)，每日每公斤体重分别给墨旱莲2g、4g、8g、16g、25g，连续6d以墨旱莲水煎剂灌胃;正常对照组腹腔注射生理盐水;环磷酰胺组和各治疗组第4天腹腔注射环磷酰胺50mg/Kg体重。

胸腺细胞悬液的制备：末次给药24h后，颈椎脱位法处死小鼠，取胸腺 于平皿内用PBS清洗干净，用眼科剪剪碎，过200目筛网制成细胞悬液，置离心管中，800～1000r/min离心10min。用0.01mol/L的PBS重悬细胞，即为胸腺细胞悬液。

胸腺细胞凋亡的形态学观察：将胸腺细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中，2000r/min离心15～20min，使细胞成团;小心吸去上清加入2.5%戊二醛固定液固定细胞团。取出琼脂，切下含有细胞团的琼脂块。将含有细胞团的琼脂块投入装有戊二醛固定液的小瓶中，4℃保存。用0.1mol/L的PBS洗1次，1%锇酸后固定30～60min。用超薄切片机切片，加醋酸铀染色30min，用透射电镜观察、拍照。

凋亡细胞的检测：依上法制备胸腺细胞悬液，调整细胞数为1×107/ml;用3mlPBS洗1次，1000r/min离心10min，去PBS;加入预冷的70%乙醇固定，4℃放置24h;1000r/min离心10min，去固定液;3mlPBS重悬5min，1000r/min离心10min，去PBS;加入1ml碘化丙啶染色液，4℃避光放置30min;流式细胞仪检测。

1.4.2 氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型的制作：将80只小鼠随机分成8组：1组为正常对照组;2～4组为墨旱莲组，每日每公斤体重分别给墨旱莲5g(低剂量组)、10g(中剂量组)、15g(高剂量组);5组为氢化可的松组;6组为氢化可的松墨旱莲低剂量组，简称治疗1组;7组是氢化可的松墨旱莲中剂量组，简称治疗2组;8组是氢化可的松墨旱莲高剂量组，简称治疗3组。2～4组、6～8组连续6d以墨旱莲水煎剂灌胃;1组和5组以等量生理盐水灌胃;5～8组在第1、3、5天腹腔注射氢化可的松30mg/kg体重，1～4组腹腔注射等量生理盐水。

胸腺细胞悬液的制备：末次给药24h后，依上法处死小鼠，制作胸腺细胞悬液。

胸腺细胞凋亡的形态学观察：调整细胞数为1×107/ml;取95ul细胞悬液，加入5ul吖啶橙染色液，混匀;吸取混合液滴在载波片上，加盖盖玻片;荧光显微镜400倍镜下观察并拍照。

凋亡细胞的检测：依上法用流式细胞仪检测。

转贴于 　　2 结果

2.1 两种小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功

2.1.1 环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功

在电镜下观察正常对照组小鼠胸腺细胞呈圆形或椭圆形，核大，异染色质丰富。环磷酰胺组胸腺细胞体积缩小，细胞膜完整，胞浆浓缩，细胞电子密度增加，染色质凝集，在核膜周边形成新月形或花瓣状团块，核膜光滑完整[2]。

2.1.2 氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功

在荧光显微镜下观察结果，正常对照组小鼠胸腺细胞呈圆形或椭圆形，胞浆呈均匀的绿色荧光，细胞核较大，呈均匀的黄绿色荧光(图1)。5组即氢化可的松组小鼠胸腺细胞可见大量的凋亡细胞。典型的凋亡细胞呈不规则形核固缩，染色质向核膜靠拢呈新月状或花瓣状，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光区，说明氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功(图2)。

2.2 墨旱莲水煎剂对两种小鼠 胸腺细胞凋亡模型均有治疗作用

2.2.1 墨旱莲水煎剂对环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的调节作用 在电镜下观察到各治疗组与环磷酰胺组比较，小鼠胸腺细胞凋亡数量明显减少，且随着墨旱莲水煎剂用量的增加凋亡细胞减少的越多，其中以6组(16g/Kg)最好，细胞与正常对照组几乎没有区别。而7组(25g/Kg)较6组细胞凋亡数有所增加。流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.15%;环磷酰胺组胸腺细胞亡凋率30.25﹪;各治疗组(3～7组)依次分别是28.76%、26.14%、12.06%、3.24%、3.6%。

2.2.2 墨旱莲水煎剂对氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的调节作用 在荧光显微镜下观察结果，墨旱莲各组(2～4组)与正常对照组比较，小鼠胸腺细胞凋亡情况无有区别。治疗各组(6～8组)与氢化可的松组比较，小鼠胸腺细胞凋亡数量明显减少，且随着墨旱莲水煎剂用量的增加凋亡细胞减少的越多，其中以8组(15g/Kg)最好，与正常对照组几乎没有区别(图3)。

流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.33%;氢化可的松组胸腺细胞亡凋率22.78%;墨旱莲各组(2～4组)依次分别是2.33%、2.31%、2.31%;治疗各组(6～8组)分别是16.52%、9.74%、4.26%。

3 讨论

细胞凋亡又叫程序性死亡，是细胞通过基因调控，遵循自身规律，程序性的结束生命，是一种与坏死截然不同的死亡方式。如成熟的淋巴细胞和其他成熟的白细胞寿命只有1天，死一批再生一批相互交替，非常严格有序。若细胞凋亡发生障碍，只生不死，就会出现白细胞堆积，发生白血病。细胞凋亡是保证多细胞生物个体正常发育成熟和维持正常生理过程所必须的。细胞凋亡过程失调不仅可使生物个体失去机体的稳定性，还是许多人类严重疾病的根源[3]。环磷酰胺是临床常用的氮芥类免疫抑制剂，具有细胞毒性，可以引起细胞凋亡[4]。故利用环磷酰胺诱导小鼠胸腺细胞凋亡，制作细胞凋亡模型。从电镜观察结果可见正常对照组小鼠胸腺细胞呈圆形或椭圆形，核大，异染色质丰富。环磷酰胺组胸腺细胞体积缩小，细胞膜完整，胞浆浓缩，细胞电子密度增加，染色质凝集，在核膜周边形成新月形或花瓣状团块，核膜光滑完整，具有凋亡细胞的特征。流式细胞仪是定性、定量检测细胞凋亡的重要指标，从检测结果可见，正常对照组胸腺细胞凋亡率2.15%;环磷酰胺组胸腺细胞凋亡率高达30.25%。因此，无论从形态学观察结果还是流式细胞仪检测结果都说明环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功。氢化可的松是糖皮质激素类药物，具有抗炎抗毒、抗休克和免疫抑制作用。本研究利用它的免疫抑制作用，制作细胞凋亡模型。因为氢化可的松进入胸腺细胞后，可以激活胞浆受体，变构后进入细胞核，与DNA反应元件结合，引起基因转录的抑制或诱导，从而使细胞凋亡，故用氢化可的松作为诱导剂制作胸腺细胞凋亡模型[5]。从图1可见正常胸腺细胞呈圆形，胞核较大，呈均匀的黄绿色荧光，胞浆稀少，呈均匀的绿色荧光。从图2可见，5组即氢化可的松组小鼠胸腺细胞可见大量的凋亡细胞。典型的凋亡细胞呈不规则形核固缩，染色质向核膜靠拢呈新月状或花瓣状，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光区。流式细胞仪检测结果可知，正常对照组胸腺细胞凋亡率2.33%;氢化可的松组胸腺细胞亡凋率22.78%。所以从形态学观察结果和流式细胞仪检测结果均说明氢化可松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型制作成功。

墨旱莲水煎剂对氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡有调节作用。在荧光显微镜下观察结果，墨旱莲各组(2～4组)与正常对照组比较，小鼠胸腺细胞凋亡情况几乎没有区别。流式细胞仪检测结果：正常对照组胸腺细胞凋亡率2.33%，墨旱莲各组(2～4组)依次分别是2.33%、2.31%、2.31%;说明墨旱莲对正常胸腺细胞几乎没有影响。由图3可见治疗组(8组)凋亡细胞数量与氢化可的松组(2组)比较已明显减少，细胞形态已基本恢复正常胸腺细胞的形态(图3)。流式细胞仪检测结果，治疗组(6～8组)胸腺细胞凋亡率依次是16.52%、9.74%、4.26%，说明墨旱莲水煎剂对氢化可的松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡有抑制作用，并且有计量依赖性。

从环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的形态学情况可见，随着墨旱莲水煎剂用量的增加胸腺细胞凋亡的数量减少，且细胞形态越接近正常对照组，说明墨旱莲水煎剂对环磷酰胺诱导的小鼠胸腺细胞凋亡有抑制作用，并且有计量依赖性。其中以6组(16g/Kg)最好。7组(25g/Kg)墨旱莲水煎剂用量虽然增加，但抑制作用并没有增加，反而有所下降。说明墨旱莲水煎剂只有在低浓度时有计量依赖性，其抑制作用有一个最佳浓度，超过这个浓度，抑制作用反而减弱。

综上所述，环磷酰胺和氢化可的松均可以诱导小鼠胸腺细胞凋亡。墨旱莲水煎剂对上述两种模型的胸腺细胞凋亡均有抑制作用;在浓度较低时，随着浓度的增加抑制作用也增加，具有计量依赖性;增加到一定浓度时可以达到最大抑制;此后再增加浓度，其抑制作用不仅不会增加，反而还会下降。说明墨旱莲其药物作用的发挥有最佳浓度值。目前在国际和国内医学界，细胞凋亡都是疾病研究的热点。因为细胞凋亡涉及生命活动中的众多领域及机体许多病理生理过程，如胚胎发育、造血、免疫、肿瘤、T淋巴细胞介导的细胞毒性作用等。临床上大剂量的激素应用可诱导病理性免疫细胞凋亡，导致免疫损伤。细胞凋亡的失常与自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病、机体衰老等许多疾病的发生发展有密切关系，故胸腺细胞凋亡的研究，不仅有利于免疫活性细胞发育、免疫耐受形成机制等免疫学问题的认识，而且随着细胞凋亡机制的深入研究，人们可以通过干预胸腺细胞凋亡，保护胸腺细胞及提高免疫功能，为临床上的免疫缺陷、重症感染等的治疗提供新的思路。

墨旱莲是传统的中草药，在临床作为止血药等已广泛应用。本研究通过制作小鼠胸腺细胞凋亡模型，了解到墨旱莲对胸腺细胞凋亡有抑制作用，这无疑扩大了墨旱莲在临床的应用。但墨旱莲的哪些成分在起作用，尚有待进一步探讨。

参考文献

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3 刘雪英，赵越平.墨旱莲乙酸乙酯总提取物对小鼠免疫功能的调节作用.中药材，2000，23(7):754.

第8篇：细胞凋亡范文

细胞的死亡有两种形式，一种是人们所熟悉的坏死(necrosis)，另一种是细胞凋亡(apoptosis)或细胞程序性死亡(programmed cell death)。当细胞在外界物理、化学、生物性的损伤因素作用下肿胀变性，发生坏死，细胞内容物释放到细胞的周围环境[1]。而细胞凋亡则是机体细胞一种固有的生理死亡机制，凋亡的细胞能够迅速被吞噬细胞所吞噬，并不释放其胞内的内容物，细胞凋亡对于清除人体不必要的细胞、维持人体细胞群体数量起着重要的作用[2]。现已知道，外周血嗜酸粒细胞升高，气道嗜酸粒细胞持续存在并且释放胞内的嗜酸粒细胞持续存在并且释放胞内的嗜酸性阳离子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)、主要碱性蛋白(major basic protein，MBP）、白三烯C4(leukotriene c4，LTC4)等介质是诱发支气管哮喘的重要的发病机制。目前不少学者认为上述机制可能与嗜酸粒细胞的异常凋亡有关。本文就嗜酸粒细胞凋亡的研究进展及其与支气管哮喘的相关性作一综述。

嗜酸粒细胞凋亡的形态学改变及其检测

嗜酸粒细胞凋亡过程中的形态学变化同其他类型的细胞如胸腺细胞、中性粒细胞等一样，也是一个连续的过程。首先，凋亡的细胞发生皱缩，细胞膜表面形成许多泡状突起，同时细胞核浓缩，核染色质致密，沿核膜形成新月形，然后泡状突起逐渐扩大缢断，脱离细胞，形成凋亡小体(apoptosis body)。电镜下整个过程胞膜完整，胞浆内细胞器结构正常，胞内内容物没有释放到细胞周围环境。

凋亡的嗜酸粒细胞的DNA被自身产生的核酸内切酶切断，切成与180bp成倍数关系的DNA片段，应用琼脂糖凝胶电泳可呈现特征性的“梯状”(Ladder)条纹[3]。也有许多学者应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的采用荧光或生物素标记dUTP的末端标记技术(TUNEL，TdT-mediated nick and labelling)[4]，应用荧光显微镜或免疫组化法检测。

嗜酸粒细胞凋亡的调节及其与支气管哮喘的关系

细胞因子　现已明确白介素(interleukin，IL)-5，IL-3和粒细胞-巨噬细胞集落因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF)是调节嗜酸粒细胞成熟、分化、趋化、活化不可缺少的细胞因子。支气管哮喘病人外周血及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的这些细胞因子的表达水平明显增加，故新近许多学者就嗜酸粒细胞凋亡以及与这些细胞因子的关系开展了研究[3，5，6]。研究结果表明，正常人和支气管哮喘、过敏性鼻炎等嗜酸粒细胞增高疾病的病人新鲜分离的外周血嗜酸粒细胞在体外培养时，均在第6～12小时出现凋亡的征象，到第4天时绝大多数发生了凋亡，而当培养基中加入IL-5、IL-3、GM-CSF等细胞因子后，到48小时时尚未观察到凋亡的征象。IL-5、GM-CSF可使嗜酸粒细胞的生存延长至10天左右才发生凋亡，而作用较弱的IL-3也可使50％的嗜酸粒细胞生存6天[3，5]。Yousefi等[7]在研究中发现IL-5、IL-3、GM-CSF等细胞因子与相应的受体结合时，共同的β亚单位磷酸化后通过酪氨酸激酶通路，进一步依次激活酪氨酸激酶Lyn和Syk，从而参与了抑制凋亡信号的传递，应用Lyn、Syk的反义寡聚核苷酸可抑制IL-5、IL-3等细胞因子的抗凋亡作用。这些细胞因子抑制凋亡信号传递的最终效应可能是通过增强嗜酸粒细胞某种蛋白质的mRNA的转录和蛋白合成而发挥作用。转录抑制剂放线菌素D(actinomycin，ACTD)或蛋白合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide，CHX)可拮抗IL-5的抑制调亡作用[5]。Yamaguchi[5]认为嗜酸粒细胞在这些细胞因子的作用下产生一些 蛋白质，能够抑制核内酶的活化，从而抑制了嗜酸粒细胞的凋亡。

转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)　是一种多向性作用的细胞因子，据认为能够促进局部组织细胞的功能而抑制游走的组织内炎症细胞的生长和活性。因而有人就TGF-β对嗜酸粒细胞炎症的作用进行了研究[8]，结果表明，TGF-β可能通过抑制嗜酸粒细胞对IL-5、GM-CSF等细胞因子的自分泌作用，从而诱导促进了嗜酸粒细胞的凋亡；而抗TGF-β抗体则可能通过抑制嗜酸粒细胞对TGF-β的自分泌作用，延长了嗜酸粒细胞的生存时间。这一研究结果提示应用TGF-β可能是治疗支气管哮喘的一个有效方法。

茶碱　茶碱是治疗支气管哮喘的常用药物，传统上认为它是通过抑制气道平滑肌细胞内磷酸二酯酶的活性，增加细胞内cAMP的使平滑肌舒张的作用，达到止喘效果。但近来的研究发现它能通过促进嗜酸粒细胞凋亡，下调气道嗜酸粒细胞炎症而在支气管哮喘的治疗中发挥作用。Ohta[9]对11例嗜酸粒细胞增高的病人(其中包括6例支气管哮喘病人)的外周血嗜酸粒细胞的研究中发现，茶碱本身并不能促进嗜酸粒细胞的凋亡，但治疗浓度的茶碱(18μg/L)能够明显抑制IL-5对嗜酸粒细胞的作用，促进了嗜酸粒细胞的凋亡。同时，cAMP的类似物双丁酰环磷酸腺苷(dibutyryl cAMP)也起着类似的作用。Hallsworth等[10]进一步的研究表明GM-CSF抑制嗜酸粒细胞凋亡的作用可被能引起嗜酸粒细胞胞内cAMP升高的因素如霍乱毒素所逆转，蛋白激酶A(protein kinase，PKA)的抑制剂H89能抑制霍乱毒素对嗜酸粒细胞的促进凋亡效应。以上研究结果提示，茶碱通过增加胞内cAMP，激活A激酶通路抑制支气管哮喘病人IL-5、IL-3、GM-CSF等细胞因子对嗜酸粒细胞的作用，促进嗜酸粒细胞的凋亡，从而有利于支气管哮喘病人清除气道过多的嗜酸粒细胞。

糖皮质类固醇激素　糖皮质类固醇激素应用于支气管哮喘的治疗已有悠久的历史，但其确切的作用机制究竟是什么，尚未明确。体外研究的结果已经提示了糖皮质类固醇激素能够加速嗜酸粒细胞的凋亡，并且能拮抗IL-5、IL-3、GM-CSF等细胞因子的效应[10]。而Wooley等[12]对发作期支气管哮喘病人的研究发现，病人在应用糖皮质类固醇激素后症状改善的同时，痰中嗜酸粒细胞计数明显下降，发生凋亡的嗜酸粒细胞的比例由发作期的9±3.8%上升至治疗后的51±10％。Schleimer[11]认为糖皮质类固醇激素对嗜酸粒细胞的效应可能是通过拮抗IL-5、IL-3、GM-CSF等细胞因子介导的转录因子的作用或抑制嗜酸粒细胞对这些细胞因子的自分泌作用，或者减少这些细胞因子受体的表达，从而促进了嗜酸粒细胞的凋亡和清除。

Fas和抗Fas　现已明确Fas、APO-1、CD95是同一种分子，它是由325个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，属于TNF受体/NGF受体超家族的一员，具有传递信号的功能。Fas可表达于多种细胞的细胞膜，如活化的淋巴细胞、中性粒细胞等。这些细胞表面的Fas被交联、激活后可促进它们的凋亡，从而维持体内新旧细胞交替的稳定性。近来，Hebestreit等[4]的研究发现，尽管患者支气管哮喘和其他一些嗜酸粒细胞增高的病人和正常人新鲜分离的外周血以及组织中的嗜酸粒细胞表面均表达一数量的Fas，胞浆中均可检测到Fas的mRNA，但两者之间并无差异。嗜酸粒细胞凋亡时，Fas表达增加，抗Fas抗体能够促进嗜酸粒细胞的凋亡[13，14]，应用IL-5并不能阻断其促进凋亡的作用[13]，糖皮质类固醇激素则可加强其效应[14]。Hebestreit[4]在研究中还发现一些支气管哮喘等嗜酸粒细胞增高的疾病病人外周血和鼻息肉(组织中嗜酸粒细胞增多)的一些嗜酸粒细胞细胞膜表面Fas的表达并无明显异常，但是抗Fas并不能促进这些嗜酸粒细胞的凋亡。以上对Fas的研究表明了嗜酸粒细胞的凋亡。以上对Fas的研究表明了嗜酸粒细胞的凋亡可能与Fas抗原有关；抗Fas促进凋亡和IL-5抑制凋亡是相互独立的过程；支气管哮喘等嗜酸粒细胞增多的病人其嗜酸粒细胞可能不表达功能性的Fas而影响了嗜酸粒细胞的正常凋亡过程。

凋亡嗜酸粒细胞的清除　凋亡的嗜酸粒细胞如不能及时得到清除，其细胞膜将失去完整性而进入坏死阶段，释放胞内的生物活性物质。因而对于已经发生凋亡的嗜酸粒细胞及时进行清除的是嗜酸粒细胞炎症消散、支气管哮喘病 人症状好转的重要环节[11]。吞噬细胞对凋亡细胞和凋亡小体的吞噬是消除凋亡嗜酸粒细胞的主要途径，这些细胞包括单核细胞来源的巨噬细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等。其中以单核细胞来源的巨噬细胞对凋亡嗜酸粒细胞的识别和吞噬作用最为重要[3]。这些巨噬细胞能够分泌一种多功能的含有Arg-Gly-Asp(RGD)的血小板凝血酶致敏蛋白(thrombospondin，TSP)[15]，TSP能同巨噬细胞表面的整合素αvβ3和CD36抗原相结合，另一方面能同时发生凋亡的嗜酸粒细胞表面相应的受体结合，从而完成凋亡嗜酸粒细胞的识别和吞噬。针对CD36、αvβ3和TSP的单克隆抗体可阻断巨噬细胞的吞噬作用。这些巨噬细胞对于新鲜分离的嗜酸粒细胞并无吞噬作用，其吞噬仅限于已发生凋亡的嗜酸粒细胞[3]。在整个吞噬过程中嗜酸粒细胞的胞膜是完整的，巨噬细胞不因为吞噬凋亡的嗜酸粒细胞而释放炎症介质[14]。临床上，在支气管哮喘病人应用激素病情好转的同时，发生凋亡的嗜酸粒细胞增多，其气道内含有嗜酸粒细胞颗粒的巨噬细胞明显增多[11]。

综上所述，嗜酸粒细胞凋亡的异常可能是支气管哮喘的重要发病机制，促进其凋亡将是支气管哮喘新的治疗思路。

参考文献

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12 Woolley KL，Gibso n PG，Carty K et al.Am J Respir Crit Care med，1996;154:237-243

13 Matsumoto K，Schleimer RP，Saito H，et al.Blood，1995;86:1437-1443

第9篇：细胞凋亡范文

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1007-2349(2009)06-0062-03

三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]为五加科植物，干燥的根入药。味甘、微苦，性温，归肝、胃、心、小肠经，具有止血、散瘀、消肿、止痛、补虚、强壮等功效。现代药理研究证明，三七中岔量最高的为三七总皂苷(PNS)即人参皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1，近年来有关中药三七调控细胞凋亡的研究日渐增多，研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中药三七可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节，进而抑制细胞凋亡，维持机体内平衡，阻止组织病理过程的恶化。现就中药三七对细胞凋亡的影响综述如下。

1　通过调控死亡受体途径调控凋亡

死亡受体属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，包括Fas(又称CD95或Apol)、TNFRI(又称p55或CD120a)、DR3、DR4和DR5，在胞内部分都含有一个死亡域(DD)，以此招募下游的凋亡蛋白。当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后，将凋亡信号由胞外传人胞内，在连接分子的媒介下，激活Caspase，导致细胞凋亡。武凡等在三七总皂苷Rg1、Rb1对脂多糖引起的大鼠肝细胞凋亡及相关基因表达的保护作用的研究中，发现Rg1、Rb1对bel-2的表达时间和数量均无明显影响，而明显抑制促凋亡基因bax、Fas、FasL的表达，Rg1、Rb1对促凋亡基因的抑制作用无显著性差异。提示Rg1、Rb1抗凋亡作用可能是通过影响Fas／FasL的表达实现的。在观察三七总皂苷对肺缺血再灌注损伤时细胞凋亡及Fas／FasL的影响发现，三七总皂苷能有效抑制肺缺血再灌注损伤时肺组织细胞的凋亡，其机制是三七总皂苷可能通过抑制Fas／FasL系统的激活，阻遏肺组织细胞凋亡，从而减轻肺缺血再灌注损伤。

2　通过影响凋亡信号传导调控凋亡

细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下，激活多种信号偶联途径的信号转导过程。目前研究较多的凋亡信号传导途径有RAS-MAPK途径，NF-kB途径，NO途径，Ca2＋的信号传导途径等。

2.1　RAS-MAP　途径丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)参与细胞凋亡的信号转导过程。MAPKS级联反应包括MAPKKK，MAPKK与MAPK等3个顺序的活化过程。每一种激酶又由不同成分组成。MAPK包括ERK，JNK／SAPK，P38。在三七总皂苷对SAM-P／8小鼠海马中衰老相关基因表达的影响中发现，MAPKK4的表达减少，PNS可能通过抑制MAPKK4来减弱MAPK信号通路促进神经细胞分裂死亡的作用，从而抑制了脑的老化。

2.2　NF-kB途径　NF-kB是具有多向性调节作用的核转录因子，其活化能够激活抗凋亡基因的表达(如TRAF1、2，c-IAPl、2，A1／Bf1-1，Bcl-xL等)，阻止caspase-8活化，从而切断caspase连锁链的活化，使细胞逃避凋亡。在三七皂苷对人骨髓造血细胞凋亡相关蛋白表达的影响中，发现转录因子NF-~B呈现不同程度的表达水平增加，表明PNS促进细胞增殖，支持细胞生长和存活的作用机制与抗凋亡基因的表达增多有关。

2.3　NO途　NO可以通过多种机制诱导细胞的凋亡，在三七总皂苷对大鼠脊髓损伤后氧化氮合酶(iNOS)表达及细胞凋亡的影响中发现，脊髓组织病理学改变三七总皂苷2组明显轻于损伤组，2组均发现iNOS表达及凋亡细胞，且损伤组iNOs表达及神经细胞凋亡指数均高于三七总皂苷组，说明三七总皂苷注射液能抑制脊髓损伤后iNOS表达及神经细胞凋亡。此作用可能与PNS通过其抗炎、改善微循环、抑制脂质过氧化、减少细胞钙内流等作用防治继发脊髓损伤，及抑制脊髓损伤后iNOS表达，从而避免NO过量产生引起的细胞损伤和凋亡有关。

2.4　Ca2＋作为第二信使的信号传导途径 胞浆中游离的Ca2＋作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用，细胞核内钙离子浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。细胞凋亡时最显著的变化是DNA的断裂，钙离子可直接激活核酸内切酶促进DNA断裂，也可通过激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶，导致染色质结构完整性的丧失。有研究表明，缺血再灌注时凋亡相关基因的表达都可能与Ca2＋有关。朱陵群等以原代培养的大鼠海马神经细胞缺氧／缺糖再给氧为模型，观察三七总皂苷对神经细胞凋亡的抑制作用，结果发现三七总皂苷能降低神经细胞凋亡及坏死的百分率，降低细胞内Ca2＋浓度，减少LDH的释放，三七总皂苷的作用随剂量增加而作用增强。认为三七总皂苷对缺血再灌注损伤后海马神经元的凋亡过程具有抑制作用，这种作用可能与其能降低细胞内Ca2＋浓度有关。作用机制可能是阻断Ca2＋内流和／或胞内钙库的释放，从而抑制神经细胞内钙超载。徐正等推测在缺血和再灌注前静脉给予一定剂量的PNS，预先封闭肺组织细胞膜上的受体操纵性钙通道，能防止细胞内Ca2＋超载，而减轻肺缺血再灌注时的细胞凋亡。陈彦静等发现三七总皂苷对血管紧张素Ⅱ诱导的细胞凋亡具有明显的抑制作用，其机制可能与抑制心肌细胞内钙超载有关。

2.5　通过调控caspase途径抑制凋亡　哺乳动物细胞中，在凋亡过程中起关键作用的一些含有半胱氨酸一门冬氨酸特异蛋白酶，被称为caspase。caspase主要以酶原形式存在于健康细胞中，通过活化发生蛋白水解获得活性。caspase有许多种，它们可以逐级水解活化，共同促进凋亡进程。多种损伤机制，包括神经毒性损伤、缺血缺氧、NO、自由基的产生与释放、β样淀粉样蛋白的合成等均可诱导caspase-3的表达与活化，而caspase-3的活化代表细胞凋亡的不可逆转。研究三七总皂苷对脑出血大鼠前脑促凋亡基因caspase-3影响发现，三七总皂苷可通过抑制caspase-3 mRNA的转录及caspase-3蛋白的裂解活化，减少细胞凋亡，促进脑出血后前脑内神经元的存活及损伤修复。

3　通过调控凋亡相关基因表达调控凋亡

Bc1-2基因家族是最重要的细胞凋亡调控基因。抗凋亡基因bc1-2和bc1-xL是Bcl-2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl-2家族中重要的促凋亡基因。研究三七总皂苷对出血性脑损伤的保护作用，发现三七总皂苷可以

增高脑出血后bcl-2的表达，有抑制脑组织细胞凋亡的作用，对脑组织具有保护作用。另外p53、c-myc、Fas、C-~OS等基因均是参与调控细胞凋亡的重要基因。有研究采用MTT比色法观察三七皂苷R1对人白血病细胞株HL-60细胞增殖的抑制作用。采用流式细胞术检测细胞凋亡改变，并以RT-PCR检测凋亡调节基因p53、Bcl-2的表达，发现p53基因mR－NA水平升高，而Bcl-2基因的mRNA下降。提示三七皂苷R1的凋亡诱导作用可能部分通过p53和Bcl-2途径实现。在三七总皂苷对血管平滑肌细胞凋亡及C-myc基因表达的影响中发现PNS可促进C-myc蛋白的表达，诱导VSMC(vascular smooth muscle cell)凋亡，发挥抗动脉粥样硬化的作用。

4　通过调控细胞因子抑制凋亡

细胞因子(cytokine，CK)是机体细胞分泌调节细胞增殖、分化与死亡的一大类因子。与凋亡有关的细胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些细胞因子等，研究三七总皂苷对大鼠肝脏低温保存再灌注期间肝细胞凋亡发现，MDA含量越高，肝实质细胞凋亡数量越多，两者呈正相关关系SOD含量越高，肝实质细胞凋亡数量越少，两者呈负相关关系，机制可能与PNGS抗氧自由基作用有关。细胞因子如TNF(Tumor necrotic factor)具有多种生物学功能，TNF在体外可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡，其中TNF-a与凋亡的关系更为密切，能与TNF受体结合，引起细胞内贮存Ca2＋释放，引起细胞内游离Ca2＋浓度升高，从而激活Ca2＋依赖性核酸内切酶，引起DN段断裂和细胞凋亡。三七总皂苷预处理大鼠供肝可以有效地减轻移植肝的缺血再灌注损伤和细胞凋亡，其机制可能是减少TNF-a的表达，抑制肝细胞的凋亡。