中医药研究的应用

1中医药研究中常见的动物模型的选择依据

从生理功能来说，犬的生理功能与人类高度相似，犬ICH模型与人的ICH情况非常接近。从解剖结构来说，猪脑的解剖结构与人很相似、尤其是脑容积大、脑实质呈回状、脑白质发达、模拟ICH情况更好，也比较理想。最近，一项关于高原ICH动物模型研究就以猪为对象，较好的模拟了高原ICH的情况［1］。从实验效果来说，灵长类肯定是最理想的模型动物，可用于脑神经保护剂因子等临床前药物的安全性和有效性评估。但因其价格昂贵，来源少，不可能大规模用于实验室研究。纵观目前的ICH实验研究，ICH动物模型还是采用啮齿类动物较多，且目前已积累了大量实验研究基础资料。比较常见的是家兔和大鼠。家兔因基底节区相对发达，定位相对容易，且耳缘静脉取血方便和出血后神经功能缺损明显等特点，在研究ICH的实验中也较常用。大鼠因价格低、体型小、容易管理和进行实验性手术，是目前使用最广泛的ICH模型动物，大鼠脑尾壳核属基底节，是脑内最大核团，易于进行脑立体定位，是人类高血压ICH最好发部位，目前大鼠ICH模型研究多定位于鼠脑尾壳核。每种动物模型都有其优缺点，但就目前查阅到有关中医药对ICH的治疗作用的实验研究95%都选择了大鼠作为实验用动物。

2中医药研究中常见的ICH模型的制备方法

目前中医药复方治疗ICH的实验研究很多，有关ICH动物模型的造模方法的文献也很多，但归纳起来方法的选择无外乎以下4种类型。脑内注血法、细菌胶原酶注入法、自发性ICH动物模型和微球囊充胀法，其中前2种造模方法因操作相对容易，外部条件易控制，成为目前在中医和中药研究中使用最多的模型，第3种ICH模型因与临床发病相似，也有不少研究采用，第4种模型目前应用较少，但不管是那种类型，都无法完全模拟人的疾病状态，而且造模过程手技要求都比较高，相对其他病种动物模型的制备较难掌握。

2.1脑内注血法

将自体动脉血或凝血块接注入脑内直是最常用的ICH造模方法。该方法操作成功与否关键在于动脉血的采集与推注时间和注入速度的控制。方法初期是将血液通过穿刺针注入到模型鼠脑右侧尾状核，由于当时没有考虑到血液本身对模型的影响和注射压力变化等因素，模型的成功率较低。后来Yu等［2］采用了一种自制的双套管进行2次注血、3次拔针的改良法制备出了一种兔脑基底神经节出血模型。这种方法操作过于繁琐，但避免了血液沿针道反流的问题，目前国内许多中药复方的药理研究均采用在此方法基础上改良的大鼠尾壳核双套管注血法。不同的实验室根据习惯采用的自体血的采血部位各不相同。Nath等［3］介绍了从大鼠一侧股动脉插管抽取新鲜未肝素化自体动脉血。李慧等［4］用微量注射器在一侧股动脉抽取50μl动脉血，注血后留针20min，以避免血液自针道反流。郭松韬和吴喜［5］从大鼠心室腔内抽取血液。刘胜达等［6］以大鼠尾末端血代替股动脉取血，在2.5min内完成注入，留针5min。从查阅的文献看取血部位除了上述部位还有内眦取血和舌下静脉取血等。每种方法均有优缺点，如内眦取血量较准确，但成功率低;断尾取血易造成混动静脉血混血，同时采血量不易控制;心脏穿刺取血具有时间短、不凝血和简便易行等优点，但技术要求高，穿刺定位须准确且不能反复穿刺。注血方式也在不断改进，吕田明等［7］向尾壳核内2次注射不凝固自体动脉血。夏鹰等［8］采用大鼠尾动脉插管抽取新鲜自体动脉血分3次注入尾壳核。该方法的优点是:出血量可人为控制，观察血液凝固过程中局部脑组织的循环异常及血管活性物质释放物的病理生理学作用［9］。该法形成的血肿形态与出血量没有直接关系，若注血速度过快，血液容易沿针道反流，因注射带来的压力过大易胀裂脑组织使血液流入脑室，造成血肿形态和大小的重复性较差。为了避免血液沿针道反流，吕田明和陆兵勋［10］提出采用凝固血进行造模。实验使用静脉留置针取血并待其凝固后，使用脑立体定位仪凝固的血液注入尾状核中。该模型血肿规则，占位情况明显，在血肿周围有水肿及血液循环障碍等形成。但造模过程中发现由于血液凝固后容易析出血清，血清会沿针道反流，给操作带来麻烦，所以在操作上要求快速注入(速度为20μl/min)。本实验室一直从事抗ICH中药复方的作用机制研究，结合文献方法，通过反复实践，采用鼠尾动脉取血，使用留置针分2次进行尾壳核注入的方法进行实验研究，结果表明模型动物的死亡率相对较低，成模率和重复性均较好。并且与ICH临床的发病过程类似性高，对药物作用的机制研究较合适。

2.2注入胶原酶法

胶原酶是一种能特异降解间质和基底膜胶原的蛋白分解酶。当脑内注入胶原酶20min后，脑血管基底膜上的胶原蛋白即被破坏，进一步损伤血脑屏障，引起血管渗血，约4h出血区融合成片，胶原酶注入量的决定多了出血区的大小。Rosenberg等［11］用微量注射泵在9min内向大鼠尾状核注入2μl含0.01～1.00U胶原酶(Ⅶ型)生理盐水，注入胶原酶10min后即可观察到血液渗出，在0.5U胶原酶组出血点周围水肿明显，且动物死亡率低，此方法比较适合ICH的长期实验研究。优点是其出血是弥漫性的广泛出血，血肿大小基本一致，该模型多具有典型的神经功能障碍，且运动功能的缺失长期存在。近年来，胶原酶诱导大鼠ICH模型在中医药研究中的应用主要集中在以下几个方面:观察脑含水量和病理生理学变化;中药保护神经元的作用机制;抑制血肿红细胞产物对脑细胞的损伤;促进神经再生，抑制炎症反应。因此该模型适用于观察神经功能缺失，血肿大小的改变及其与血肿消除机制有关的中医药实验研究。缺点是出血方式为无明显占位效应，渗血和血肿形成时间长，与临床ICH急性发病情况不同，不适合血肿相关的血液循环障碍研究。自体血注入和胶原酶注入大鼠脑尾状核建立ICH模型是目前中医药研究中使用最多的2种ICH模型。邓世山等［12］通过制备自体血注入模型观察桅子提取物(环烯醚萜总甙)对大鼠ICH病灶的局部作用，表明该药通过减轻病灶血肿大小、降低小胶质细胞的浸润及局部炎症反应等改善出血引起的损伤作用。夏荣蓉等［13］同样采用自体血注入模型观察镇肝熄风汤对大鼠低氧诱导子-1α(HIF-1α)的影响，结果镇肝熄风汤组可提高脑组织HIF-1α阳性表达，拮抗脑细胞缺氧，从而减轻ICH急性损伤。魏微和张微微［14］利用胶原酶模型观察β-七叶皂普钠对大鼠ICH后脑含水量及脑组织超微结构变化，揭示药物对神经元及内皮细胞肿胀的拮抗作用。陈旭等［15］则指出β-七叶皂普钠抗脑水肿的作用可能与脑内精氨酸加压素参与有关。何泽云等［16］观察参麦注射液对大鼠ICH后迟发性神经细胞损伤的保护作用，发现该药可减少ICH后海马CA1区锥体细胞凋亡数目，抑制血肿周围脑组织线粒体DN段的缺失。梁清华等［17］采用胶原酶法模型观察镇肝熄风汤可维持大鼠海马细胞色素氧化酶(CCO)活性与锥体细胞的密度，减少丢失。肖岚等［18］利用胶原酶模型探讨脑溢安(丹皮、生地和地龙等)对ICH的保护作用，结果显示脑溢安通过抑制P38MAKP信号转导通路的激活，阻止细胞凋亡的发生从而发挥抗ICH作用。

2.3自发性脑出血模型

分原发与继发2种，原发为自发性高血压大鼠(spontaneoushypertensivecerebralhemorrhageinrat，SHCHR)，这种模型ICH率高，能重现人类自发性ICH发病过程，因存在遗传局限性，存续困难，价格较高。继发模型为肾血管性高血压大鼠(renovascularhypertensiverats，RHR)，这种模型易于建立，无遗传缺陷，且有与人类ICH相似的高血压动脉硬化病理生理学基础。但其自发性ICH的发生率较低，并且出血量及出血区域不易控制。Wu等［19］试图通过将改变遗传基因的方式和自体血注入法结合的方法改进模型，制备与人类ICH更为相似的病理变化模型，但研究发现这种结合并不能使血肿和周围水肿带扩大。Wakisaka等［20］试图用药物制备ICH模型，给C57BL/6小鼠输注人AngII和一氧化氮合酶抑制剂诱导产生慢性高血压，再通过注射AngII进而产生急性高血压，从而发生高血压ICH，也并未明显提高发病率。此外研究人员也在积极探索基因工程实验动物模型，如基因敲除小鼠对ICH发病机制方面的研究更具优势。由于自发性ICH动物模型在ICH的部位和出血量方面都还不易控制，治疗的标准和规范的测量方法也需要同步跟进，都限制了模型的广泛使用。但由于其更接近自然ICH发生发展过程，如能克服上述缺点，自发性ICH模型应该是最理想的ICH模型。

2.4微球囊充胀法

主要用来模拟ICH的占位效应。Sinar等［21］将微球囊插入SD大鼠头部右侧尾状核，通过调节球囊内液体量模拟不同血肿大小，用于研究ICH血肿的占位效应和血肿后神经行为学的改变。LopezValde等［22］在Sinar等［21］基础上采用微球囊充气和放气的方法模拟血肿形成和清除的过程，研究外科血肿清除术的最佳治疗时机及临床疗效。由于只能模拟ICH后占位病变引起的的各种病理生理改变，对炎症等引起的血管活性物质释放、缺氧及氧化应激等没有考虑，不适合中药作用机理的研究，因此在中医药研究中已较很少使用该方法了。

3ICH动物模型在中医药研究中急需解决的问题

中医学认为ICH的病理病机是脏腑功能失调，气血逆乱，导致脑脉受损，血溢脉外。而离经之血形成癖血，癖血不去、阻碍新血生化之机。近年来学者对中医药治疗ICH作了大量研究，研究范围涉及治则、治法、证候及疗效评价体系等［23-25］。“病证结合”是目前中医临床诊疗的特点，也是中药新药研究的要求，更是中西医结合的切入点;但是在中医药动物模型的建立上，病证结合模型的建立却很难。借用西医学“病”的模型，很难体现中医辨证论治的特色;单纯从中医“证”的角度入手，同属一证的不同病的多种病理变化，同一动物模型难以全面体现。因此研制病证结合模型是研究中医药ICH作用机制比较可行的方法，建立以病统证、病证合参的动物模型是实用而可取的。近年来也有研究人员在不断的尝试从病证结合角度探索大鼠ICH动物模型的研制，如用脑内注射胶原酶配合大鼠自体粪便灌胃的方法复制中风病痰热腑实证大鼠模型，并用通过对通腑醒神胶囊对中风病痰热腑实证大鼠的治疗作用改善模型大鼠神经缺损体征和痰热腑实证症状及降低脑组织含水量，从而反证了该病证结合模型的可行性［26］。也有人用中药灌肠的办法治疗ICH后水肿［27-28］。但是目前有关病证结合ICH模型方面的文献报道很少。但中医药在ICH治疗中的作用还是不容忽视的，实验表明中医、针灸能有效改善ICH后半暗带血流，抑制半暗带区的神经细胞凋亡，促进神经功能恢复。实验表明补阳还五汤能够有效抑制大鼠ICH后AQP4蛋白的表达，减轻脑水肿，对ICH后脑组织发挥保护作用［29］。刘海洋等［30］研究表明丹参注射液对大鼠ICH灶周围神经元的凋亡具有较好的抑制作用;同时黄芪联合丹参注射液对大鼠ICH半暗带区神经元凋亡也具有较好的抑制作用。

4展望

综上所述，对于探索适合中医药研究的ICH动物模型，即病证结合模型，为ICH动物模型在中医药研究提供了一条很好的思路，即在现代医学动物模型所造成的“病”的基础上，从本病多种致病因素之间相互转化的角度入手，建立“证”的模型，并从血肿的大小、神经体征的缺失评分及中医所特有的舌象、脉象等角度进行评价，进而设计一种符合中医临床的ICH动物模型。不断改进动物造模方法使其更接近临床病理生理过程，还要解决如何使其造模方法标准化的问题，才能获得更广泛的认可，才能有效解决ICH从实验研究到临床应用的转化，才是未来研究的关键。

作者：刘智 袁楠 兰天野 宋伍 姜爽 郭焱 王健 单位：长春中医药大学 长春中医药大学附属医院